4 Ergebnisse 95
4.3. Histomorphometrische Ergebnisse
4.3.4. Immmunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen Aktin der glatten
Es konnte eine tendenzielle Abnahme der Gefäße im Entzündungsbereich bei Zunahme der Fläche der Entzündung festgestellt werden (Abb. 29; Anhang Tab. VII).
Es wurden in der Gruppe drei Monate nach Implantation im arithmetischen Mittel 43,3 (SD ± 3,5) Aktin-positive Gefäße gezählt, sechs Monate nach Implantation waren es 39,7 (SD ± 13,4) und neun Monate nach Implantation waren es noch 36,0 (SD ± 9,8) (Abb. 30). In der Kontrolle lag keine Entzündung vor, weshalb die Anzahl der Aktin-positiven Gefäße auf 0 gesetzt wurde, obwohl sich native Schwanzgefäße mit Aktin angefärbt hatten (Abb. 31).
Abbildung 29: Histomorphometrisch ermittelte Anzahl Aktin-positiver Gefäße im Entzündungsbereich drei, sechs und neun Monate nach Implantation im arithmetischen Mittel mit Standardabweichungen. p. Impl. = post Implantationem
Kontrolle 3 Monate p. Impl. 6 Monate p. Impl. 9 Monate p.Impl.
0 10 20 30 40 50
positive Stellen pro 1000µm²
positive Stellen pro 1000µm²
Abbildung 30: Histologischer Schnitt eines Mausschwanzes mit Eisenimplantat nach neun Monaten. Immunhistochemische Färbung mit Aktin der glatten Muskulatur, 20fache Vergrößerung. Aktin-positive Bereiche haben sich braun angefärbt (Pfeile).
EIGENE UNTERSUCHUNGEN - ERGEBNISSE
Abbildung 31: Histologischer Schnitt eines Mausschwanzes ohne Implantat nach neun Monaten. Native Venen- und Arterienwände zeigen Aktin-positive Bereiche (braun). Eine Entzündung liegt nicht vor. Immunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen Aktin der glatten Muskulatur, 10fache Vergrößerung.
4.4. Genexpressionsanalysen
4.4.1. Qualitätskontrolle der Genchips
Um die Qualität der Analyse zu gewährleisten, wurden vom Hersteller der Chips bestimmte Qualitätskontrollschritte eingebaut.
Das Oligo-B2-Muster wurde bei allen Chips vollständig dargestellt (Abb. 32). Eine weitere visuelle Überprüfung zeigte keine Artefakte auf dem gescannten Chips.
Abbildung 32: Ausschnitt aus dem Bild eines gescannten Arrays. An der linken oberen Ecke des Arrays werden das Schachbrettmuster und daneben der Arrayname angezeigt. Dies zeigt eine korrekte Hybridisierung der Gensequenzen auf den Chip an.
Alle exogenen Transkripte bioB, bioC und bioD aus Escherichia Coli und cre, einer Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 Transkripte konnten auf allen verwendeten Genchips detektiert werden.
Die Percent Present für Kontrolle I (GBF 0987) beträgt 32 %, für Kontrolle II (HZI 2521) 46 %, für Eisen I (GBF0880) 25 %, für Eisen II (GBF0881) 24 % und für Eisen III (GBF0882) 10 %.
Unter Berücksichtigung dieser Qualitätsmerkmale konnten alle MOE430 2.0 Genchips ausgewertet werden. Damit konnte quantitativ und qualitativ ausreichende RNA für die Genexpressionsstudien gewonnen und erfolgreich auf die Genchips hybridisiert werden.
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4.4.2. Hierarchische Clusteranalyse
Um zu untersuchen, ob sich die Gewebeproben der Mausschwänze mit Eisenfolien signifikant von den Proben ohne Implantat unterscheiden lassen, wurden mit Hilfe des Klassifikationsprogramms CLUSTER (EISEN et al. 1998) die Genexpressionsprofile der fünf Arrays analysiert und die Ergebnisse grafisch dargestellt. Das Dendrogramm verzweigt sich einmal im oberen Bereich und ordnet dabei die beiden Kontrollen (Kontrolle I und Kontrolle II) und die drei Proben (Eisen I, Eisen II und Eisen III) zusammen an, wobei die Länge der beiden Äste zu den Kontrollen genauso lang ist wie die zu den Proben (Abb. 33). Die einzelnen Arrays unterscheiden sich in ihren Verwandtschaftsverhältnissen dahingehend, dass sich die Proben Eisen II und Eisen III geringgradig ähnlicher sind als Eisen I und Eisen II bzw. Eisen I und Eisen III.
Abbildung 33: Dendrogramm der Clusteranalyse der Genexpressionsprofile.
Vergleich der Arrays von Mausschwanzgewebe mit Eisenfolien (Eisen I, II und III) neun Monate nach Implantation und Mausschwanzgewebe ohne Eisenfolienimplantat (Kontrolle I und II). Kontrollen und Eisenproben werden jeweils zusammen angeordnet.
4.4.3. Einordnung der Gene in funktionelle Gruppen
Um zu untersuchen, was die Gewebeproben mit und ohne Eisenimplantat funktionell unterscheidet, wurden die differentiell regulierten Gene in GO-Kategorien eingeordnet. Die Definitionen der ermittelten GO-Kategorien befinden sich im Anhang Tab. VIII und Tab. IX. Die 643 heraufregulierten Gene wurden im Bereich Biologischer Prozess vor allem in GO-Terms eingeordnet, die das Immunsystem betreffen (Tab. 7 und Abb. 34).
Am signifikantesten überrepräsentiert war dabei die Kategorie Immunsystemprozess (GO:0002376). Hierin wurden unter anderem die Gene Integrin alpha-M Precursor (Cell surface glycoprotein MAC-1 subunit alpha) (Itgam), Nuclear factor NF-kappa-B p100 subunit (Nfkb2), NF-kappa-B inhibitor alpha (Nfkbia), Interferon gamma inducible protein 30 (Ifgi30), Interleukin-1 beta Precursor (Il1b), Interleukin-7 receptor subunit alpha Precursor und Calgranulin-B (S100a9) zusammengefasst. Ebenfalls hoch angereichert war die Kategorie Chemotaxis (GO:0006935). Eingeordnete Gene waren hier unter anderem Calgranulin-A (S100a8), High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Precursor (Fcer1g) und Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III Precursor (Fcgr3). Eine Auswahl weiterer wichtiger hochregulierter Gene befindet sich weiter unten (Tab. 8). Die Liste aller heraufregulierten Gene (unter Auslassung von doppelten oder unbekannten Transkripten) befindet sich im Anhang Tabelle IX.
EIGENE UNTERSUCHUNGEN - ERGEBNISSE Tabelle 7: GO-Terms für die 643 differentiell heraufregulierten Gene im Mausschwanzgewebe mit Eisenfolie nach 9 Monaten.
Antwort auf externen Stimulus GO:0009605 61 27,46 2,38e-07 Zelluläre Antwort auf chem. Stimulus GO:0070887 44 2,64 3,15e-07
Leukozytenmigration GO:0050900 14 6,70 1,05e-06
* p-Wert korrigiert nach Benjamini und Hochberg (1995)
Abbildung 34: Dendrogramm der zehn GO-Kategorien im Bereich biologische Prozesse für die heraufregulierten Gene, die am stärksten angereichert waren.
Kästchen mit roter Schrift zeigen die stark angereicherten GO-Kategorien, Kästchen mit schwarzer Schrift deren weniger oder nicht angereicherte Überkategorien mit jeweils dazugehörenden p-Werten.
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Tabelle 8: Auswahl einzelner wichtiger Gene aus insgesamt 643 heraufregulierten Genen.
Genname Probe Set ID
Colony stimulating factor 3 receptor (granulocyte) 1418806_at Complement component 1, q subcomponent, gamma polypeptide 1449401_at
Complement component 3a receptor 1 1419483_at
Complement component 3a receptor 1 1442082_at
Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor 1425225_at Fc receptor, IgE, high affinity I, gamma polypeptide 1418340_at
Fc receptor, IgG, low affinity III 1448620_at
Histocompatibility 2, class II antigen A, alpha 1438858_x_at
Integrin alpha M 1422046_at Nuclear factor of kappa light chain gene enhancer in B-cells inhibitor,
alpha 1448306_at
Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 2, p49/p100
1425902_a_at Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells
inhibitor, zeta 1448728_a_at
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A) 1419394_s_at S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) 1448756_at
serum amyloid A 3 1450826_a_at
Transforming growth factor, beta receptor I (Tgfbr1) 1446946_at Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2 1438855_x_at
Die 2831 herunterregulierten Gene wurden im Bereich Biologischer Prozess vor allem in Kategorien eingeordnet, die mit der Bereitstellung von Vorläufermetaboliten und Energie (GO:0006091) und der Elektronentransportkette (GO:0022900) im Zusammenhang stehen. Die in diese Gruppen eingeordneten Gene sind z. B.
verschiedene NADH-Dehydrogenasen und Cytochrome. Auch Regulation der zellulären Komponentenorganisation (GO:0051128) mit den Genen Connective tissue growth factor precursor (Ctgf) und Endothelin-1 (Edn1) ist eine Kategorie des Bereichs biologischer Prozess (Tab. 9 u. Abb. 35).
Im Bereich Molekulare Funktion waren vor allem Kategorien, die mit Bindung im Zusammenhang stehen, überrepräsentiert. Hierzu zählen die Kategorie Proteinbindung (GO:0005515), in der sich unter anderem die Gene CD9 antigen (CD 9), Heat shock protein 1A (HspaIa), Eukaryotic translation elongation factor 2 (Eef2) und Cerebellar degeneration-related 2 (Cdr2) befanden und die Kategorie Bindung ungefalteter Proteine (GO:0051082), in der unter anderem das Gen DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1 (Dnajb1) enthalten ist.
Im Bereich Zelluläre Komponente waren die Kategorien Zytoplasma (GO:0005737) mit den Genen carbonic anhydrase 3 (Car3), protein O-fucosyltransferase 2 (Pofut2), ERBB receptor feedback inhibitor 1(Erfi1), sowie Intrazelluär (GO:0005622) und Atmungskette (GO:0070469) angereichert (Tab. 10).
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Tabelle 9: GO-Terms für die 2831 differentiell herunterregulierten Gene im Mausschwanzgewebe mit Eisenfolie nach neun Monaten. Translation initiation factor activity GO:0003743 12/59 4,22 0,0020 Zytoskelettale Proteinbindung GO:0008092 43 1,97 0,0020
Abbildung 35: Dendrogramm der zehn GO-Kategorien der 2831 differentiell herunterregulierten Gene, die am stärksten angereichert waren. Kästchen mit roter Schrift zeigen die stark angereicherten GO-Kategorien, Kästchen mit schwarzer Schrift deren weniger oder nicht angereicherte Überkategorien.
EIGENE UNTERSUCHUNGEN - ERGEBNISSE Tabelle 10: Auswahl einzelner wichtiger Gene aus insgesamt 2831 herunterregulierten Genen.
Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial Precursor 1435757_a_at Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Precursor 1416604_at DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 4 1451177_at
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6 1448234_at
ERBB receptor feedback inhibitor 1 1416129_at
Erbb2 interacting protein 1428011_a_at
eukaryotic translation elongation factor 1 beta 2 1448252_a_at
eukaryotic translation elongation factor 2 1424736_at
fatty acid synthase 1423828_at
heat shock 27kDa protein 8 1417013_at
heat shock protein 1 1422943_a_at
heat shock protein 1B 1452318_a_at
heat shock protein family, member 7 (cardiovascular) 1434927_at
interleukin 1 receptor, type I 1448950_at
interleukin 6 signal transducer 1437303_at
major urinary protein 1 /// major urinary protein 2 1420465_s_at major urinary protein 1 /// major urinary protein 3 1426154_s_at
myosin IB 1459679_s_at
myosin, heavy polypeptide 11, smooth muscle 1448962_at
myosin, light polypeptide 1 1452651_a_at
NADH dehydrogenase 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Precursor
1448483_a_at NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 8, mitochondrial Precursor 1423907_a_at NFKB inhibitor interacting Ras-like protein 1 1428503_a_at
nuclear factor I/A 1456087_at
potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1 1448468_a_at Potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily,member 1 1455785_at potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, member 5 1417680_at
protein O-fucosyltransferase 2 1437845_x_at
transforming growth factor beta regulated gene 1 1452648_at
transforming growth factor, beta 3 1417455_at
transforming growth factor, beta receptor I 1420895_at
tumor necrosis factor receptor superfamily, member 12a 1418571_at
vascular endothelial growth factor C 1419417_at