Tierärztliche Hochschule Hannover
Intravaskuläre Evaluierung
biodegradierbarer Implantatwerkstoffe im Tiermodell am Beispiel Eisen
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Sylvia Arnold
aus Bad Oeynhausen
Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. Matthias Peuster,
Herzzentrum Bad Oeynhausen Prof. Dr. Peter Paul Müller,
Helmholtz-Zentrum Braunschweig
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg, Klinik für kleine Haustiere,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Baumgärtner, Institut für Pathologie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2012
Diese Dissertation ist im Rahmen des von der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) geförderten Sonderforschungsbereiches 599 im Teilprojekt R3
Für Rosa und Oskar
In memoriam
Helmut Halter (1926-2006) Luise Arnold (1917-2010)
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VIII
1 Einleitung 13
2 Literaturübersicht 16
2.1. Kardiovaskuläre Implantate...16
2.2. Komplikationen bei kardiovaskulären Implantaten...17
2.2.1. Nichtresorbierbare Materialien...20
2.2.2. Resorbierbare Materialien...24
2.3. Prüfung von resorbierbaren Implantatwerkstoffen für kardiovaskuläre Implantate....30
2.4. Tiermodelle für die Testung kardiovaskulärer Implantate...37
2.5. Eisen im Organismus...43
2.6. Genexpressionsanalysen mit Mikroarraytechnik...47
3 Eigene Untersuchungen 55 3.1. Versuchstiere und Tierhaltung...55
3.2. Material...56
3.2.1. Implantatmaterialien...56
3.2.2. Medikamente, Verbrauchsmaterialien und Geräte...57
3.3. Methoden...60
3.3.1. Versuchsgruppen...60
3.3.2. Implantation und postoperativer Beobachtungszeitraum...63
3.3.3. Histologische Untersuchung...65
3.3.3.1. Probenaufbereitung...65
3.3.3.1.1 Herstellung der Paraffinschnitte...65
3.3.3.1.2 Herstellung der Trenndünnschliffe nach Donath...67
3.3.3.2. Histologische Färbung der Paraffinschnitte...68
3.3.3.2.1 Hämatoxylin-Eosin...68
3.3.3.2.2 Preußischblau...68
3.3.3.3. Histologische Färbung der Trenndünnschliffe nach Richardson...69
3.3.3.4. Immunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen Aktin der glatten Muskulatur...69
3.3.4. Molekularbiologische Untersuchung...71
3.3.4.1. RNA-Isolierung...71
3.3.4.2. cDNA-Synthese durch reverse Transkription...72
3.3.4.3. In-vitro-Transkription...73
3.3.4.4. cDNA-Synthese 2. Runde...74
3.3.4.5. In-vitro-Transkription 2. Runde...74
3.4. Auswertung...78
3.4.1. Implantation und postoperativer Beobachtungszeitraum...78
3.4.2. Histologie...79
3.4.2.1. Verhältnis Kontrollgefäß zu Foliendurchmesser...80
3.4.2.2. Messung der Eisenfläche...82
3.4.2.3. Messung des Abstandes der weitesten Eisenpartikel vom Implantatmittelpunkt...84
3.4.2.4. Messung der Entzündungsfläche...85
3.4.2.5. Messung der Entzündungszellschichten...87
3.4.2.6. Auszählung der Aktin-positiven Gefäße...88
3.4.2.7. Auswertung der Trenndünnschliffe...89
3.4.3. Genexpressionsanalysen...89
3.4.3.1. Qualitätskontrolle der Genchips...89
3.4.3.2. Auswertung der Rohdaten...90
3.4.3.3. Auswahlkriterien für differentiell regulierte Gene...91
3.4.3.4. Hierarchische Clusteranalyse...91
3.4.3.5. Einordnung der Gene in funktionelle Gruppen...92
3.4.4. µ-computertomographische Auswertung...93
3.4.5. Statistische Auswertung...94
4 Ergebnisse 95 4.1. Implantation und postoperativer Beobachtungszeitraum...95
4.2. Histologische Untersuchungen...95
4.2.1. Histologische Untersuchung der Mausschwanzpräparate mit Eisenfolien...95
4.2.2. Histologische Untersuchung der Organpräparate...100
4.3. Histomorphometrische Ergebnisse...105
4.3.1. Verhältnis Kontrollgefäß zu Foliendurchmesser...105
4.3.2. Eisenverteilung...106
4.3.2.1. Gesamtfläche...106
4.3.2.2. Abstand der weitesten Eisenpartikel vom Mittelpunkt des Implantates....110
4.3.3. Inflammation...111
4.3.3.1. Gesamtfläche...111
4.3.3.2. Zellschichten...112
4.3.4. Immmunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen Aktin der glatten Muskulatur...113
4.4. Genexpressionsanalysen...116
4.4.1. Qualitätskontrolle der Genchips...116
4.4.2. Hierarchische Clusteranalyse...117
4.4.3. Einordnung der Gene in funktionelle Gruppen...118
4.4.4. Gene des Eisenstoffwechsels...126
4.5. µ-Computertomographie...130
5.2. Verhältnis des Implantatdurchmessers zum nativen Gefäß...141
5.2.1. Entzündung...142
5.2.2. Eisenverteilung...145
5.3. Immunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen Aktin der glatten Muskulatur...147
5.4. Histologische Untersuchung der Organe...148
5.5. Computertomographische Untersuchungen...149
5.6. Genexpressionsstudien...151
5.6.1. Übereinstimmung in der Regulierung einzelner Gene mit anderen Studien zur Eisenüberladung und Implantation von Eisenstents...154
5.6.2. Gene des Eisenstoffwechsels...158
5.7. Maus als Modell...160
5.8. Ausblick und Limitationen...162
6 Zusammenfassung 163
7 Summary 165
8 Literaturverzeichnis 167
9 Anhang 212
10 Danksagung 270
% Prozent
°C Grad Celsius
< kleiner als
> größer als
√ Wurzel
≥ größer gleich
A Fläche
A. dest Aqua destillata
Abb. Abbildung
atm Atmosphäre
bzw. beziehungsweise
C Kohlenstoff
ca. circa
cDNA copy desoxyribonucleic acid
Cr Chrom
cRNA copy ribonucleic acid
CT Computertomograph
d Durchmesser
d. h. das heißt
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EASE-score Expression-Analysis-Systematic-Explorer-score
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
et al. et alii
Fe3+ dreiwertiges Eisen
g Erdbeschleunigung
g Gramm
GO Gene Ontology
GPa Gigapascal
h Stunde
HCl Chlorwasserstoff
ID Identifikator
ISR In-Stent-Restenose
IVT in vitro transcription
Kap. Kapitel
kg Kilogramm
kV Kilovolt
M Mol
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
mg milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimol
Mn Mangan
Mo Molybdän
MRI magnetic resonance imaging
mRNA messenger ribonucleic acid
ng Nanogramm
Ni Nickel
nm Nanometer
nM Nanomol
Nr. Nummer
p Wahrscheinlichkeit
P Phosphor
PET Polyethylenterephtalat
PETP Polyethylenterephtalatpolyester
ppm parts per million
r Radius
RNA ribonucleic acid
S Schwefel
SAPE Streptavidin-Phycoerythrin
SD Standarddeviation
Si Silizium
T7200 Technovit 7200
Tab. Tabelle
TE TRIS und EDTA
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Units
u. und
u.a. unter anderem
Vol. Volumen
x mal
z. B. zum Beispiel
µ-CT Mikrocomputertomograph
µA Mikroampere
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
π Pi
Im Rahmen dieser Dissertation entstandene Veröffentlichungen:
P. P. Mueller, S. Arnold, M. Badar, D. Bormann, F.-W. Bach, A. Drynda, A. Meyer- Lindenberg, H. Hauser, M. Peuster:
Histological and molecular evaluation of iron as degradable medical implant material in a murine animal model.
J. Biomed. Mater. Res. Part A, akzeptiert im April 2012
EINLEITUNG
1 Einleitung
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind der häufigste Grund für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt (VON DER LOHE 2002; TOUCHARD u. SCHWARTZ 2006).
Es gibt unterschiedliche kardiovaskuläre Implantate für eine Vielzahl von Anwendungen (HARPER et al. 2002; ANIL et al. 2003; SIGLER et al. 2005).
Gefäßimplantate wie Stents werden zur Korrektur von Einengungen oder Verschlüssen von Gefäßen eingesetzt (OKUBO u. BENSON 2001; HENRY et al.
2007), Occluder zum Verschluss größerer Defekte in der Herzscheidewand und Coils zum Verschluss unerwünschter kleinlumiger Gefäße.
Stents bestehen meist aus medizinischem Edelstahl 316L (SHIH et al. 2006;
ARSLAN et al. 2008), aber auch aus Nitinol oder Kobalt-Chrom-Legierungen (BEYAR et al. 1994; LEGRAND et al. 2006). Nach der Implantation von Stents kommt es vor allem in den ersten sechs Monaten durch Entzündung und Proliferation von Neointima zu In-Stent-Restenosen, d. h. zu Wiederverschlüssen der behandelten Gefäße im Bereich der Implantate (SERRUYS et al. 1994; STETTLER et al. 2007).
Um diese Komplikationen zu umgehen, wurden sogenannte drug-eluting Stents entwickelt, die mit einem antiproliferativen Medikament beschichtet sind, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Verschlusses weiter gesenkt werden konnte (SOUSA et al. 2001; MORICE et al. 2002; STONE et al. 2004). Allerdings wurden nach Implantation dieser Stents späte Thrombosen und Hypersensibilitätsreaktionen, die bis zu mehreren Jahren nach der Operation auftraten, beobachtet (VIRMANI et al. 2004; FINN et al. 2007; JONER et al. 2006; COOK et al. 2007).
Werden nichtresorbierbare Stents bei Kindern implantiert, kann es zu einem relativen Verschluss des Gefäßes kommen, da der Durchmesser des Stents gleich bleibt, während der Durchmesser des wachsenden Gefäßes zunimmt (PEUSTER et al.
2006a, b).
Eine bei In-Stent-Restenose oftmals erneut notwendige Applikation weiterer Stents wird durch bereits vorhandene Implantate behindert (COLOMBO u. KARVOUNI 2000; WAKSMAN 2006). Aus diesen Gründen gibt es bereits Ansätze zur Entwicklung neuer Materialien, die sich nach gewisser Zeit auflösen bzw. vom Organismus abgebaut werden (VAN DER GIESSON et al. 1996; PEUSTER et al.
2001a; HEUBLEIN et al. 2003; SCHINHAMMER et al. 2010). Dazu gehören Polymere, die jedoch starke Entzündungsreaktionen hervorrufen können (VAN DER GIESSON et al. 1996), ebenso wie Magnesiumlegierungen, die sich durch eine zu schnelle Degradation unter Wasserstoffbildung auszeichnen (HEUBLEIN et al. 2003) und deren mechanische Eigenschaften wie Festigkeit und Dehnbarkeit für Stentimplantationen bisher nicht zufriedenstellend sind (SCHINHAMMER et al.
2010).
Als ein vielversprechendes degradierbares Material gilt Reineisen, das gute mechanische Eigenschaften besitzt und eine langsame Degradation zeigt (PEUSTER et al. 2006a, b; HERMAWAN et al. 2007b). Erste Versuche erfolgten bereits mit der Implantation von Reineisenstents in die Aorten von Kaninchen (PEUSTER et al. 2001a) und Schweinen (PEUSTER et al. 2006b). Eine komplette Degradation, wie sie für einen resorbierbaren Stent wünschenswert wäre, konnte jedoch bisher nicht gezeigt werden. Um die Biokompatibilität eines Materials, also die Verträglichkeit und das Verhalten auf ein Gewebe, in einem frühen Stadium der Entwicklung eines Implantates zu testen, bieten molekularbiologische Untersuchungen mittels Genarrays eine tiefe Einsicht in die Implantat-Gewebe- Interaktionen (KLAPPERICH u. BERTOZZI 2004; GALLAGHER et al. 2006).
Die lokale Genexpression einzelner Gene nach Implantation von Edelstahl-316L- Stents wurde bereits beim Schwein (PEUSTER et al. 2004) untersucht. Diese Untersuchungen waren allerdings nur bedingt aussagekräftig, da ein Genarray, der das gesamte Genom untersucht, für das Schwein zu diesem Zeitpunkt nicht kommerziell erhältlich war. Das Schwein ist wegen seiner Ähnlichkeit zur humanen
EINLEITUNG
Anatomie prinzipiell für Biokompatibilitätsuntersuchungen von kardiovaskulären Implantaten gut geeignet (SCHWARTZ et al. 2004), eine Evaluierung in diesem Modell erfordert allerdings eine aufwendige Herstellung und eine komplizierte Operation zur Implantation der Stents (SCHWARTZ et al. 2004). Neuere Erfolge in der Erforschung von neuen Implantatmaterialien im Einsatz gegen die Restenose haben die Forschung an kardiovaskulären Implantaten vervielfacht (POST u.
WALTENBERGER 2007). Nicht zuletzt eine neue in vitro Studie, in der vier verschiedene neue Eisenlegierungen an Zellkulturen getestet wurden, die sich potentiell als Stentmaterial eignen würden (LIU u. ZHENG 2011), zeigt den Bedarf an einem neuen, einfachen präklinischen in vivo Modell zur intravaskulären Evaluierung resorbierbarer Implantate.
Da sich Eisen in Zellkultur und im Großtiermodell bereits als viel versprechendes Material gezeigt hat (PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006b; LIU u. ZHENG 2011), sollte in der vorliegenden Arbeit die Verträglichkeit und die Degradation von Eisenimplantaten histologisch, µ-computertomographisch und molekularbiologisch untersucht werden. Dafür sollte ein einfaches, kosteneffektives und aussagekräftiges Tiermodell entwickelt werden, das eine intravaskuläre Untersuchung der Biokompatibilität und des Degradationsverhalten eines resorbierbaren kardiovaskulären Implantates erlaubt.
2 Literaturübersicht
2.1. Kardiovaskuläre Implantate
Die am häufigsten verwendeten Implantate für den Einsatz in das Gefäßsystem des Menschen sind Stents, Coils und Okkluder. Stents werden bei Stenosierung oder drohender Stenosierung im Bereich der Koronararterien, Aorta, Halsschlagadern (HENRY et al. 2007), Iliacal-, Renal- (RAMMER et al. 2007) und Femoralarterien (OKUBO u. BENSON 2001) eingesetzt. Aber auch beim Verschluss anderer Hohlorgane wie Gallengängen (RAJESH u. NAGESHWAR 2006), Trachea und Bronchien (BOLLIGER et al. 2006), Urethra (TAMMELA u. TALJA 2003), Pankreas (BUSCAGLIA u. KALLOO 2007), Colon (DAUPHINE et al. 2002) und Oesophagus (LEE 2001) können Stents verwendet werden. Die koronare Herzkrankheit, eine Erkrankung, bei der durch Arteriosklerose der Koronararterien eine Minderdurchblutung und damit eine Schädigung des Herzmuskels erfolgt, ist dabei eine häufige Indikation zur Implantation von Stents (LIM 2004).
In den 80er Jahren wurde die koronare Herzkrankheit zumeist noch mit dem von GRÜNTZIG et al. (1978) entwickelten Verfahren der perkutanen transluminalen Angioplastie (PCTA) behandelt, bei dem die arteriosklerotischen Gefäße durch das Aufblasen eines Ballonkatheters therapiert wurden. Dieses Verfahren wurde jedoch bald durch die Implantation von Metallstents ergänzt, was die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von thrombotischen Veränderungen und Gefäßwandverletzungen deutlich reduzieren konnte (SCHATZ 1994; SERRUYS et al. 1994). Dabei haben Stents die Aufgabe, erkrankte Gefäße zu stützen und vor einer Restenose zu schützen (COLOMBO u. KARVOUNI 2000).
Implantationen von Coils und Microcoils dienen dem Verschluss arterieller oder venöser Shunts bei kleinem und sehr kleinem Gefäßdurchmesser, z. B. bei persistierendem Ductus arteriosus (ATIQ et al. 2007), aortopulmonalen
LITERATURÜBERSICHT
Kollateralarterien (SHARMA et al. 1995), Koronararterienfisteln (QURESHI 2006) oder Aneurysmen (SCHMALTZ et al. 1999).
Occluder sind Implantate für den perkutanen transvenösen Verschluss von atrialen oder ventrikulären Septumdefekten von über 4 cm (HARPER et al. 2002).
2.2. Komplikationen bei kardiovaskulären Implantaten
Bei der Implantation resorbierbarer und nichtresorbierbarer Stents auftretende Komplikationen sind vor allem Biokompatibilitätsprobleme wie Thrombosebildung im behandelten Gefäß oder In-Stent-Restenose (ISR), der Wiederverschluss des Gefäßes um mehr als 50 % im Bereich des implantierten Stents (WELT u.
RODGERS 2002; PENDYALA et al. 2008). Die Thrombosierung des behandelten Gefäßes wird meist durch die prophylaktische Gabe von Aggregationshemmern wie Ticolidin, Clopidogrel, Glykoprotein-(GP)-IIb/IIIa-Plättchenrezeptorantagonisten oder Acetylsalicylsäure verhindert (VACLAVIK u. TABORSKY 2011). Bei 10–60 % aller behandelten Gefäße kommt es zur In-Stent-Restenose, die durch Entzündung und Neointimabildung hervorgerufen wird (SERRUYS et al. 1994; FISCHMAN et al. 1994;
MOLITERNO 2005). Neointimabildung wird durch Proliferation von glatten Muskelzellen und Bildung einer extrazellulären Proteoglykanmatrix ausgelöst (VIRMANI u. FARB 1999). Außerdem sind am Prozess der ISR akute Entzündungszellen und -mediatoren, eine Vielzahl an Wachstumfaktoren, Chemotaxinen und freie Radikale beteiligt (VIRMANI u. FARB 1999; HOFFMANN u.
MINTZ 2000). Von späten Restenosen vier bis sieben Jahre nach koronarer Stentimplantation berichteten KIMURA et al. (2002) und INOUE et al. (2004) nach Implantation von Edelstahl-316L-Stents. Dabei wurde eine starke Infiltration Lipid- beladener Makrophagen im Bereich der Stentstreben beobachtet, was auf eine chronische Inflammation hindeutet, die wiederum eine späte Ausbildung
atherosklerotischer Plaques induzieren könnte.
Zur Behebung der ISR kann eine Ballondilatation durchgeführt werden (MEHRAN et al. 1996). Mit dieser kann aber meist nicht mehr der Gefäßdurchmesser der primären Intervention erreicht werden, da das restenotische Gewebe nicht entfernt, sondern nur nach außen hin verdrängt werden kann (MEHRAN et al. 1996). Auch bei einer Stentimplantation in einem bereits gestenteten Gefäßabschnitt („stent in stent“) wird häufig nicht der Gefäßdurchmesser der ersten Behandlung erzielt und das Risiko einer erneuten Restenose ist somit erhöht (ALFONSO et al. 2003).
Eine Verbesserung der In-Stent-Restenoserate wurde durch die Entwicklung sogenannter drug-eluting Stents erreicht, bei denen ein Stentgerüst aus Polymer oder Metall mit einem antiproliferativen Wirkstoff, wie z. B. Sirolimus oder Paclitaxel, beschichtet wird (SOUSA et al. 2001; MORICE et al. 2002; STONE et al. 2004). Mit diesen Stents kann es jedoch wiederum zur Entwicklung später Stent-Thrombosen kommen, weil antiproliferative Medikamente eine Reendothelialisierung verhindern (VIRMANI et al. 2004; FINN et al. 2007; COOK et al. 2007).
Weitere Biokompatibilitätsprobleme bei nichtresorbierbaren Stents können mechanischer Art sein. So kommt es vor allem bei Implantationen in den oberflächlichen Femoral- und Poplitealarterien in 2–65 % aller Fälle zu Stentfrakturen (SCHEINERT et al. 2005; RITS et al. 2008), aber auch bei 1–8 % aller drug-eluting Stents in Koronararterien (AOKI et al. 2007; CANAN u. LEE 2010). Eine biologische Ursache für Komplikationen ist z. B. die fehlende Adaptation eines nichtresorbierbaren Stents an das Wachstum von Kindern. So kommt es im Verlauf des Wachstums zu einem relativen Verschluss oder zur Einengung des behandelten Gefäßes (PEUSTER et al. 2001a). Auch Probleme chemischer Art wie Korrosionen (RYAN et al. 2002; HALWANI et al. 2010) können auftreten. Es konnte bereits öfter gezeigt werden, dass sich Eisenionen aus der häufig für kardiovaskuläre Implantate verwendeten Edelstahl-Legierung 316L durch Korrosion lösen (FERGUSON et al.
1962; WINTER 1974; TOMIZAWA et al. 2006).
LITERATURÜBERSICHT
Während Korrosion oder Depolymerisation bei nichtresorbierbaren Implantaten als Komplikationen angesehen werden, sind diese Vorgänge bei resorbierbaren Stents erwünscht. Bei diesen können sich jedoch lokale oder systemische Probleme mit der Reaktion des Körpers auf die Abbauprodukte ergeben (VAN DER GIESSEN et al.
1996). Der Abbau des Stents kann zu langsam (PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006a, b) oder zu schnell erfolgen, was Probleme mit der mechanischen Integrität ergeben könnte (SCHRANZ et al. 2006; MCMAHON et al. 2007). Die Zeitspanne, die für die Unterstützung einer behandelten Arterie benötigt wird, ist unbekannt, liegt aber wahrscheinlich zwischen einigen Wochen und sechs Monaten (ORNISTON u. WEBSTER 2007). Für einen biodegradierbaren Stent wird daher ein Material gefordert, das seine strukturelle Integrität für sechs bis zwölf Monate behält und innerhalb von 12 bis 24 Monaten komplett degradiert (SERRUYS et al. 2006;
HERMAWAN et al. 2010).
Aber auch der Einsatz anderer kardiovaskulärer Implantate kann Komplikationen verursachen. Okkluderimplantation kann in unvollständigem Verschluss, Embolusbildung, Frakturierung oder kardialer Perforation resultieren (HARPER et al.
2002). BAURIEDEL et al. (2006) untersuchten einen Amplatzer-Okkluder 15 Monate nach Implantation in einen atrialen Septumdefekt. Es zeigten sich eine partielle Endothelialisierung und Lochkorrosion des Implantates, sowie Entzündung und Granulation des umgebenden Gewebes, wodurch es zu einer kleinen residualen interatrialen Shuntbildung gekommen war.
Bei der Implantation von Coils sind eine Embolisation in der Peripherie (ARAKI et al.
2003; TAN et al. 2005), akute Gefäßperforation (MANABE et al. 1998; HAYES et al.
2002) und das Auftreten von Thrombembolien und Hämolyse (UZUN et al. 1999;
ANIL et al. 2003) möglich. Es kann auch zur unvollständigen Okklusion oder zur Rekanalisierung des Aneurysmas nach Verschluss kommen (INO et al. 1998; UZUN et al. 1998; KURRE u. BERKEFELD 2008).
2.2.1. Nichtresorbierbare Materialien
Das derzeit am häufigsten verwendete Material für Implantate im Herz- Kreislaufsystem ist medizinischer Edelstahl 316L (SHIH et al. 2006; ARSLAN et al.
2008), eine Legierung aus verschiedenen Elementen (Tab. 1). Edelstahl ist kostengünstig, sehr korrosionsbeständig und besitzt gute mechanische Eigenschaften wie eine hohe Stärke und Härte. Es ist die am häufigsten für Stents eingesetzte Legierung in der Kardiologie (SHIH et al. 2006), z. B. für den Cordis- Palmaz-Schatz-Stent, den Cordis-Crossflex-Stent, den Guidant-Multi-Link-Stent und den Medtronic BeStent (LIM 2004).
Tabelle 1: Chemische Zusammensetzung von Edelstahl 316L. Angabe der Gewichtsanteile in %. (Quelle: www.biomaterialienkatalog.de)
Fe Cr Ni Mo Mn Si P S C N
AISI 316L
60,0–
65,0
16,5–
18,5
10,0–
13,0
2,0 – 3,5 2,0 1,0 0,045 0,015 0,03 0,11
Die Stabilität von Edelstahl ist abhängig von dessen Passivschicht. Diese kann durch Anwesenheit von Chloridionen aus Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, verletzt werden und damit zur ungewollten Degradation und Freisetzung von Ionen in das umgebende Gewebe führen. Diese Reaktion kann dort schwere Entzündungen hervorrufen (SHIH et al. 2006). Kontaktallergien und entzündliche Überempfindlichkeit auf Chrom, Nickel oder Molybdän wurden im Rahmen von Stentimplantationen beschrieben und werden als Ursache für In-Stent-Restenose diskutiert (KÖSTER et al. 2000), obwohl dies durch jüngere Studien nicht bestätigt werden konnte (THYSSEN et al. 2011). Die Zytotoxizität von Nickelionen aus Edelstahl auf vaskuläre glatte Muskelzellen konnte in Zellkulturexperimenten nachgewiesen werden (SHIH et al. 2001). Edelstahl 316L ist wegen seines hohen
LITERATURÜBERSICHT
Eisenanteils und seiner geringen Dichte nicht MRI-kompatibel (MANI et al. 2007).
Eine andere Legierung, die häufig für die Herstellung von Stents zur Anwendung in den peripheren Gefäßen eingesetzt wird, ist Nitinol (Boston´s scientific RADIUS- Stent) (IIDA et al. 2011). Es besteht je nach Legierung jeweils etwa zur einen Hälfte aus Nickel und zur anderen Hälfte aus Titan. Es besitzt gute mechanische Eigenschaften, eine hohe Elastizität und gute Dämpfungseigenschaften (HEINTZ et al. 2001). Auch wegen seines thermalen Formengedächtnisses ist es eines der meist verwendeten Materialien für selbstexpandierbare Stents (SHIH et al. 2000).
Allerdings ist es schwierig herzustellen, da bereits wenig mehr als 1 % Veränderung in der Zusammensetzung der Legierung die Transformationstemperatur drastisch verändern kann (LIM 2004). Als weitere Nachteile werden, wie auch bei Edelstahl, die austretenden Ionen diskutiert, die als Ursache für In-Stent-Restenose gelten (KÖSTER et al. 2000). Dabei sind Nickelionen potentiell karzinogen und allergen, wobei etwa 16 % der Weltbevölkerung allergisch auf Nickel reagieren (PRYSTOWSKY et al. 1979; PELTONEN 1981; MCLUKAS et al. 2008). Es wurde in einigen Fällen von einer Ausschwemmung von Nickelionen, ausgehend von Nitinol- Implantaten in das Vorhofseptum (RIES et al. 2003) und die Aorta abdominalis (HEINTZ et al. 2001) berichtet, ebenso wie von der In-vivo-Korrosion eines Amplatzer-Okkluders in Kontakt mit einem Platin-Schrittmacher (KONG et al. 2002).
Des Weiteren zeigten in vitro korrodierte und als Zellkulturmedium aufbereitete Nitinol-Drähte einen zytotoxischen Effekt auf glatte Muskelzellen aus der Aorta von Ratten (SHIH et al. 2000).
Auch Kobalt-Chrom-Legierungen sind ein häufig verwendetes Material zur Herstellung von Stents, z. B. dem Multi-Link-Stent oder dem Cinatra-Stent aus Kobalt-Chrom L605 (NEF et al. 2009). Neben Kobalt und Chrom bestehen die Legierungen außerdem aus Mangan, Wolfram, Nickel und Phosphor. Sie besitzen
eine hohe Festigkeit, Flexibilität und eine gute Korrosionsbeständigkeit (FISCHER u.
BRAUER 2001). Kobalt-Chrom-Legierungen sind MRI-kompatibel und weisen eine röntgenologische Sichtbarkeit auf, die wichtig für die Darstellung von Implantaten in der Fluoroskopie ist. Wegen der guten Elastizitätswerte ist die Herstellung sehr dünner Stentstreben möglich, was den Herstellungsprozess von Implantaten vereinfacht (MANI et al. 2007). Sie werden häufig für selbstexpandierende Stents verwendet (LEGRAND et al. 2006). Hohe Konzentrationen (15–30 ppm) sowohl von Nickel als auch von Kobalt können jedoch morphologische Veränderungen und die Unterdrückung von Fibroblasten in der Zellkultur hervorrufen (BEARDEN u. COOKE 1980). Bestimmte Komponenten von Chrom sind potente Auslöser von Lungenkarzinomen (SORAHAN et al. 1998), Kontaktdermatitis (HANSEN et al. 2002) und Schleimhautgeschwüren (LEE u. GOH 1988).
Tantal ist ein weiteres Material, aus dem Stents hergestellt werden, wie der Wiktor- Stent oder der Tantalum Cordis Stent zur intrakoronaren Anwendung (LIM 2004). Bei Tantal handelt es sich um flexibles und hochgradig röntgendichtes Metall. Die Vorteile dieses Metalls bestehen in seiner guten Korrosionsbeständigkeit und Biokompatibilität, ebenso wie in der Darstellbarkeit in der Fluoroskopie (LIM 2004).
Es besitzt aber eine eher schlechte Festigkeit und kann daher mit nur wenig Druck implantiert werden (RIEU et al. 1999). Dieser Umstand führt häufiger zum Recoil, dem erneuten Zusammenziehen des Stents, als dies bei Implantaten aus Edelstahl 316L der Fall ist (YOROZUYA et al. 2002). Ein weiterer Nachteil ist die teure Herstellung von Tantal (MANI et al. 2007). Der kommerziell erhältliche Wiktor-Stent aus Tantal zeigte außerdem eine starke Artefaktbildung bei in vitro multislice-CT- Angiographie-Untersuchungen im Vergleich zu herkömmlicher Angiographie (MAINTZ et al. 2003).
Platin-Iridium-Stents (CP-Stents) werden zur Implantation bei Pulmonalarterien- und
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Aortenstenose eingesetzt. Sie bestehen zu ca. 90 % aus Platin und 10 % Iridium. Sie sind röntgendicht (HIJAZI et al. 1995) und sehr biokompatibel, d. h. sie besitzen eine niedrige Tendenz zur Entzündungsantwort und damit zur Neointimabildung und Thrombusformation (BHARGAVA et al. 2000). Platin-Iridium besitzt eine gute Korrosionsresistenz, aber schlechte mechanische Eigenschaften (RIEU et al.1999).
Bei Implantation von Stents in Koronararterien von Schweinen konnte eine Reduktion von Thrombose- und Neointimabildung beobachtet werden. Dafür waren aber höhere Recoilraten von 16 % zu verzeichnen, während die von Edelstahl-316L-Stents im selben Versuch bei nur 5 % lagen (BHARGAVA et al. 2000; MANI et al. 2007).
Wolfram wurde zeitweise für die Herstellung von Coils verwendet. Diese wurden jedoch später vom Markt genommen, weil man feststellte, dass massive Korrosion zu Implantatversagen führte (PEUSTER et al. 2001b). Dabei wurden erhöhte Wolframspiegel im Blut festgestellt, die allerdings zu keinen ausgeprägten klinischen Symptomen führten (PEUSTER et al. 2003).
Polymere Kunststoffe werden für Implantate im Herz-Kreislaufsystem entweder als Beschichtung von Metallstents oder als reine Polymerimplantate verwendet. Die ersten selbstexpandierenden, nichtdegradablen, auf Polyethylenterephtalat-(PET)- Basis hergestellten Polymerstents erzeugten allerdings starke Entzündungserscheinungen und starke neointimale Proliferation, was zum Verschluss der behandelten Gefäße führte (MURPHY et al. 1992). Ähnliche Ergebnisse erzielten VAN DER GIESSEN et al. (1996) mit beschichteten Stents aus Polyurethan, Silikon und Polyethylenterephtalatpolyester (PETP) die in Schweinekoronararterien implantiert wurden. In derselben Studie wurde auch die Biokompatibilität von resorbierbaren Stent-Beschichtungen aus Polyglykolsäure/Polylaktidsäure, Polyorthoester, Polycaprolacton, Polyhydroxybutyratvalerat und Polyethylenoxid/Polybutylenterephtalat untersucht.
Diese Materialien zeigten alle eine ausgeprägte inflammatorische Reaktion auf das behandelte Gefäßgewebe. Daneben wurden Aneurysmenbildung und Gefäßnekrosen beobachtet (VAN DER GIESSEN et al. 1996; VENKATRAMAN et al.
2003). VIRMANI et al. berichteten 2004 von einer lokalen Hypersensibilitätsreaktion eines Patienten mit einem mit Polyethylen-vinyl-acetat/Poly-n-butyl-methacylate- Copolymer beschichteten Stent aus 316L Edelstahl und machten dafür das Polymer verantwortlich. Auch als Trägermaterial für Medikamente bei sogenannten drug- eluting Stents werden häufig Stents aus nichtresorbierbarem Metall mit einer Beschichtung aus resorbierbaren Polymeren verwendet (PARKER et al. 2010).
2.2.2. Resorbierbare Materialien
Kardiovaskuläre Implantate erfüllen temporäre Aufgaben, bis der Schaden mit eigenem Gewebe repariert oder ersetzt ist, danach führen sie oft zu Komplikationen (COLOMBO u. KARVOUNI 2000). Verschlusssysteme wie Occluder, die als Matrix für körpereigene Zellen fungieren, werden nach Verschluss des Defektes, abhängig von dessen Größe, nach einigen Wochen bis Monaten nicht mehr benötigt. Beim Verschluss kleinlumiger Gefäße durch Coils bildet sich ein Thrombus, nach dessen bindegewebiger Organisation der Coil nicht mehr nötig ist (PEUSTER et al. 2006a, b). Resorbierbare Stents machen ein positives „Remodelling“, d. h. eine Wiederherstellung des Gefäßes nach Stentauflösung und eine damit verbundene Vergrößerung des Lumens möglich (COLOMBO u. KARVOUNI 2000; ORNISTON u.
WEBSTER 2007). Allerdings befindet sich die Erforschung biodegradierbarer oder -absorbierbarer Implantate in einer frühen Phase, und das Wissen darüber, wie erkrankte humane Gefäße auf ein solches Implantat reagieren, ist noch spärlich (ORNISTON u. WEBSTER 2007). Obwohl die Begriffe biodegradierbar, bioresorbierbar und bioabsorbierbar häufig synonym verwendet werden, haben sie
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unterschiedliche Bedeutungen (LIM 2004). Der Begriff "biodegradierbar" bedeutet, dass ein biologisches Agens, wie ein Enzym oder eine Mikroorganismus, die Hauptkomponente im Auflösungsprozess darstellt, während die Begriffe
"bioabsorbierbar" oder "bioresorbierbar" einen Abbau der Degradationsprodukte durch zelluläre Aktivität wie z. B. Phagozytose implizieren (LIM 2004).
Es wird bisher an verschiedenen Kunststoffen und Metallen für den Einsatz als kardiovaskuläre Implantate gearbeitet. Als resorbierbare Kunststoffe werden am Menschen bisher verschiedene Polymere eingesetzt (YAMAWAKI et al. 1998; TAMAI et al. 2000), als Metall hauptsächlich Magnesium (HEUBLEIN et al. 2003). Die Entwicklung von Eisenstents befindet sich noch in einem präklinischen Stadium (PEUSTER et al. 2006a, b).
Bereits 1988 konnte experimentell ein Poly-L-Laktat-(PLLA-)-Polymer-Stent vorgestellt werden, der mit hohen Drücken implantiert werden konnte und nach neun Monaten eine komplette Degradation zeigte (STACK et al. 1988). Andere biodegradierbare Polymerstents aus PLLA, die in die Femoralarterien von Hunden implantiert wurden, degradierten nach neun Monaten mit Anzeichen minimaler Thrombosierung, moderater Neointimabildung und milder Inflammation (SUSAWA et al. 1993; TSUJI et al. 2001). 1998 wurde der erste PLLA-Stent in eine humane Urethra implantiert (ISOTALO et al. 1998; TAMMELA u. TALJA 2003), 2000 erstmals in Koronararterien beim Menschen (TAMAI et al. 2000). Der Koronarstent zeigte zwar in Follow-up-Studien nach sechs Monaten akzeptable Restenoseraten, jedoch konnten zu diesem Zeitpunkt noch keine Anzeichen einer Biodegradation beobachtet werden (TAMAI et al. 2000). Ballondilatation allein reichte allerdings nicht aus, um den Stent zu entfalten. Er musste mit einer Hitze von 80 °C expandiert werden, wozu ein kompliziertes Verfahren notwendig war (TAMAI et al. 2000).
Temperaturerhöhungen von wenigen Sekunden auf 65–75 °C reichen jedoch aus,
um Arterienwandnekrosen mit nachfolgender Proliferation von glatten Muskelzellen auszulösen (DOUEK et al. 1992). Eine Plättchenaggregation an die Gefäßwand findet bereits bei Temperaturen von 55 °C statt und führt zu einem erhöhten Thromboserisiko (POST et al. 1996). Außerdem wurde nach einem Zeitraum von ca.
drei Monaten nach Implantation der Polylactid-Stents in die Koronararterien ein unkontrolliertes Expansionsverhalten beobachtet (TAMAI et al. 2000). Auch haben momentan erhältliche Polymerstents keine ausreichende Fähigkeit zur Expansion in chirurgischen Läsionen, wie sie bei Patienten mit angeborenen kardialen Malformationen vorkommen können (VENKATRAMAN et al. 2003). YAMAWAKI et al.
(1998) beschichteten PLLA-Stents mit antiproliferativen Medikamenten und konnten damit eine unerwünschte Neointimabildung in Schweinearterien signifikant reduzieren (YAMAWAKI et al. 1998), was eine vermehrte Forschung auf dem Gebiet der drug-eluting Stents nach sich zog (SOUSA et al. 2001; MORICE et al. 2002;
STONE et al. 2004). Viel versprechende Resultate gab es bei einem resorbierbaren PLLA-Stent mit Everolimusbeschichtung. Nach neun Monaten zeigten sich eine niedrige Restenoserate von 12 % und keine Hinweise auf Thrombosen bei 30 untersuchten Patienten (ORNISTON et al. 2007).
Magnesium ist ein Spurenelement, das natürlicherweise in großen Mengen im Körper vorhanden ist und dessen Aufgaben dort gut erforscht sind. Magnesium als Medikament wird als nebenwirkungsarme Begleittherapie bei der koronaren Herzkrankheit und bei Herzrhythmusstörungen eingesetzt (SMITH et al. 1986). Als Implantatmaterial ist es resorbierbar, besitzt als Legierung eine gute mechanische Belastbarkeit und geringe Thrombogenität (DI MARIO et al. 2004). Zur Herstellung von Stents wurden bisher die zwei Magnesiumlegierungen AE21 (HEUBLEIN et al.
2003) und WE43 (DI MARIO et al. 2004) in Schweinekoronararterien präklinisch getestet. Der Stent aus der Legierung AE21, bei dem zum Magnesium ein Anteil von 2 % Aluminium und 1 % Seltene Erden hinzulegiert wurde, zeigte allerdings bereits
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zwischen 35 und 56 Tagen einen Verlust der mechanischen Integrität (HEUBLEIN et al. 2003). Bei der Legierung WE43 wurde dem Magnesium ein Anteil von 4 % Yttrium, 0,6 % Zirconium und 3,4 % Seltene Erden hinzulegiert. Sie ist als Lekton Magic Coronary Stent® der Firma Biotronik (Berlin) kommerziell erhältlich. Dieser Stent zeigte in Studien eine schnelle Endothelialisierung, geringe Neointimaproliferation und wenig inflammatorische Veränderungen (HEUBLEIN et al.
2003; DI MARIO et al. 2004; WAKSMAN 2006; ERBEL et al. 2007a). Er besitzt allerdings nur eine geringe radiale Festigkeit und ist zwar MRI-fähig, aber nicht röntgensichtbar (DI MARIO et al. 2004; ZARTNER et al. 2007). Dieser Umstand führte zu Schwierigkeiten bei der präzisen Platzierung von überlappenden Stents, bei der Kontrolle der korrekten Stentexpansion und beim Auffinden von Stentembolisationen (DI MARIO et al. 2004). 2006 wurde ein Magnesiumstent erstmals in humane Koronararterien implantiert (BÖSE et al. 2006). Erste klinische Anwendungen von Magnesiumstents in Koronararterien bei 63 Patienten wurden bereits evaluiert (ERBEL et al. 2007a). Nach vier Monaten war die Degradation bereits weit fortgeschritten (ERBEL et al. 2007a). Eine Follow-up-Studie nach zwölf Monaten ergab eine hohe Restenoserate von 47,5 %, sodass eine wiederholte Revaskularisierung durch eine erneute perkutane Intervention oder chirurgische Bypass-Operation der ursprünglichen Stenose bei 45 % aller Patienten notwendig wurde (ORNISTON u. WEBSTER 2007). SCHRANZ et al. (2006) implantierten einen Magnesiumstent in die Aorta eines Neugeborenen und erklärten die entstandene Restenose durch den beschleunigten Abbau des Stents. Bei der Implantation eines resorbierbaren Magnesiumstents in eine stenotische aortopulmonale Kollateralarterie eines zwei Monate alten Mädchens kam es nach vier Monaten ebenfalls zu einer Restenose (MCMAHON et al. 2007).
Andere Ansätze zur Herstellung biodegradierbarer Implantate aus Metallen für kardiovaskuläre Anwendungen wurden auch durch die Verwendung von Eisen
(PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006a, b) evaluiert. Eisen als Implantatwerkstoff besitzt im Vergleich zu Edelstahl 316L ähnlich gute mechanische Eigenschaften (PEUSTER et al. 2001a, b; PEUSTER et al. 2006b), wie eine hohe radiale Festigkeit wegen seines hohen Elastizitätsmoduls von 205 GPa im Vergleich zu 41–45 GPa von Magnesium und 189–205 GPa von Edelstahl 316L (ZHANG et al.
2010). Dies ermöglicht die Herstellung dünner Stentstreben, wodurch die Menge des abgegebenen Materials in den Körper geringer wird (MANI et al. 2007). Obwohl die Streckfestigkeit und die Dehnbarkeit geringer sind als bei Edelstahl 316L, was theoretisch zu Probleme bei der Implantation führen könnte, wurden Stents aus Eisen bereits mit guten Drücken von 3,5–10 atm implantiert (PEUSTER et al. 2001a;
PEUSTER et al. 2006a, b).
Das Degradationsverhalten von Eisen zeigte sich in Voruntersuchungen in vitro unter Verwendung von drei verschiedenen Methoden als viel versprechend (PEUSTER et al. 2001a; HERMAWAN 2007a), geht in vivo jedoch deutlich langsamer voran (PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006a, b). Ein vollständiger Abbau konnte in vivo bisher noch nicht gezeigt werden. Um den Abbau zu beschleunigen und um die mechanischen Eigenschaften weiter zu verbessern, wurde bereits eine Eisen- Mangan-Legierung mit einem Gehalt von 35 % Mangan entwickelt (HERMAWAN et al. 2008, 2010). Diese Legierung besitzt die guten mechanischen Eigenschaften von Edelstahl 316L, degradiert aber noch zu langsam. Ein anderer Ansatz erfolgte mit der Anwendung einer neuen Verarbeitungsmethode von MORAJEV et al. (2010). Diese führten Versuche mit elektrogeformtem Eisen durch. Dabei konnten Reineisenfolien mit geringerem Energieaufwand und weniger Equipment hergestellt werden als bisher. Außerdem zeigten die so hergestellten Folien eine schnellere Degradation als Folien aus Reineisen, die durch Gusstechnik hergestellt wurden (MORAJEV et al.
2010). Weitere neue Ansätze zur Entwicklung eines geeigneten resorbierbaren Stentmaterials erfolgten mit der In-vitro-Evaluierung von acht verschiedenen Eisenlegierungen in Zellkulturen, von denen sich vier Legierungen als
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vielversprechend erwiesen (LIU u. ZHENG 2011). In Voruntersuchungen mit Eisen gab es keinen Hinweis auf Toxizität in Zellkulturen mit humanen Endothelzellen oder humanen Fibroblasten (PEUSTER et al. 2006a, b; MÜLLER et al. 2006). Ebenfalls in Zellkulturexperimenten konnte jedoch ein vermindertes Wachstum von glatten Muskelzellen von Menschen und Ratten (MÜLLER et al. 2006; MORAJEV et al.
2010) gezeigt werden, was eine neointimale Proliferation nach Stentimplantation reduzieren könnte.
In-vivo-Studien mit Eisenstents in der Aorta descendens von Kaninchen belegten eine Durchgängigkeit der Aorta bei allen Tieren, wobei keine Anzeichen von Verletzungen der Gefäßwände auftraten. 18 Monate nach der Implantation konnten keine pathologischen Anzeichen bei den implantierten Tieren festgestellt werden.
Angiographien nach sechs, zwölf und 18 Monaten zeigten die komplette Durchgängigkeit der behandelten Gefäße. Der Verlust der luminalen Durchmesser betrug im Vergleich zum nativen Gefäß weniger als 10 %. Die makroskopische Evaluierung zeigte eine kontinuierliche und intakte endotheliale Oberfläche und es kam zur Akkumulation der Degradationsprodukte an den Stentstreben. Histologische Untersuchungen zeigten den Verlust der eindeutigen Grenzlinien des Implantates und Entzündungsreaktionen mit eisenbeladenen Makrophagen und multinukleären Riesenzellen in der Implantatumgebung (PEUSTER et al. 2001b). Weiterhin führten PEUSTER et al. (2006a) eine In-vivo-Studie mit peripheren Eisenstents im Vergleich zu Edelstahl-316L-Stents in der Aorta descendens von Schweinen durch. Die Durchgängigkeit aller Gefäße nach einem, drei, sechs und zwölf Monaten wurde mittels Angiographie gezeigt. Ein Verlust der luminalen Durchmesser nach drei Monaten war nicht zu beobachten, betrug sechs Monate nach Implantation jedoch 10
% und nach zwölf Monaten 25 % des Gefäßes. Es bestand damit kein Unterschied in der neointimalen Proliferation der Gefäße nach Implantation von Eisenstents im Vergleich zu den Edelstahl-316L-Stents. Die Degradation des Eisens wurde durch den progressiven Verlust der Stentintegrität sichtbar und durch Eisenprodukte, die in
die Gefäßwand inkorporiert wurden (PEUSTER et al. 2006a, b).
2.3. Prüfung von resorbierbaren Implantatwerkstoffen für kardiovaskuläre Implantate
Bevor ein neues Implantat für die Anwendung am Menschen zugelassen wird, muss das verwendete Material einer Reihe von Prüfungen unterzogen werden. Geprüft wird unter anderem die Biokompatibilität des Materials, die definiert ist als "die Möglichkeit eines Materials mit einer bestimmten Wirtsantwort in einer spezifischen Applikation zu funktionieren" (RATNER 1996). Standardwerke für die Auswahl an Prüfungsverfahren sind unter anderem die Normen ISO EN 10993 "Evaluations- und Testverfahren für Medizinprodukte" und die American Society for Testing and Materials (ASTM) (HELMUS et al. 2008).
Zuerst werden in Frage kommende Materialien in vitro getestet, zu einem späteren Zeitpunkt auch in vivo an einem geeigneten Tiermodell. Als In-vitro-Tests für degradierbare Stents sieht die ISO EN 10993 Genotoxizitäts- und Zytotoxizitätstests vor ebenso wie Hämokompatibilitätstests. In vivo werden die lokalen Effekte eines Implantates, die systemische Toxizität und die Identifikation und Quantifizierung von Degradationsprodukten von metallischen Materialien in medizinischen Implantaten untersucht (HELMUS et al. 2008).
Bereits in einem frühen Stadium der Biokompatibilitätsprüfung von Implantatmaterialien sollten Zytotoxizitätstests nach ISO-Standards erfolgen (MÜLLER 2008). Diese werden mit Hilfe eines Zellkulturmodells durchgeführt, bei der ein Material in direktem Kontakt zu einem Zellrasen gebracht und untersucht wird, in welchem Ausmaß das Material die Zellen abtötet (LIM 2004). Dafür werden die Proben mindestens 24 h bei 37 °C mit positiven und negativen Kontrollen inkubiert
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(LIM 2004). Für die Prüfung von Materialien zum kardiovaskulären Einsatz werden meist humane vaskuläre glatte Muskelzellen eingesetzt (SHIH et al. 2001; MÜLLER et al. 2006; GU et al. 2009; DRYNDA et al. 2010; LIU u. ZHENG 2011). Um die Zytotoxizität von Eisen zu untersuchen, wurden Eisenchips mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von 0,2 mm in einem Zellkulturmedium und metabolischen Assays evaluiert. Dabei zeigten sie keine Toxizität auf humanen, vaskulären, endothelialen Zellen oder humanen Fibroblasten (PEUSTER et al.
2006a). In anderen Studien mit Eisenpräparaten zeigten humane, vaskuläre, glatte Muskelzellen ein vermindertes Wachstum nach Inkubation mit Fe2+-D-gluconat- dihydrat, einem Medikament zur Behandlung von Eisenmangel, ab einer Konzentration von 0,005 mg/dl und gleichzeitig eine verminderte Expression von Genen der Zellproliferation, des Zellzyklus und der DNA-Replikation (MÜLLER et al.
2006). Diese Modelle sind jedoch von der späteren Anwendung eines Implantates im menschlichen Organismus relativ weit entfernt, da Implantate nicht nur mit einem Zelltyp in Kontakt kommen, sondern mit einer Vielzahl von primären Zellen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad (WINTERMANTEL u. HA 1998).
Die Art der durchzuführenden Hämokompatibilitätstests nach ISO EN 10993-4 hängen von der Kategorie des Blutkontakts des Implantates ab (MÜLLER 2008).
Vorgesehene Tests für die Beurteilung der Hämokompatibilität von Werkstoffen mit direktem Blutkontakt beinhalten Untersuchungen zum Hämolysierungspotential, zur Blutgerinnung und zur Thrombozytenaggregation eines Materials (MÜLLER 2008).
Für die Untersuchung des Hämolysierungspotentiales eines Implantates steht die quantitative Messung von Plasmahämoglobin zur Verfügung. Dieser Test wird als besonders signifikanter Screeningtest betrachtet (ZHANG et al. 2010). Ein Anstieg von Plasmahämoglobin im Blut korreliert dabei mit der Lysis von Erythrozyten durch das Material. Ein Hämolyseassay mit Reineisenproben im Vergleich zu Proben von Edelstahl 316L und einer Magnesium-Mangan-Zink-Legierung ergab sehr gute
Hämolyseraten von Eisen, während die Hämolyseraten der Magnesiumlegierung als schlecht bewertet wurden (ZHANG et al. 2009; ZHANG et al. 2010).
Der dynamische Blutgerinnungstest misst den Grad der Aktivierung von intrinsischen Koagulationsfaktoren, wenn ein Material in den Kontakt mit Blut tritt. Tests an Eisen zeigten ausgesprochen antikoagulatorische Eigenschaften (ZHANG et al. 2010). Um den Grad der extrinsischen Gerinnung zu untersuchen, wird die Prothrombinzeit einer Blutprobe gemessen, nachdem sie auf der Oberfläche des zu untersuchenden Materials exponiert wurde. Untersuchungen ergaben, dass Eisen keine deutlichen Effekte auf den extrinsischen Gerinnungmechanismus hat (ZHANG et al. 2010). Zur Untersuchung der Plättchenadhäsion wird das zu untersuchende Material mit Plättchenreichem Plasma überlagert und bis zu drei Stunden inkubiert. Adhärente Plättchen werden nach der abgelaufenen Zeit auf den Proben fixiert und unter dem Elektronenmikroskop ausgezählt. Plättchenadhäsion auf Reineisen ergab eine geringe Dichte und eine runde Form der ausgezählten Plättchen, was auf exzellente antithrombotische Eigenschaften von Reineisen im Vergleich zu Edelstahl 316L und der Magnesium-Mangan-Zink-Legierung hindeutet (ZHANG et al. 2010).
Für Tests auf lokale Effekte nach Implantation (UPMANN 2006) sieht die ISO EN 10993-6 u. a. histologische Untersuchungen vor. Diese ermöglichen die Untersuchung lokaler entzündlicher Vorgänge an der Oberfläche eines Implantates.
Zusätzlich interessieren bei der Aufarbeitung der Implantate die Reaktion und Struktur des umgebenden Gewebes sowie der benachbarten Grenzfläche zum Blutstrom. Nach einer interventionellen Maßnahme kommt es immer zu einer Traumatisierung des Gefäßes. Normale Reaktionen darauf sind dann Entzündung, Bildung von Granulationsgewebe und Fremdkörperreaktionen (LIM 2004).
Für die histologische Bewertung sollten daher insbesondere die Ausbildung einer Bindegewebskapsel, das Auftreten von Entzündungszellen, Blutungen, Anzeichen von Gewebedegeneration bzw. -nekrosen und Partikel des Implantatmaterials in die
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Bewertung miteinbezogen werden (UPMAN 2006). Ebenso sollte eine Histologie ausgewählter Organe erfolgen (ISO EN 10993-6). Nach Implantation eines kardiovaskulären Implantates kommt es unabhängig vom Implantattyp zu einer raschen Re-Endothelialisierung der Gefäßoberfläche innerhalb von vier Wochen (SIGLER et al. 2005; PEUSTER et al. 2006a, b). Aber auch andere Reaktionen ähneln sich. Nach einer Okkluder-Implantation sprossen in das initial gebildete Thrombusgewebe fibromuskuläre Zellen ein, wie sie auch nach Stentimplantation in der Intimahyperplasie gesehen werden (SIGLER et al. 2005). Entzündliche Reaktionen sind in Qualität und zeitlichem Verlauf materialabhängig und treten bei Mensch und Tier in einem ähnlichen Muster auf (SIGLER et al. 2005). Eine akute Entzündungsphase tritt in der Regel für maximal eine Woche nach der Implantation auf. In dieser Phase treten insbesondere Monozyten, Lymphozyten und Plasmazellen in Erscheinung. In der chronischen Entzündungsphase besteht das Zellbild hauptsächlich aus Monozyten und Lymphozyten (ANDERSON et al. 2008).
Eine Fremdkörperreaktion geht mit einer Ansammlung von Monozyten, Makrophagen und Fremdkörperzellen einher und tritt etwa ein bis vier Wochen nach der Implantation auf (SIGLER et al. 2005; ANDERSON et al. 2008).
Die Standardeinbettung von Implantaten zur histologischen Beurteilung in Paraffin ist nur eingeschränkt geeignet, da metallische Anteile vor der Einbettung unter Beschädigung der Grenzfläche Gewebe/Implantat entfernt werden müssen (SIGLER et al. 2005). Alternativ kommt eine Einbettung in Kunstharze in Frage, wobei histologische Schnitte mittels Schneiden oder Schleifen angefertigt werden. Die Trenndünnschliff-Technik nach DONATH ist eine Methode zur Erstellung von Schliffen mit Stärken von 5–10 m (DONATH 1988). Dieμ Färbung der in Harz eingebetteten Proben wird meist mit Toluidinblau oder nach Richardson durchgeführt, dabei färben sich basophile und osmiophile Strukturen blau und metachromatische Strukturen rotviolett an (RICHARDSON et al. 1960). Eine Färbung der in Paraffinwachs eingebetteten Proben erfolgt standardmäßig mit Hämatoxylin und
Eosin (SIGLER et al. 2005). Für Eisen eignet sich Turnbullsblau zum Nachweis zweiwertiger Eisenionen oder Preußischblau (auch genannt Berlinerblau) zum Nachweis von dreiwertigem Eisen (ROMEIS 1989). Turnbullsblau ist jedoch weniger geeignet zum Nachweis von Eisen, da es im Organismus meist als dreiwertiges Eisen vorliegt, z. B. als Hämosiderin (ROMEIS 1989), Ferritin (SILBERNAGEL u.
DESPOPOULOS 2007) oder in der Bindung an Transferrin (ROMEIS 1989).
Neben der Histologie können immunhistochemische Methoden zum Einsatz kommen, z. B. Färbung mit von-Willebrandt-Faktor zum Nachweis von Endothelbildung oder Aktin der glatten Muskulatur zum Nachweis von Neointimabildung (SIGLER et al. 2005).
Die Vermessung von Flächen ist eine grundlegende Messmethode der Histomorphometrie (PARFITT 1987). Sie wird in einigen Studien zur Bestimmung der Neointimabildung nach Ballonangioplastie, Stentimplantation oder in anderen Restenosemodellen angewandt (SCHWARTZ et al. 1990 SCHWARTZ et al. 1992;
VAN DER GIESSEN et al. 1996), ebenso wie in Studien zur Biokompatibilität von Materialien mittels Subkutantest (JANSEN et al. 1994).
Für Eisen wurden Tests auf lokale Effekte bereits durchgeführt, indem explantierte Stents aus Kaninchen- und Schweineaorten histologisch untersucht wurden (PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006a, b). Vor der histologischen Untersuchung erfolgte eine makroskopische Untersuchung des Lumens des behandelten Gefäßes auf Anzeichen von Thrombusbildung oder neointimale Obstruktion. Nach Dissektion der Stentstreben wurde die Probe in Paraffin eingebettet und longitudinal 3–5 µm dick geschnitten. Die Schnitte wurden u. a. mit Hämatoxylin und Eosin und Turnbullsblau gefärbt. Ein Tier pro Versuchsgruppe wurde elektronenmikroskopisch auf Anzeichen von Endothelialisierung untersucht (PEUSTER et al. 2001a). Histologisch wurde eine Degradation der Eisenstentstreben durch Verlust der klaren Grenzflächen beobachtet. Die entzündliche Reaktion war
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zwischen und innerhalb der Tiere variabel, unabhängig von der Dicke der Streben und den Follow-up-Zeiten. Eine Akkumulation von Eisen-beladenen Makrophagen und multinukleären Riesenzellen reichte von einer spärlich isolierten Lokalisation bis zur Akkumulation in Clustern und wurde häufig in der Media und der fibrösen Adventitia der Aorta gefunden (PEUSTER et al. 2001a; PEUSTER et al. 2006a, b).
Bisher wurden noch keine molekularbiologischen Untersuchungen für die Evaluierung von Stents durch die ISO EN 10993 empfohlen, obwohl viele Autoren diese im Zusammenhang mit der Evaluierung von Implantatsicherheit für sinnvoll halten (SIGLER et al. 2005; TELLEZ et al. 2010) und einige Studien bereits molekulare Untersuchungen beinhalten (PEUSTER et al. 2004; PEUSTER et al.
2006 b).
Im Abschnitt Systemtoxizität der ISO-Norm EN 10993-11 werden die Methoden für die Evaluierung der potentiellen adversen Effekte von medizinischen Implantaten auf die Organe und Gewebe vorgeschlagen, die nicht unmittelbar an der Implantationsstelle auftreten (WALLIN 1998). Der Standard liefert an dieser Stelle keine detaillierten Protokolle für das Studium systemischer Toxizität, sondern zitiert verschiedene Methoden, die bereits in anderen internationalen oder nationalen Standards, Direktiven oder Regelwerken genannt werden, z. B. denen der Food and Drug Administration, der US-amerikanischen Behörde für Arzneimittelsicherheit (WALLIN 1998). Obwohl die meisten Studien zur Systemtoxizität Flüssigextrakte der zu prüfenden Materialien verwenden, kann die Implantation des Materials in den Körper die bessere Wahl zur Untersuchung der Systemtoxizität sein (WALLIN 1998).
So kann es sein, dass die verwendeten Flüssigkeiten dazu führen, dass das Material degradiert und die resultierenden Abbauprodukte adverse Effekte auf Organe haben, während das Material eigentlich von Körperzellen abgebaut und nicht toxisch verstoffwechselt werden kann (WALLIN 1998). Deshalb wurden Reineisenstents in
Schweineaorten implantiert und Organe nach ein bis zwölf Monaten auf Anzeichen einer Systemtoxizität untersucht, die allerdings ausblieben (PEUSTER et al. 2001a).
Um sicherzugehen, dass auch langfristig ein toxischer Effekt ausbleibt, sollten ausreichend große Mengen des Materials implantiert werden (WALLIN 1998).
Für die Prüfung von degradierbaren Materialien existiert ebenfalls eine ISO-Norm zur Identifizierung und Quantifizierung von Degradationsprodukten aus Metallen und Legierungen (ISO EN 10993-15). Hierfür vorgesehen sind In-vitro-Untersuchungen zur Form und Oberfläche der Probe sowie elektrochemische Tests mit elektrodynamischen und elektrostatischen Untersuchungen sowie Immersionstests.
Immersionstests wurden zur Prüfung von Reineisen (ZHANG et al. 2010; LIU u.
ZHENG 2011) und einer beschichteten Magnesiumlegierung (LU et al. 2011) bereits durchgeführt. Dafür wurden 10 x 10 x 2 mm große Proben aus Reineisen für verschiedene Zeitspannen von ein bis vier Wochen in Hanks´ Lösung verbracht.
Danach wurden sie gewaschen, das verlorene Gewicht relativ zur Oberfläche gemessen und die Gewichtsverlustrate berechnet. Morphologien, Mikrostruktur und Oberflächenstruktur wurden elektronenmikroskopisch untersucht (ZHANG et al.
2010). Dieser Test wurde zum dynamischen Immersionstest durch LEVESQUE et al.
(2008) für die Prüfung von kardiovaskulären Materialien weiterentwickelt. Dafür wurde der Hanks´ Lösung Sauerstoff zugesetzt und deren Temperatur sowie pH-Wert den Verhältnissen in den Koronararterien angepasst. Die zu untersuchenden Proben wurden dann mit der fließenden Lösung umspült, um den Blutfluss zu simulieren (LEVESQUE et al. 2008; LIU u. ZHENG 2011).
Eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung von Degradation in vivo oder ex vivo ist die Anfertigung von µ-computertomographischen Bildern und Messungen. Diese Technik wurde bisher hauptsächlich zur Beurteilung von Biokompatibilität und Degradation von Magnesiumimplantaten für die Osteosynthese verwendet (WITTE et
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al. 2006; VON DER HÖH 2008). In der Kardiologie wurde sie zum Nachweis intrakoronarer Stentfrakturen (FOERST et al. 2010) genutzt. Andere Studien verwendeten die µ-CT-Technik um die In-Stent-Restenose am Kaninchenaortamodell zu untersuchen (LANGHEINRICH et al. 2005) oder um die richtige Platzierung und Durchgängigkeit von Stents in Aneurysmata am Kaninchenmodell zu prüfen (IONITA et al. 2009).
Für Magnesiumstents wurde versucht, eine Absorptionskinetik im MRI zu erstellen, was sich als unmöglich erwies, da Magnesiumstents im MRI nicht dargestellt werden können (EGGEBRECHT et al. 2005). Eine andere Studie ergab ebenfalls negative Ergebnisse bei der Darstellung von Magnesiumstents in der Mehrschicht-Spiral- Computertomografie (MSCT) (LIND et al. 2005), aber eine Darstellung im µ-CT bei einer Auflösung von 24 µm war schließlich jedoch möglich (ERBEL et al. 2007b). In einer neueren Studie wurden Polymer-Stents in die Aorta von Ratten implantiert und die stattgefundene In-vivo-Degradation stereomikroskopisch mithilfe eines semiquantitativen Scoring-Systems bewertet, während gleichzeitig In-vitro- Degradationstests mit demselben Material durchgeführt wurden (MA et al. 2011).
Hierbei konnte eine deutlich schnellere Degradation des Polymers in vivo festgestellt werden, was deutlich macht, dass In-vitro-Tests nur in einem frühen Entwicklungsstadium einen Tierversuch ersetzen können (MA et al. 2011).
2.4. Tiermodelle für die Testung kardiovaskulärer Implantate
In Tierexperimenten können physiopathologische Aspekte einer Erkrankung simuliert, Variablen kontrolliert und statistische Daten in einer kurzen Zeitspanne erfasst werden (TOUCHARD u. SCHWARTZ 2006). Einige Anforderungen an ein geeignetes Tiermodell sind Ähnlichkeit zur humanen Anatomie und Physiologie, Reproduzierbarkeit der Läsionen, die denen des Menschen in Pathogenese,
Morphologie und Verteilung entsprechen (VESSELINOVITCH u. NEGRI 1988). Ein einfacher Zugang und passende Größe der Gefäße, einfache Handhabung und geringe Kosten wären von Vorteil (NARAYANASWAMY et al. 2000). Ein einziges, ideales, natürliches Modell zur Testung kardiovaskulärer Implantate existiert im Augenblick nicht (NARAYANASWAMY et al. 2000; PERKINS 2010).
Kardiovaskuläre Implantationen an Hunden wurden mit endovaskulären Nitinol- Draht-Filtern als Thrombusfänger in der V. cava, (PRINCE et al. 1988), Coils (MAWAD et al. 1995), Stents zur Therapie von Aneurysmata (GEREMIA et al. 1994;
LEROUGE et al. 2006) und Gefäßprothesen (KEOUGH et al. 1984) durchgeführt.
Hunde wurden früher aufgrund ihrer Gefäßgröße, der einfachen Handhabung, geringer Kosten und leichter Verfügbarkeit als vorteilhafte Modelle für endovaskuläre Studien betrachtet. Dies wurde unterstützt durch die Möglichkeit, kommerziell erhältliche Stents in Koronar- und periphere Arterien zu applizieren und diese in Langzeitstudien zu testen, da eine Größenzunahme beim Hund im Vergleich zum Schwein eher langsam erfolgt (RASHID et al. 2004). Hunde scheinen allerdings nach Ballonangioplastie oder Koronarstenting keine Neointima zu bilden (HOLMES u.
SCHWARTZ 1993) und zeichnen sich durch eine hohe fibrinolytische Aktivität aus.
Sie besitzen ein Koagulationssystem, dass sich vom Menschen unterscheidet (MASON u. READ 1971; KEOUGH et al. 1984) und haben dadurch im Vergleich zum Menschen ein geringes Potential zur Entwicklung einer akuten Stentthrombose (PERKINS 2010). Deshalb konnten präklinische Studien mit dem Hundemodell die thrombotischen Komplikationen, die in frühen klinischen Tests am Menschen auftraten, nicht voraussagen (SCHATZ et al. 1987; SIGWART et al. 1987). Aufgrund des im Vergleich zum Menschen gut ausgebildeten Systems von Kollateralarterien können plötzliche kardiale Zwischenfälle wie Myokardinfarkte nicht richtig beurteilt werden (RUSSEL u. PROCTOR 2006; DIXON u. SPINALE 2009). Schließlich sind Hunde als Karnivoren sehr resistent gegen die Entwicklung einer Atherosklerose,
LITERATURÜBERSICHT
was die Anwendung diätetischer Modelle ausschließt (RUSSEL u. PROCTOR 2006).
Zudem ist der Tierversuch an Hunden vor allem in westlichen Ländern umstritten, da sie hier vor allem als Haus- und Begleittiere gehalten werden (RUSSELL u. SECORD 1985; RASHID et al. 2004). SCHWARTZ et al. 1994 bezeichneten den Hund als Modell für die Prüfung peripherer Stents aufgrund der limitierten Entzündungsantwort sogar als ungeeignet.
Das Kaninchen wird als Arteriosklerosemodell (CONSTANTINIDES u.
CHAKRAVARTI 1961; ABELA et al. 1995), Restenosemodell (ZEMPLENYI et al.
1988; BANAI et al. 1991; DOUEK et al. 1992; WILENSKY et al. 1995) oder zur Evaluierung von Stents verwendet. Die Evaluierung von Stents im Kaninchenmodell kann mit (JONER et al. 2008a, b; FINN et al. 2009; NAKAZAWA et al. 2011) oder ohne (FARB et al. 2001; PEUSTER et al. 2001a; IONITA et al. 2009) hypercholesterine Diät erfolgen, bei der dem Futter zusätzlich Cholesterin, Fette oder Kasein zugesetzt werden. Diese Diät führt in Kombination mit einer Gefäßverletzung dazu, dass sich atherosklerotische Läsionen in den Gefäße entwickeln, die denen des Menschen ähneln (WATANABE et al. 1980; ABELA et al. 1995). Allerdings enthalten atherosklerotische Plaques beim Menschen, anders als im Kaninchenmodell, Schaumzellen (Makrophagen mit exzessiven Fetteinlagerungen) und eine voluminöse extrazelluläre Matrix, sind fibrokalzifizierter und stellenweise nekrotisch (WILENSKY et al. 1995; SCHWARTZ et al. 2004). Es werden Aorta, Carotid-, Iliofemoral-, Femoral-, Iliacal- und Subclaviaarterien als Modellgefäße verwendet (ZEMPLENYI et al. 1988; WILENSKY et al. 1995; SCHWARTZ et al.
2004; LIDELL et al. 2005). Sie besitzen eine zum Teil vergleichbare Größe zu humanen Koronararterien und erlauben so eine morphometrische und angiographische Evaluierung kommerziell erhältlicher Implantate (PERKINS 2010).
Die Geschwindigkeit und die Phasen der vaskulären Heilung nach stentinduzierter Verletzung in Iliacalarterien normocholesteriner Kaninchen entsprechen denen im
porzinen Koronararterienmodell, verlaufen jedoch schneller als im menschlichen Organismus (VIRMANI et al. 2003; SCHWARTZ et al. 2008). Iliacalarterien von Kaninchen zeigten ähnliche Flussgeschwindigkeiten wie Koronararterien von Schweinen und Menschen nach Implantation von drug-eluting Stents (BAYES-GENIS et al. 2000). Doch obwohl die arterielle Antwort auf Verletzung ähnlich ist, ist die Anfälligkeit der elastischen Aorta und der A. iliaca geringer im Vergleich zu einer muskulären Koronararterie (ASADA et al. 1996). Dies kann dazu führen, dass weniger neointimale Hyperplasie, Thrombusformation und Entzündung nach Implantation auftreten als im Vergleich zu porcinen oder humanen Koronararterien (PERKINS 2010). Auch besitzen Iliacalarterien von Kaninchen im Vergleich zu Koronararterien von Mensch und Schwein eine Tendenz zur verzögerten Reendothelialisierung nach Gefäßverletzung (PERKINS et al. 2007; JONER et al.
2008a; NAKAZAWA et al. 2008).
Bisher werden meist Schweine als Restenosemodell (BONAN et al. 1993;
SCHWARTZ et al. 1992, ZHOU et al. 2010) eingesetzt und stellen das Standardmodell zur Evaluierung kardiovaskulärer Implantate dar (VAN DER GIESSEN et al. 1996; HEUBLEIN et al. 2003; PEUSTER et al. 2006b, b; ZHANG et al. 2011). Die Anatomie und Größe der Koronararterien von Mensch und Schwein sind vergleichbar (TOUCHARD u. SCHWARTZ 2006). Beide Spezies besitzen den
„beidseitig koronaren Versorgungstyp“, d. h. beide Koronararterien sind zu gleichen Anteilen an der Blutversorgung des Myokards und des Septums beteiligt (BONAN et al. 1993; SCHUMMER u. HABERMEHL 1996). Schweine besitzen einen ähnlichen histopathologischen Aufbau der Restenose wie Menschen (SCHWARTZ et al. 1990;
SCHWARTZ et al. 1992; BONAN et al. 1993). Auch der Ablauf von Thrombusauflösung und Heilung in porzinen Arterien reflektiert die Heilung von humanen Arterien nach Stentimplantation (SCHWARTZ et al. 2004). Die Größenverhältnisse der Gefäße im Schwein erlauben den Einsatz derselben