Histologie

Eine erste Auswertung der histologischen Schnitte in Paraffin und der Trenndünnschliffe erfolgte deskriptiv. Beurteilt wurden die Mausschwanz-Implantat-Gewebe-Verbünde nach drei, sechs und neun Monaten im Hinblick auf Entzündungen, Fremdkörperreaktionen, Gefäßmorphologien und Degradation der Eisenfolien. Die Auswertung der Organschnitte erfolgte ebenfalls deskriptiv, dabei wurde nach Degradationsprodukten von Eisen und nach Anzeichen von Toxizität gesucht. Danach erfolgte eine histomorphometrische Auswertung der Mausschwanzgewebe mit Eisenfolien in Paraffin. Dabei wurde semiquantitativ das Verhältnis des Durchmessers der Folie zum Kontrollgefäß der Tiere ohne Folie bestimmt, die Gesamtfläche der Eisendegradation, der Abstand der weitesten Eisenpartikel vom Implantatmittelpunkt, die Gesamtfläche der Entzündung, die Anzahl der Entzündungszellschichten um das Implantat herum und die Anzahl der Smooth-muscle-cell-Actin-positiven Bereiche im Entzündungsbereich. Die Trenndünnschliffe wurden zur Bestimmung des Verhältnisses des Durchmessers der Folie zum Kontrollgefäß der Tiere ohne Folie verwendet. Die histologische Auswertung wurde mit einem Durchlichtmikroskop Olympus BX 51 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster) bei 4- bis 40facher Vergrößerung vorgenommen.

Als Fotoeinrichtung wurde eine Digitalkamera Olympus DP 25 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster) über einen Adapter an das Mikroskop und mit einem Interface an einen PC angeschlossen. Die histologischen Schnitte wurden mit der Kamera auf dem Computermonitor dargestellt und fotografiert. Definierte Flächen

und Abstände wurden mit dem Bildverarbeitungssoftware Cell D 2.7 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster) am Computer vermessen.

3.4.2.1. Verhältnis Kontrollgefäß zu Foliendurchmesser

Für die Implantation von Stents wird oft ein größerer Durchmesser gewählt als das Gefäß besitzt, in das implantiert wird. Dies soll eine Verschiebung des Implantates im Gefäß verhindern (SERRUYS et al. 1994; TAMAI et al. 2001; PEUSTER et al.

2001a). Um den Grad der Überdehnung des Schwanzgefäßes durch die Eisenfolien festzustellen, wurden die Gefäßdurchmesser der Venen der Kontrolltiere ohne Eisenfolie und der implantierten Gefäße mit Eisenfolien bestimmt. Dafür wurden aus jeder Versuchsgruppe von dem in Paraffin eingebetteten Schwanz-/Implantatgewebe jeweils ein Hämatoxylin-Eosin-Schnitt verwendet. Da eine Messung des Durchmessers zu ungenau gewesen wäre, weil sowohl die normalen Schwanzvenen als auch die Venen in die implantiert wurde, nicht immer rund waren, sondern teilweise auch längsoval, wurden die Durchmesser nicht direkt ausgemessen, sondern die Querschnittsfläche der Gefäße (s. Abb. 7 u. 8). Zur besseren Vergleichbarkeit wurde der Querschnitt aller Gefäße als rund angenommen und mit Hilfe der Kreisformel zur Berechnung des Durchmessers

d = 2 ∙ √A/π = 2r ≈ 1,1284 ∙ √A

nach BRONSTEIN et al. (2000) aus der Querschnitts-(Kreis-)fläche berechnet.

EIGENE UNTERSUCHUNGEN - MATERIAL UND METHODEN

Abbildung 7: Histologische Schnitte von der nativen Schwanzarterie (A) und Vene (V) ohne Implantat. Färbung mit Hämatoxylin-Eosin, 25fache Vergößerung. Der manuell rot umrandete Bereich kennzeichnet das Lumen der Vene, das zur Berechnung der Fläche des Gefäßes herangezogen wurde.

Abbildung 8: Histologischer Querschnitt eines Mausschwanzes mit Eisenimplantat nach drei Monaten. Färbung mit Hämatoxylin-Eosin, 4fache Vergrößerung. Zur Messung des Foliendurchmessers wurde an der Implantat-Gewebe-Grenze (rot umrandet) der Flächeninhalt gemessen (rote Ziffern) und daraus der Foliendurchmesser berechnet.

3.4.2.2. Messung der Eisenfläche

Um festzustellen, ob eine Degradation stattgefunden hat und um diese zu quantifizieren, wurden Preußischblau-Färbungen bei allen in Paraffin eingebetteten

EIGENE UNTERSUCHUNGEN - MATERIAL UND METHODEN

Mausschwanzgeweben mit Implantat nach drei, sechs und neun Monaten durchgeführt. Die positiv blau gefärbten Flächen in der Peripherie des Implantates wurden vermessen (Abb. 8), um eine eventuelle Zunahme von Korrosionsprodukten und damit verbundene Verteilung auf größerer Fläche im Zeitverlauf zu untersuchen.

Dazu wurden blau gefärbte zusammenhängende Flächen manuell umkreist und vom Computerprogramm die entsprechende Flächen gemessen und addiert.

Abbildung 9: Histologischer Querschnitt eines Mausschwanzgewebes mit Implantat nach sechs Monaten. Färbung mit Preußischblau, 25fache Vergrößerung. In die Auswertung eingegangene Preußischblau-positive Bezirke in der Implantatumgebung werden hier rot umrandet dargestellt.

3.4.2.3. Messung des Abstandes der weitesten Eisenpartikel vom Implantatmittelpunkt

Um zu untersuchen, ob sich Degradationsprodukte des Eisens, wie dreiwertiges Eisen, im Zeitverlauf weiter lokal vom Implantationsort entfernen, wurde der Abstand der Außenränder der Preußischblau-positiv gefärbten Bezirke vom Mittelpunkt des Implantates gemessen. Dazu wurde der Schnitt in acht Vektoren in gleichen Winkeln unterteilt und diese der Länge nach vermessen (Abb. 10). Der Schnittpunkt der Vektoren wurde dabei als Mittelpunkt des Implantates definiert. Diese Vermessung wurde bei jeweils einem Schnitt pro Zeiteinheit der in Paraffin eingebetteten Gewebe durchgeführt.

Abbildung 10: Preußischblau-Färbung eines Mausschwanzgewebes mit Implantat nach neun Monaten, 25fache Vergrößerung. Die acht gemessenen Distanzen vom Mittelpunkt sind mit roten Pfeilen dargestellt.

EIGENE UNTERSUCHUNGEN - MATERIAL UND METHODEN

3.4.2.4. Messung der Entzündungsfläche

Zur Beurteilung des Ausmaßes einer zuvor im Rahmen der Degradation des Implantates deskriptiv ermittelten Entzündung wurde die Gesamtfläche der Entzündungsreaktion um das Implantat herum gemessen. Diese wurde durch das Vorliegen von Entzündungszellen definiert. Die Berechnung der Entzündungsfläche wurde durchgeführt, indem die Außengrenzen des Entzündungsbereichs manuell markiert und die Fläche des so gekennzeichneten Bereichs durch das computergestütze Bildverarbeitungsprogramm berechnet wurde (Abb. 11). Von dieser Fläche wurde die in Kap. 3.4.2.1 ermittelte Fläche der Implantat-Gewebe-Grenze subtrahiert und die so berechnete Fläche als Entzündungsfläche definiert.

Für diese Untersuchung wurden die in Paraffin eingebetteten Implantat-Mausschwanzgewebe mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung nach den entsprechenden Zeiteinheiten verwendet.

Abbildung 11: Histologisches Bild eines Mausschwanzes mit Implantat nach sechs Monaten, Färbung mit Hämatoxylin-Eosin, 4fache Vergrößerung. Die rot umrandete Fläche wurde als Außenbegrenzung der Entzündung definiert, die Fläche dieser Begrenzung ausgerechnet und von dieser die Innenfläche der Implantat-Gewebe-Grenze subtrahiert, um die Gesamtfläche der Entzündung (E) zu erhalten.

EIGENE UNTERSUCHUNGEN - MATERIAL UND METHODEN

3.4.2.5. Messung der Entzündungszellschichten

Der zuvor deskriptiv ermittelte Entzündungsbereich wurde weiterhin quantifiziert, indem die Hämatoxylin-Eosin-Schnitte der in Paraffin eingebetteten Implantat-Mausschwanzgewebe nach drei, sechs und neun Monaten in vier Quadranten unterteilt wurden. Die Entzündungszellschichten wurden dann innerhalb der zuvor ermittelten Entzündungsfläche entlang dieser Quadranten ausgezählt (Abb. 12).

Abbildung 12: Histologisches Bild eines Implantat-Mausschwanzgewebes nach sechs Monaten. 4fache Vergrößerung, Färbung Hämatoxylin-Eosin. Für die Auszählung der Entzündungszellschichten wurde der Entzündungsbereich deskriptiv ermittelt, der histologische Schnitt in vier Quadranten unterteilt (rote Linien) und die Entzündungszellschichten entlang der Unterteilungsstriche gezählt (s. Insert).

3.4.2.6. Auszählung der Aktin-positiven Gefäße

Es wurden immunhistochemische Färbungen mit Aktin der glatten Muskulatur durchgeführt, um das Ausmaß einer eventuellen Gefäßneubildung zu messen, die durch das Implantat induziert wird. Dazu wurden Aktin-positiv gefärbte Gefäße im zuvor definierten Entzündungsbereich (s. Kap. 3.4.2.4) gezählt (s. Abb. 13).

Abbildung 13: Histologischer Querschnitt eines Mausschwanzgewebes mit Eisenimplantat nach neun Monaten, immunhistochemische Färbung mit Aktin der glatten Muskulatur, 40fache Vergrößerung. In die Auswertung eingegangene positiv gefärbte Gefäße werden exemplarisch mit einem roten Pfeil gekennzeichnet (s.

Insert).

EIGENE UNTERSUCHUNGEN - MATERIAL UND METHODEN

3.4.2.7. Auswertung der Trenndünnschliffe

Die Trenndünnschliffe wurden zur qualitativen Beschreibung der histologischen Präparate herangezogen, da in diesen ein Implantat mit Implantatverbund zerstörungsfrei dargestellt werden kann.