Untersuchung zur histamin- und serotonininduzierten sowie durch passive Sensibilisierung induzierten Bronchokonstriktion an
„Precision Cut Lung Slices“ des Pferdes
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Svenja Wabnitz
Bremen
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. B. Ohnesorge Klinik für Pferde
Prof. Dr. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. B. Ohnesorge Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2010
Meiner lieben Familie
1 Einleitung... 11
2 Literaturübersicht... 12
2.1 Die Lunge ... 12
2.1.1 Innervation der Atemwege... 12
2.1.1.1 Das cholinerge System ... 12
2.1.1.2 Das adrenerge System... 12
2.1.1.3 Das nicht-adrenerge-nicht-cholinerge System (NANC) ... 13
2.1.2 Regulation des Bronchotonus ... 14
2.1.3 Immunologie der Atemwege ... 15
2.1.3.1 Immunologische Abwehrmechanismen... 15
2.1.3.2 Immunglobuline ... 16
2.2 Chronische Atemwegsentzündung beim Pferd ... 19
2.2.1 Bezeichnung der chronischen Atemwegsentzündung ... 19
2.2.2 Klinik/Symptome der COB ... 20
2.2.3 Pathologische Veränderungen und deren Ursache bei der COB ... 20
2.2.4 Immunologie der COB ... 22
2.2.5 Therapie der COB ... 23
2.3 Präzisionslungenschnitte (PCLS) ... 24
2.4 In eigenen Versuchen verwendete Testsubstanzen ... 25
2.4.1 Methacholin ... 25
2.4.2 Histamin ... 28
2.4.2.1 Histaminrezeptoren ... 29
2.4.2.2 Zusammenhang zwischen Histamin und der COB-Problematik ... 32
2.4.2.3 Effekt von Histamin auf die Bronchokonstriktion anhand von PCLS ... 33
2.4.3 4-Methylhistamin ... 33
2.4.4 Histaminantagonisten ... 34
2.4.4.1 H1-Rezeptorantagonisten ... 34
2.4.4.2 H2-Rezeptorantagonisten ... 35
2.4.4.3 H3-Rezeptorantagonisten ... 35
2.4.4.4 H4-Rezeptorantagonisten ... 35
2.4.5 Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT)... 36
2.4.6 Ketanserin ... 38
2.4.7 Passive Sensibilisierung... 38
3 Material und Methode... 43
3.1 Organmaterial ... 43
3.2 Allgemeiner Versuchsablauf ... 43
3.2.1 Klinische und weiterführende Untersuchungen ... 44
3.2.2 Euthanasie und Entnahme des Lobus accessorius ... 48
3.3 Präparation der PCLS... 49
3.3.1 Befüllen des Lobus accessorius ... 49
3.3.2 Schneiden der PCLS ... 50
3.3.3 Aussortieren und Aufbereiten der PCLS... 50
3.4 Versuche an equinen PCLS ... 52
3.4.1 Herstellung der verwendeten Bronchokonstriktoren und Rezeptorantagonisten ... 52
3.4.2 Versuchsablauf... 53
3.4.3 Durchführung der Histaminkonzentrationsreihe... 54
3.4.4 Durchführung des 4-Methylhistamin-Versuchs ... 54
3.4.5 Durchführung der Serotoninkonzentrationsreihe ... 54
3.4.6 Versuchsdurchführung für die passive Sensibilisierung ... 55
3.4.7 Auswertung ... 56
4 Ergebnisse ... 57
4.1 Präparate ... 57
4.2 Versuche ... 57
4.2.1 Nachweis der Vitalität ... 57
4.2.2 Bronchokonstriktion durch Histamin ... 58
4.2.3 Effekt von Histaminantagonisten auf die histamininduzierte Bronchokonstriktion ... 61
4.2.4 Effekt von 4-Methylhistamin ... 61
4.2.5 Effekt von Serotonin und dem Serotoninrezeptorantagonisten Ketanserin ... 62
4.2.6 Effekt der passiven Sensibilisierung auf die Bronchokonstriktion... 63
5 Diskussion ... 66
5.1 Anmerkung zur Methodik... 69
5.1.1 Histamin und Histaminrezeptorantagonisten ... 70
5.1.1.1 Histaminwirkung ... 70
5.1.1.2 Effekt der Histaminrezeptorantagonisten ... 71
5.1.2 Versuche mit 4-Methylhistamin und dem H4-Antagonist JNJ7777120 ... 74
5.1.3 Serotonin und Serotoninrezeptorantagonisten ... 75
5.1.4 Passive Sensibilisierung... 76
6 Zusammenfassung ... 79
7 Summary ... 82
A. Arteria
AA Arachidonsäure
AaDO2 alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz
Abb. Abbildung
ACE Angiotensin converting enzyme
Ach Acetylcholin
AST Aspartat-Amino-Transferase
ATPase Adenosintriphosphatasen
Az. Aktenzeichen
BAL bronchoalveoläre Lavage
°C Grad Celsius
ca. circa
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CD cluster of differentiation
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
CK Creatin-Kinase
cm Zentimeter
COB chronisch obstruktive Bronchitis COLD chronic obstructive lung disease COPD chronic obstructive pulmonary disease
DAG 1,2-Diacylglycerol
d.h. das heißt
EC50 mittlere effektive Konzentration, die zu 50 % Lumenreduktion führt
ED effektive Dosis
EHV equines Herpesvirus
eNANC exzitatorisches nicht-adrenerges-nicht-cholinerges-System
evtl. eventuell
exspirator. exspiratorisch
FIT funktioneller In-vitro Test
FLAP 5-Lipoxygenase aktivierendes Protein
g Gramm
ggr geringgradig
GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor GOT Glutamat-Oxalacetat-Transferase
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor GRK G-Protein-gekoppelte Rezeptor Kinase γ-GT Gamma-Glutamyl-Transferase
HIPT Histamin-Inhalation-Provokationstest
HPLS Hemiplegia laryngis sinistra H-Rezeptor Histaminrezeptor
5-HT 5-Hydroxytryptamin
IAD inflammatory airway disease
ICR Intercostalraum
I.E. Internationale Einheit
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
i.m. intramusculär
iNANC inhibitorisches nicht-adrenerges-nicht-cholinerges-System IP3 Inositol 1,4,5-Triphosphat
i.v. intravenös
JNJ7777120 1-[(5-Chloro-1Hindol-2-yl)carbonyl]-4-methylpiperazin
K-Kanal Kaliumkanal
kg Kilogramm
klin. klinisch
KGW Körpergewicht
l Liter
LDH Laktatdehydrogenase
LT Leukotrien
Lymphos Lymphozyten
Makros Makrophagen
MAP-Kinase Mitogen-Activated Protein
max. maximal
MCh Methacholin
mgr mittelgradig
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
min. Minuten
ml Milliliter (10-3 l)
MLCK Myosin-Leichtketten-Kinase
mm Millimeter
mmHg Millimeter Quecksilbersäule mmol Millimol (10-3 mol)
mol Molekulargewicht
M-Rezeptor muscarinerge Rezeptoren mRNA messenger Ribonukleinsäure
µg Mikrogramm (10-6 g)
µl Mikroliter (10-6 l)
µmol Mikromol (10-6 mol)
(n=…) Anzahl der Einzelbeobachtungen
N. (vagus) Nervus
NA Nasenausfluss
NANC nicht-adrenerg-nicht-cholinerges System nCOB nicht an COB erkrankt
NEP Neuropeptidrezeptor
Neutros neutrophile Granulozyten
NFκB nuclear factor ‚kappa-light-chain-enhancer’ of activated B-cells NK natürliche Killerzellen
NO Stickstoffmonoxid
Nr. Nummer
OP Operation
p Wahrscheinlichkeit mit der die Hypothese nicht zutrifft PBS-Lösung Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCLS precious cut lung slices pCOB positiv (an COB erkrankt) PGE2 Prostaglandin E2
PIP2 Phosphoinositol 4,5-Biphosphat
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PLA2 Phospholipase A2
PLC Phospholipase C
RAO Recurrent Airway Disease
Rho Protein, das in Prokaryoten die RNA-Transkription beenden kann
RNA Ribonukleinsäure
sec. Sekunde
sIgA sekretorisches IgA
SOD Superoxiddismutase
SPAOPD Summer Pasture Airway Obstructive Pulmonary Disease
spez. spezifisch
Tab. Tabelle
TBS Tracheobronchialsekret
TH-Zellen T-Helferzellen
TNF Tumor Nekrose Faktor
WHO World Health Organization
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentralnervensystem
1 Einleitung
Chronische Atemwegserkrankungen spielen seit vielen Jahren eine große Rolle in der Pferdemedizin. Obwohl es wirksame Therapiemöglichkeiten gibt, wie zum Beispiel das Clenbuterol, ist die für eine Linderung der klinischen Symptome notwendige langfristige Anwendung aufgrund einer Wirksamkeitsabnahme begrenzt.
Zur Entwicklung neuer erfolgsversprechender Therapiemöglichkeiten ist ein Verständnis der Entstehung entzündlicher Prozesse und der Veränderungen physiologischer Gegebenheiten notwendig, um die krankheitsbedingten teilweise irreversiblen Veränderungen auf Dauer zu verhindern.
Die PCLS-Methodik („Precision Cut Lung Slices“) wurde von MARTIN et al. (1996) an humanen und murinen Lungen erstmals angewendet und von VIETMEIER (2004) für die Pferdelunge etabliert. In drei weiteren Arbeiten (BARTON 2005, SCHWALFENBERG 2007 und FUGAZZOLA 2009) wurde die Methodik für die Erstellung equiner PCLS optimiert. Die PCLS-Technik ermöglicht die Untersuchung von bis zu 40 Präparaten, die aus einer Lunge gewonnen werden können. Mit Hilfe der PCLS-Technik kann die Reaktion der kleinen Atemwege auf den Kontakt mit verschiedenen Wirkstoffen sowie die Beeinflussung durch die spezifischen Rezeptorantagonisten direkt beobachtet werden.
Ziel der vorliegenden Studie war es, anhand von Präzisionslungenschnitten des Pferdes zu testen, ob Histamin und/oder Serotonin an der Bronchokonstriktionsinduktion beteiligt sind und damit relevant für die COB-Therapie sein könnten. Außerdem wurde das an Ratten etablierte Modell der passiven Sensibilisierung an den equinen PCLS getestet.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Lunge
2.1.1 Innervation der Atemwege
Die Innervation der Atemwege ist ein komplexer Vorgang, an dem verschiedene Systeme, wie das cholinerge, das adrenerge und das nicht-adrenerge-nicht- cholinerge System, beteiligt sind. Sie regulieren den Muskeltonus und die Sekretion, beeinflussen den Blutfluss und die Permeabilität an den Gefäßen und üben bei einer Entzündung einen verstärkenden oder modulierenden Effekt aus. Die wichtigste Funktion der Muskulatur ist das Aufrechterhalten des Lumens der Atemwege und die Optimierung der Balance zwischen dem Atemwegswiderstand und dem physiologischen Totraum (MATERA et al. 2002).
2.1.1.1 Das cholinerge System
Das cholinerge (parasympathische) System ist an den Atemwegen ein exzitatorisch wirkendes System (ROBINSON et al. 1996). Seine Nervenfasern verlaufen als Nervus vagus, der durch seine Verzweigungen lokale Ganglien in der Alveolarwand bildet. Von hier werden postganglionäre Nervenfasern entlassen, die zu der Atemwegsmuskulatur und den submukösen Drüsen führen. Der Transmitter des cholinergen Systems ist das Acetylcholin (Ach), das an der postsynaptischen Membran seine Wirkung über nicotinerge Ganglien oder muscarinerge Rezeptoren ausübt (BARNES 1991).
Bei einer Entzündung der Atemwege wird vermehrt Acetylcholin freigesetzt, wodurch ein erhöhtes cholinerges Signal und dadurch eine Bronchokonstriktion induziert wird (BARNES 1991; WANG und KOTLIKOFF 2000).
2.1.1.2 Das adrenerge System
Das adrenerge System übt seine Wirkung über das Noradrenalin aus, das an α- und β-Rezeptoren binden kann (ROBINSON et al. 1996). Der α2-Rezeptor reduziert die
Acetylcholinfreisetzung an den cholinergen Nerven. Da durch den β2-Rezeptor eine Bronchodilatation hervorgerufen wird, stellt dieser Rezeptor einen Angriffspunkt in der COB-Therapie dar (JOHNSON 1998).
2.1.1.3 Das nicht-adrenerge-nicht-cholinerge System (NANC)
Das nicht-adrenerge-nicht-cholinerge System trägt seinen Namen, da die neuronal vermittelten Signale nicht über adrenerge oder cholinerge Rezeptorantagonisten geblockt werden können, sondern über Neuropeptide, die in den Ganglien synthetisiert und zu den peripheren Nervenenden transportiert werden. Dort spielen sie eine neuromodulatorische Rolle. Das NANC-System wird in ein exzitatorisches und ein inhibitorisches System unterteilt (BARNES 1991).
2.1.1.3.1 Das exzitatorische System (eNANC)
Bei dem exzitatorischen System wirkt die Substanz P als Transmitter über einen Neuropeptidrezeptor. Dieser Rezeptor befindet sich auf kleinen Bronchialgefäßen, tracheobronchialen Drüsen und dem Atemwegsepithel (BARNES 1990). Unter physiologischen Bedingungen besitzt dieses System keine Auswirkung auf den Muskeltonus. Erst nach der Stimulation mit einem Antigen wird durch die Substanz P der Durchmesser der Atemwege reduziert und die Mukussekretion erhöht. Die Metabolisierung des Neurotransmitters erfolgt durch das Angiotensin-converting- enzyme (ACE) oder durch die neutrale Endopeptidase (NEP), die sich beide im Lungenepithel befinden (MATERA et al. 2002).
Durch immunohistochemische Studien an equinem Bronchialgewebe wurde die Existenz von Nervenfasern demonstriert, die immunoreaktiv für die Substanz P sind.
Im Vergleich zu erwachsenen Pferden zeigen neonatale Fohlen ein vermehrtes Vorkommen dieser Fasern. Es wird vermutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Geburt oder der post-natalen Atmungsadaptation spielen (SONEA et al. 1994).
2.1.1.3.2 Das inhibitorische System (iNANC)
Das inhibitorische System moduliert die exzitatorische Atemwegsantwort und antagonisiert die parasympathische (cholinerge) Erregungsübertragung durch eine vermutlich überlappende Innervation und einer gleichzeitigen Entlassung des Neurotransmitters, wodurch es zu einer Bronchodilatation kommt (BELVISI et al.
1994). Als Neurotransmitter des inhibitorischen Systems fungiert das Stickstoffmonoxid (NO), dessen Wirkung cGMP vermittelt ist.
Die Innervation des inhibitorischen Systems ist tierartlich unterschiedlich und variiert innerhalb einer Spezies entlang des Tracheobronchialbaums. Da das iNANC beim Pferd nur die Trachea und die zentralen Bronchien reguliert, hat es für die Entwicklung der tiefen Atemwegsentzündung keine Bedeutung (BARNES 1993;
MATERA 1998).
2.1.1.3.3 Andere Mediatoren
Zusätzlich zu den genannten Systemen können an den Atemwegsnerven verschiedene Entzündungsmediatoren die Freilassung von Neurotransmittern modulieren und somit ihre Antwort verändern. Bei der COB des Pferdes erhöhen bereits geringe Mengen von Histamin und Serotonin die Acetylcholinfreisetzung, so dass eine cholinerge Atemwegsobstruktion verursacht werden kann (HEY et al.
1992).
Neben der Barrierefunktion besitzt das Atemwegsepithel die Möglichkeit, die Aktivität der Atemwegsmuskulatur über die Sekretion verschiedener Substanzen und Enzyme zu modulieren. Eine inhibitorische Wirkung auf die Muskulatur üben zum Beispiel der epithelium-derived-relaxing-factor, das PGE2 und das bereits im vorherigen Absatz erwähnte NO aus. Enzyme, wie die Acetylcholinesterase, Histaminasen oder Peptidasen inaktivieren zum Beispiel kontraktile Agonisten.
2.1.2 Regulation des Bronchotonus
Die Regulation des Bronchotonus und der Mukussekretion erfolgt über Acetylcholin, das nicht nur als Neurotransmitter des parasympathischen Systems aus dem Nervus
vagus, sondern auch aus nicht-neuronalen Zellen, wie epithelialen und endothelialen Zellen, glatten Atemwegsmuskelzellen und Entzündungszellen freigesetzt wird (RACKE und MATTHIESEN 2004; KUMMER et al. 2008). Bei den nicht-neuronalen Zellen fehlen die Speicherformen für Acetylcholin. Ihr Freisetzungsmechanismus ist ein aktiver Transport über einen Kanal, der zur Familie der organischen Kationen- Transporter gehört. Die nicht-neuronalen Zellen leisten durch ihre Acetylcholinfreisetzung einen Beitrag zur Kontrolle der epithelialen Zelladhäsion, der Zell-Zell-Interaktion und Proliferation und zur Regulation der epithelialen Schichtintegrität (RACKE und MATTHIESEN 2004).
Acetylcholin ist ein autokriner oder parakriner Transmitter, der mit Hilfe der Acetyltransferase aus Cholin und Acetyl-CoA in Mitochondrien der Nervenenden synthetisiert wird. Das Cholin gelangt über einen Cholintransporter, der sich an der präsynaptischen Membran befindet, aus dem synaptischen Spalt in die Nervenenden. Das gebildete Acetylcholin wird über einen vesikulären Acetylcholin- Transporter in synaptische Vesikel aufgenommen und gespeichert.
Nach der Depolarisation des Nervens, ausgelöst durch ein Aktionspotential, kommt es zum Calciumeinstrom in die Nervenenden. Das einströmende Calcium verursacht die Verschmelzung der Vesikel mit der Zellmembran und die exozytotische Freisetzung des Acetylcholins in den synaptischen Spalt. An der postsynaptischen Membran der Zielzelle, kann Acetylcholin seine Wirkung über einen cholinergen Rezeptor ausüben. Die Wirkdauer des Acetylcholins wird durch die vom cholinergen Neuron selbst produzierte Acetylcholinesterase begrenzt, die Acetylcholin zu Acetat und Cholin abbaut. Im Anschluss wird das Cholin erneut über die präsynaptische Membran aufgenommen (RACKE und MATTHIESEN 2004; KUMMER et al. 2008).
2.1.3 Immunologie der Atemwege
2.1.3.1 Immunologische Abwehrmechanismen
Auf das Eindringen eines Krankheitserregers in den Körper reagieren zunächst die Zellen des angeborenen Immunsystems. Makrophagen setzen Cytokine und Chemokine frei, die das Verhalten anderer Zellen beeinflussen und weitere
Entzündungszellen aus dem Plasma anlocken. Für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems muss der Krankheitserreger als körperfremd erkannt werden. Es kommt zur Aufnahme und zum Abbau durch phagozytierende Zellen, wie z.B.
dendritische Zellen. Die entstandenen Antigene werden über membrangebundene Glykoproteine, die von einer Gruppe von Genen mit der Bezeichnung Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) codiert werden, den Zellen des adaptiven Immunsystems präsentiert. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, die sich in der Herkunft der Proteine, die sie einfangen und präsentieren und in der Zellart, die sie aktivieren, unterscheiden. Das MHC-Klasse-I-Molekül bindet Proteine, die im Cytosol synthetisiert werden und reagiert mit dem CD8-Corezeptor, der sich auf zytotoxischen T-Zellen befindet. Diese T-Zellen töten jede Zelle, die körperfremde Peptide präsentiert. Das MHC-Klasse-II-Molekül bindet Proteine in membrangebundenen Vesikeln innerhalb der Zelle und interagiert mit dem CD4- Corezeptor, der sich auf TH1- und TH2-Zellen befindet. Diese Zellen aktivieren andere Effektorzellen des Immunsystems, wie zum Beispiel Makrophagen oder B- Zellen. Während die Makrophagen Erreger töten, die sich in den antigenpräsentierenden Zellen befinden, sezernieren die B-Zellen Immunglobuline gegen körperfremde Moleküle (JANEWAY et al. 2002).
2.1.3.2 Immunglobuline
Die Antikörper des Immunsystems werden durch die Antigen-induzierte Stimulierung der B-Zellen gebildet. Sie besitzen ein Fab-Fragment, die variable Region, das der Antigenerkennung dient und ein Fc-Fragment, die konstante Region, das die Funktion und den Isotypen des Antikörpers bestimmt (LUNN 2007). Nach der Antigenbindung an einen Antikörper wird eine Konformationsänderung im Fc-Teil des Immunglobulins induziert, die es ihm ermöglicht an einen Rezeptor zu binden, der sich auf einer Entzündungszelle befindet und somit die Zelle zu aktivieren.
Die Erforschung des Immunglobulinsystems des Pferdes begann in den sechziger Jahren. Während zunächst sechs Isotypen differenziert (IgM, IgA und vier IgG- Typen) wurden, wurde das Immunglobulinsystem in den neunziger Jahren durch IgE und zwei weitere IgG-Typen ergänzt. Bis heute sind beim Pferd insgesamt sieben
IgG-Isotypen bekannt (ROHWER 2004). Vier von diesen IgG-Subtypen konnten mit Hilfe monoklonaler Antikörper identifiziert werden und erhielten die Bezeichnung IgGa, IgGb, IgGc und IgG(T). Das IgG(T) besitzt seinen Namen, da es erstmals im Serum eines mit Tetanustoxoid immunisierten Pferdes gefunden wurde (LUNN 2007). Bei einem Workshop in Schweden (2001) wurde eine neue Nomenklatur für die IgG-Subtypen festgelegt, bei der die Buchstaben durch Zahlen ersetzt wurden.
IgGa entspricht IgG1 und IgG2, IgG(T) IgG3 und IgG4, IgGb IgG4 und IgGc entspricht IgG6 (ROHWER 2004).
2.1.3.2.1 IgG
Bei fast allen Säugetieren kommt IgG am häufigsten im Blut vor. Außerdem findet man hohe Konzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit und im Schleimhautepithel vom Darm- und Respirationstrakt.
Die Ursache für die Vielzahl an IgG-Subtypen sind die verschiedenen konstanten Domänen, die von unterschiedlichen IGHG-Genen kodiert werden (WEGE 2004).
Diese IGHG-Gene können den einzelnen Immunglobulin-Isotypen zugeordnet werden (ROHWER 2004).
Essentiell für die Funktion und die Immunkompetenz des IgG ist die Interaktion des Fc-Teils mit seinem Rezeptor, die zur Opsonisierung von Pathogenen für die Aufnahme von Phagozyten, zur Neutralisierung von Toxinen, zur Sensibilisierung von Mastzellen, zur Aktivierung von B-Zellen, zur Antikörperproduktion und zur Aktivierung des Komplementsystems führt. Bei Fehlen der genetischen Information für die γ-Einheit des Fc-Rezeptors zeigt sich eine starke Immunsuppression mit einer reduzierten Effektivität der natürlichen Killerzellen, der Makrophagen, der Phagozyten und der Mastzellen (ROHWER 2004).
2.1.3.2.2 IgE
Als Reaktion auf ein Antigen wird IgE mit kurzer Serumhalbwertszeit von den B- Zellen unter dem Einfluss von TH2-Zellen synthetisiert. IgE ist das einzige Immunglobulin, das im Körper auch ohne Antigen in gebundener Form vorliegt und
aufgrund des Fcε-RI-Rezeptors (FcεRI) in ungebundener Form nur in geringer Konzentration vorkommt (ROHWER 2004). Dieser hoch-affine Rezeptor gehört zu der Immunglobulin-Superfamilie und ist auf Mastzellen, bronchialen Epithelzellen, dendritischen Zellen, Monozyten und eosinophilen Zellen zu finden. IgE bindet ebenfalls an einen niedrig-affinen Rezeptor (FcεRII), der mit dem hoch-affinen nicht verwandt ist und sich auf Makrophagen und Lymphozyten befindet (JANEWAY et al.
2002; VAN DER HAEGEN et al. 2005). Durch die antigenbedingte Kreuzvernetzung zweier benachbarter IgE-Moleküle wird die Degranulation der Zelle verursacht. Es kommt zur Ausschüttung von inflammatorischen Lipidmediatoren, Cytokinen und Chemokinen (BARNES 1991). Die sezernierten Mediatoren sind nicht unmittelbar für die Bronchokonstriktion verantwortlich, sie erhöhen jedoch die Reaktionsbereitschaft der Atemwegsmuskelzellen und bewirken eine Sensibilisierung gegenüber unspezifischen Stimuli (HENJAKOVIC et al. 2008).
Es wird vermutet, dass die Rezeptordichte direkt oder indirekt durch die freie Plasma-IgE-Konzentration bestimmt wird. MACGLASHAN et al. (1997) stellten fest, dass die Anzahl der besetzten Rezeptoren sowohl bei gesunden als auch bei kranken Menschen bei 104-106 pro basophilen Granulozyten lag, während die Anzahl der unbesetzten Rezeptoren konstant blieb. Als mögliche Erklärung wird eine Neubildung der Rezeptoren vermutet, die durch die Bindung des IgE an den Rezeptor stimuliert wird. Daraus lässt sich folgern, dass eine Down-Regulation der Rezeptoren über die Senkung der IgE-Konzentration beeinflusst werden kann.
ROHWER (2004) bestätigt diese Beobachtung beim Pferd, bei dem ebenfalls durch die Bindung des Immunglobulins an seinen Rezeptor die Bildung neuer Rezeptoren induziert und dadurch eine Reduktion des freien IgE ausgelöst wurde.
2.1.3.2.3 IgA
IgA ist wie IgM, das als erster Antikörper während einer akuten Infektionsphase sezerniert wird, ein multimerisches Molekül, das aus mehreren Untereinheiten besteht. Es wird von der Mukosa der Atemwege produziert und schützt den Körper vor Bakterien und Viren. IgA-produzierende Plasmazellen befinden sich hauptsächlich in den oberen und nur in geringen Mengen in den tiefen Atemwegen,
während IgG-produzierende Zellen in den unteren Atemwegen vermehrt auftreten (LUNN 2007).
2.2 Chronische Atemwegsentzündung beim Pferd
2.2.1 Bezeichnung der chronischen Atemwegsentzündung
Da der Begriff der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) nur eine Atemflusslimitierung und keine Atemwegsobstruktion, wie es bei der chronischen Atemwegsentzündung der Fall ist, beschreibt, wird dieser Begriff seit einem Treffen internationaler Pferde-Pneumologen im Jahr 2000 nicht mehr verwendet (GOLD 2003). Die Bezeichnungen „Recurrent Airway Obstruction“ (RAO) oder „Heaves“
beschreiben die Entzündung der Atemwege exakter (ROBINSON 2001), wobei
„Heaves“ nicht als Diagnose verwendet wird, da dieser Begriff nur das Symptom des erschwerten Anhebens der Bauchdecke während der Exspiration beschreibt.
Der Begriff RAO bezeichnet die Atemwegsobstruktion erwachsener Pferde, die sich bei veränderten Umgebungsbedingungen oder der Gabe von Bronchodilatatoren als reversibel erweist. Die Verbesserung der klinischen Symptomatik dauert mehrere Wochen und wird als Remission bezeichnet. Die Vorraussetzung für die definitive Diagnose RAO ist die Reproduzierbarkeit der Symptomatik nach Verbringen in die alte Umgebung oder der Inhalation organischer Stäube, wie Schimmelpilze. Die akute Verschlechterung des Pferdes wird als RAO-Exazerbation bezeichnet.
Definiert ist sie durch eine funktionelle Beeinträchtigung und eine Atemwegsentzündung, bei der die Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der BAL deutlich erhöht ist (>25%). Diese Veränderungen können durch eine spezielle klinische Untersuchung der Atemwege nicht diagnostiziert werden, so dass die RAO- Bezeichnung im eigentlichen Sinne unter Praxisbedingungen nicht verwendet werden kann.
Der Begriff der chronisch obstruktiven Bronchiolitis oder Bronchitis (COB) beschreibt die Atemwegsentzündung anhand ihrer Dauer, Lokalisation und entzündlichen Genese. Durch eine Entzündung kommt es zur Verengung der Atemwege, die durch Schleimhautschwellungen, Hyper- bzw. Dyskrinie und Bronchospasmus
gekennzeichnet ist. Klinisch wird die Bezeichnung der chronisch obstruktiven Bronchitis bei Pferden mit Leistungsmangel verwendet, wenn klinisch oder endoskopisch eine Atemwegsverengung diagnostiziert wurde. Die Bezeichnung Bronchiolitis, die zu Beginn der Erkrankung auftritt, kann durch die Bezeichnung Bronchitis ersetzt werden, denn zum Zeitpunkt der Diagnose ist die Ausbreitung der Krankheit so weit fortgeschritten, dass nicht nur die Bronchioli sondern auch die Bronchien betroffen sind (FEY 2006).
2.2.2 Klinik/Symptome der COB
Klinische Symptome, je nach Schweregrad der COB, sind Hustenanfälle, beidseitiger mukopurulenter Nasenausfluss, Tracheal- oder Lungengeräusche, eine doppelschlägige Ausatmung, reversible Atemwegsobstruktionen, Atemnot und eine reduzierte Leistungsbereitschaft (VAN DER HAEGEN et al. 2005). Es entsteht eine Hyperreaktivität, eine gesteigerte Reaktionsbereitschaft der Bronchien gegenüber Partikeln, auf die gesunde Pferde nicht reagieren. Ursache sind irreversible Schädigungen am Epithel, die dazu führen, dass sensorische Nerven freiliegen und dadurch dauerhaft gereizt werden (BARNES 1996).
Bei der Bronchoskopie ist eine Hyperämie und Schwellung der Schleimhaut, sowie eine erhöhte mukopurulente Sekretion zu sehen. In der BAL sind die neutrophilen Zellen erhöht (VAN DER HAEGEN et al. 2005).
2.2.3 Pathologische Veränderungen und deren Ursache bei der COB
Bei der COB ist die autonome Innervation der Atemwegsmuskulatur verändert. Es besteht eine Imbalance zwischen dem über muscarinerge Rezeptoren wirkenden exzitatorischen parasympathischen System und dem inhibitorischen sympathischen System, das über ß-Rezeptoren wirkt (ABRAHAM et al. 2001). Die hemmende, nicht- adrenerge-nicht-cholinerge Antwort ist reduziert. Die Bronchorelaxation ist bei der COB negativ beeinträchtigt, da es durch die COB zu einer Entkopplung des ß- Rezeptors vom Gs-Protein-Adenylat-Zyklase-System und damit zu einer reduzierten Aktivierung der Adenylatzyklase kommt.
In einem equinen COB-Modell konnte dargestellt werden, dass die ß-Rezeptoren eine Dysfunktion aufgrund proinflammatorischer Zytokine entwickeln, die während des Entzündungsprozesses freigesetzt werden. Das IL-1ß induziert eine Reduktion der Adenylatzyklaseaktivität sowie der Rezeptoranzahl, die ebenfalls durch die pathologischen Veränderungen, wie die Fibrose, hervorgerufen wird (ABRAHAM et al. 2006).
Der Tonus des Parasympathikus ist bei der COB erhöht, wodurch eine verstärkte Acetylcholinfreisetzung, ein Anstieg der muscarinergen Rezeptoren und eine Erhöhung von Entzündungsmediatoren ausgelöst wird, die die Spannung der Muskelzellen erhöhen und die Kontraktion verursachen.
Acetylcholin ist für das Remodeling verantwortlich, das eine pathologische Veränderung der Atemwege als Konsequenz einer chronischen Fehlsteuerung der Atemwege beschreibt. Der Umfang der Atemwegsveränderung ist von der Schwere und der Dauer der Krankheit abhängig (BILLINGTON und PENN 2003; KAUP et al.
1990a, b).
Durch die entzündungsbedingte vermehrte Freisetzung von Wachstumsfaktoren ist die Masse der Bronchialmuskulatur erhöht und es kommt zu einer Epithelzellhyperplasie mit einer Reduktion der zilientragenden Zellen (KAUP et al.
1990a; ROBINSON et al. 1996). Außerdem ist die subepitheliale Kollagenablagerung verstärkt (BILLINGTON und PENN 2003). In den Alveolarsepten findet sich eine alveoläre Fibrose und eine Nekrose der Pneumozyten vom Typ I, die Bestandteil der Blut-Luft-Schranke und damit an dem Gasaustausch beteiligt sind. Die nekrotisierten Pneumozyten vom Typ I werden durch Pneumozyten vom Typ II ersetzt, die zur Surfactantbildung befähigt sind (KAUP et al. 1990b; ROBINSON et al. 1996). Die Atemwegswand ist ödematös verdickt und mit Entzündungszellen infiltriert. Das Atemwegsepithel wird durch Proteasen und Entzündungszellen abgebaut und im Lumen befinden sich Entzündungszellen und abgelöste Epithelzellen (BARNES 1996; KAUP et al. 1990b).
Die Bronchialschleimzusammensetzung verändert sich durch die Erhöhung der schleimproduzierenden Becherzellen und der reduzierten Anzahl an Clarazellen, die den serösen Sekretanteil liefern. Die mukoziliäre Clearance wird durch das zähere
Bronchialsekret, das von den dadurch geschädigten Flimmerhärchen nicht mehr abtransportiert werden kann, negativ beeinflusst (KAUP et al. 1990a).
Desweiteren vergrößert sich der Durchmesser der Blutgefäße, wodurch sich der lokale Blutfluss verstärkt und die Fließgeschwindigkeit verringert. Die Endothelzellen exprimieren Adhäsionsmoleküle, die zirkulierende Leukozyten binden und ihnen damit die Einwanderung ins Gewebe ermöglichen.
Die Gesamtheit dieser Veränderungen führt zu einem erhöhten Atemwegswiderstand und somit zu einer erschwerten Atemtätigkeit und einer reduzierten Leitfähigkeit der Luft (BILLINGTON und PENN 2003).
2.2.4 Immunologie der COB
Die immunologischen Mechanismen der COB sind noch nicht vollständig erschlossen und die Rolle des IgE ist bisher unklar.
Anhand einer Studie an COB erkrankten Pferden wurde die Vermutung geäußert, dass die IgE vermittelte TypI-Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp, die nach einer halben bis einer Stunde einsetzt, beim Pferd nicht den hauptsächlichen immunologischen Mechanismus für die COB-Entstehung darstellt. Die Autoren halten die Immunkomplex vermittelte TypIII-Spätreaktion, die nach vier bis zehn Stunden einsetzt sowie die TypIV-verzögerte Reaktion, die nach 24 bis 48 Stunden einsetzt, für die eigentlichen Mechanismen der COB-Pathogenese (TAHON et al. 2009).
TRAUB (2005) schließt die Beteiligung der TypI-Immunreaktion an der COB nach den Ergebnissen der von ihr geprüften Allergenpräparationen aus, denn trotz der deutlich nachweisbaren TypI-allergischen Sensibilisierung der basophilen Granulozyten im Blut der Pferde wurde keine Korrelation zu den klinischen Erkrankungsformen gezeigt. Hierbei bleibt zu berücksichtigen, dass auch andere, als die in dieser Studie geprüften Allergene zur Reaktion führen können, so dass eine TypI-Reaktion nicht vollständig ausgeschlossen werden kann.
Auch LUNN (2007) schließt die klassische TypI-Reaktion als zentralen Mechanismus der COB-Pathogenese aus, da eine frühe IgE vermittelte Mastzellreaktion fehlt. Die erhöhten IgE-Spiegel könnten ein Resultat genetischer Faktoren sein. Eine TypIII-
Reaktion, bei der eine Präsensibilisierung erforderlich ist, wird ebenfalls nicht als Ursache der COB vermutet.
ROHWER (2004) hat in einer Studie gezeigt, dass Mastzellen und basophile Zellen eine zentrale Rolle bei der allergischen Reaktion spielen. Über die Immunglobulin- Isotypen, ihre Bindung an die Fc-Rezeptoren und die Aktivierung ist jedoch bisher wenig bekannt.
2.2.5 Therapie der COB
Eine möglichst frühzeitige Diagnose ist für eine erfolgreiche Therapie notwendig, da Verengung des Bronchiallumens durch Schleim und entzündliche Exsudate nur therapiert werden können, wenn sie sich noch nicht organisiert haben.
Der Bronchospasmus ist ein physiologischer Mechanismus der Atemwege zum Schutz vor eindringenden Erregern. Bei der COB ist der Bronchospasmus eine krankhafte Erscheinung, die mit dem β2-Sympathomimetikum Clenbuterol therapiert werden kann. Ein Nachteil von β-agonistischen Pharmaka ist die reduzierte Ansprechbarkeit der β-Rezeptoren nach einer Langzeittherapie. Dieses Phänomen wird als Desensibilisierung oder Toleranz bezeichnet und beruht auf einer Entkopplung des Rezeptor-Adenylatzyklase-Systems, die zu einer intrazellulären Sequestrierung (Internalisierung) des Rezeptorkomplexes in submembranöse Kompartimente oder Vesikel der Zelle führt. Durch Regeneration oder endgültigen Abbau (down-Regulation) des Rezeptors in diesen Zellkompartimenten sinkt die Rezeptordichte bei einem gesunden Pferd bereits nach 48 Stunden. Nach dem Absetzen des Pharmakons erholt sich die Rezeptorenzahl langsam und erreicht nach vier Tagen ihre ursprüngliche Dichte.
Die Anwendung von Glukokortikoiden führt zu einer schnellen Wiederherstellung der Rezeptorendichte durch die Regeneration bzw. die Reexposition der internalisierten Rezeptoren. Durch eine erhöhte Transkription der Rezeptor-mRNA übersteigt die Rezeptorzahl sogar die ursprüngliche Anzahl. Bei gleichzeitiger Gabe eines Glukokortikoids mit dem β2-Agonisten wird die Desensibilisierung verhindert (ABRAHAM et al. 2001).
Die Bronchialschleimsekretion besitzt die physiologische Aufgabe der Fremdstoffeliminierung. Die mukoziliäre Clearance ist bei der COB durch die krankheitsbedingte Erhöhung des viskösen Bronchialschleimanteils reduziert, der auf unterschiedliche Weise therapiert werden kann. Sekretolytika, wie Dembrexin, erhöhen die Surfactantsynthese und senken die Bronchialschleimadhäsion, so dass durch die Schleimverflüssigung die Zilienaktivität erhöht und damit der Sekretabtransport verbessert wird. Mukolytika, wie Acetylcystein, senken die Viskosität des Bronchialschleims durch die Spaltung der Mukopolysaccharide und der Mukoproteine. Sekretomotorika, wie Clenbuterol, erhöhen die Aktivität des Flimmerepithels. Eine weitere sekretolytische Therapiemethode ist die Hyperinfusionstherapie, die jedoch nur dann angewandt werden kann, wenn weniger als ein Drittel des Lumens verlegt ist. Die Hyperinfusionstherapie verursacht eine Hypervolämie, die den osmotischen Druck senkt und zu einer pulmonalen Hypertonie führt. Es wird ein passiver Übertritt von Flüssigkeit aus dem Blut in die Alveolen verursacht, die den Schleim verflüssigt und somit den Abtransport vereinfacht. Die Infusionsrate muss die Ausscheidungskapazität der Niere überschreiten, sollte jedoch nicht über 10 Liter pro Stunde betragen (DEEGEN 1981).
Die Schleimhautschwellung, die zu einer Einengung des Lumens führt, ist durch ein entzündliches Ödem bedingt, dass mit Glukokortikoiden therapiert werden kann, die eine abschwellende Wirkung besitzen.
2.3 Präzisionslungenschnitte (PCLS)
Die von MARTIN et al. (1996) und WOHLSEN et al. (2003) am Menschen und einigen Tieren entwickelte PCLS-Methodik wurde von VIETMEIER (2004) für die Pferdelunge etabliert. Equine PCLS („Precision Cut Lung Slices“) werden genutzt, um die Reaktion der Atemwege auf die Zugabe verschiedener bronchokonstriktorischer Pharmaka direkt verfolgen zu können. Die PCLS vom Rind erweisen sich als nützlich für Infektionsstudien, z.B. mit dem bovinen Parainfluenzavirus 3. Die Reaktion bzw. die Veränderungen der Atemwege, die das Virus nach der Inkubation mit den PCLS hervorgerufen hat, konnten per Mikroskop deutlich beobachtet werden (GORIS et al. 2009).
Die Reaktion der PCLS ist auf das gesamte Organ reproduzierbar. Um eine Streuung der Ergebnisse zu verhindern, muss auf eine einheitliche Schichtdicke der PCLS geachtet werden (WOHLSEN et al. 2001), wobei dünnere PCLS zu weniger Artefakten führen (MARTIN et al. 1996).
Durch die hohe Anzahl an Präparaten aus nur einem Probanden können verschiedene Substanzen am selben Tier getestet werden und die Zahl der verwendeten Tiere reduziert werden (EBSEN et al. 2002; HENJAKOVIC et al. 2008).
Unter standardisierten Zellkulturbedingungen überleben die PCLS einen Tag, wobei durch Anlegen einer dynamischen Organkultur die Überlebensdauer auf mindestens drei Tage verlängert werden kann (WOHLSEN et al. 2003). Anhand der Atemwege von Rindern wurde beschrieben, dass die PCLS auch nach sechs Tagen noch in einem guten Zustand und für Infektionsstudien geeignet sind (GORIS et al. 2009).
Die Vitalität kann anhand des Zilienschlags und der Kontraktionsbereitschaft kontrolliert werden.
Es wurde beobachtet, dass passiv sensibilisierte PCLS stärker auf ein Allergen reagieren als nicht sensibilisiertes Gewebe. Außerdem zeigen kleine Atemwege eine erhöhte Reaktionsbereitschaft, was durch eine schnellere und stärkere Kontraktionsbereitschaft sowie eine schnellere Relaxation gekennzeichnet ist. Eine mögliche Erklärung ist die erhöhte Produktion von Mediatoren oder ihre erhöhte Reaktivität in diesem Bereich (WOHLSEN et al. 2001).
2.4 In eigenen Versuchen verwendete Testsubstanzen 2.4.1 Methacholin
Methacholin ist ein direktes Parasympathomimetikum. Es wird durch Substitution einer Methylgruppe in der β-Stellung aus Acetylcholin hergestellt. Acetylcholin eignet sich aufgrund seines schnellen enzymatischen Abbaus und der bei parenteraler Applikation starken kreislauf- und herzdepressiven Wirkung selbst nicht als Arzneimittel. Methacholin ist hingegen durch die Methylsubstitution vor dem Abbau durch die unspezifische Cholinesterase geschützt.
Acetylcholin Methylgruppensubstitution Methacholin
Methacholin übt seine Wirkung über die Stimulierung von Cholinorezeptoren aus. Die überwiegend muskarinerge Wirkung beruht auf einer höheren Empfindlichkeit und einer substanzabhängigen höheren Affinität gegenüber diesen Rezeptoren. Die muskarinergen Rezeptoren sind an ein G-Protein-gekoppelt, die eine Vielzahl von Zellfunktionen regulieren. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören zu einer Superfamilie von Proteinen, die die Fähigkeit besitzen, extrazelluläre Signale über die Plasmamembran in die Zelle zu schleusen und dort in intrazelluläre Signale umzuwandeln.
Klassifiziert werden die Rezeptoren nach der G-Protein-Subfamilie (Gs, Gi/o oder Gq/11), die an der Aktivierung des Rezeptors hauptsächlich beteiligt ist (BILLINGTON und PENN 2003).
Von den muskarinergen Rezeptoren gibt es fünf verschiedene Subtypen, wobei die M1-, M2- und M3-Rezeptoren für das Lungengewebe von Bedeutung sind (RACKE und MATTHIESEN 2004). Über den M3-Rezeptor werden die Bronchokonstriktion und die muköse Sekretion reguliert. Der M1-Rezeptor ist ebenfalls für die muköse Sekretion verantwortlich und zusätzlich auf parasympathischen Ganglien zu finden (BARNES 2004). ABRAHAM et al. 2003 beobachteten, dass beim Pferd kein signifikanter Unterschied in der Gesamtrezeptorzahl zwischen gesunden und an COB erkrankten Pferden besteht. Im Epithel der Bronchien und in der glatten Muskulatur besteht zwischen dem M2- und M3-Rezeptor ein Verhältnis von 80:20 %.
Im Lungenparenchym überwiegt die Anzahl der M2-Rezeptoren gegenüber dem M1- und M3-Rezeptor.
Die muscarinergen Rezeptorsubtypen (M1, M3, M5) sind an G-Proteine der Gq-Familie gekoppelt (RACKE und MATTHIESEN 2004). Bei dem Gq-gekoppelten Rezeptor ist die Phospholipase C (PLC) der Effektor, durch den die Bindung des Gqα-Protein-
GTP-Komplex aktiviert wird. Es kommt zur Hydrolisierung des Phosphoinositol 4,5- biphosphats (PIP2) zu den intrazellulären Signalgebern 1,2-Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-Triphosphat (IP3).
Das IP3 veranlasst durch Bindung an das sarkoplasmatische Retikulum die Freisetzung von Calciumionen aus den internen Speichern. Der erhöhte intrazelluläre Spiegel an Calciumionen verursacht die Komplexbildung von Calcium mit Calmodulin und bewirkt damit die Aktivierung der Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK), die Myosin phosphoryliert und Aktin aktiviert. Dieser Vorgang führt zur Aktivierung der Myosin-ATPase, die für die Kreuzvernetzung von Aktin und Myosin und die dadurch ausgelösten Kontraktion verantwortlich ist. Nach der Kontraktion wird das IP3 durch die IP3-Kinase entweder zu Inositol, das wiederum in die Phosphoinositide der Zellmembran eingegliedert wird und dem inaktiven IP2 gespalten oder zu IP4
phosphoryliert, das bei der Öffnung von Rezeptor-abhängigen Calciumkanälen und bei dem Wiederauffüllen der internen Speicher behilflich ist (BARNES 1998).
Der zweite Signalweg läuft über das membrangebundene DAG, das über mehrere Zwischenprodukte die Bildung verschiedener Entzündungsmediatoren veranlasst (RACKE und MATTHIESEN 2004).
Die M2- und M4-Rezeptoren sind an G-Proteine gekoppelt, die zu der Gi/o-Familie gehören (RACKE und MATTHIESEN 2004). Die Aktivierung dieser am häufigsten vorkommenden, bei Entzündungsreaktionen stark erhöhten Rezeptorart, ist mit der Hemmung der Gαs-stimulierten Adenylatzyclase-Aktivität verbunden, was zu einer gesenkten cAMP-Konzentration und damit zu einer geschwächten Muskelrelaxation führt (BILLINGTON und PENN 2003). cAMP ist ein wichtiger inhibitorischer Second Messenger für die muscarinerge Atemwegskontraktion.
In den Atemwegen kann der M2-Rezeptor ebenfalls über das Gi-Protein mit der Rho interagieren. Rho ist für die Reorganisation der Aktin-Filamente und für den hemmenden Effekt gegenüber der Myosin-Phosphatase verantwortlich, die eine Muskelrelaxation induzieren würde, wodurch es zur Atemwegsmuskelkontraktion beisteuert.
M2-Rezeptoren können über ihr Gi-Protein zwei Arten von Ionenkanälen in den Atemwegen beeinflussen. An den Calcium-aktivierten Kaliumkanälen üben
muscarinerge Agonisten einen hemmenden Effekt aus und an den nicht-selektiven Kationenkanälen bewirken sie, über die Beeinflussung der Kanalöffnung, eine Veränderung des Natrium- und Calciumeinstroms (RACKE und MATTHIESEN 2004).
In höheren Konzentrationen kann Methacholin auch an den nicotinergen Rezeptoren wirken, mit der Folge von Muskelzittern, Spasmen oder Lähmungen.
Eine unerwünschte bronchokonstriktorische Wirkung der Parasympathomimetika kann durch den Einsatz von Parasympatholytika reduziert werden.
Parasympatholytika bewirken durch die Blockierung der postganglionären muscarinartigen Cholinorezeptoren die Acetylcholinwirkung und unterbrechen damit den bronchialen Reflexbogen. Ipratropium und Tiotropium sind im Gegensatz zu Atropin synthetische Verbindungen, die den Vorteil besitzen, keine negativen Auswirkungen auf das Herz auszuüben (LÖSCHER et al. 2003).
DUVIVIER et al. (1997) zeigten, dass sowohl bei gesunden als auch bei an COB erkrankten Pferden durch die Inhalation von Ipratropium der Lungenwiderstand reduziert wird und sich die dynamische Compliance erhöht. Als einziger Nachteil kann der reduzierte transepitheliale Widerstand angesehen werden, durch den der Elektrolyttransport der nasalen Atemwegsschleimhaut beeinflusst wird.
Beim Menschen bewirkt die Inhalation von Tiotropium ein forciertes exspiratorisches Volumen pro Sekunde. Tiotropium besitzt im Gegensatz zum Ipratropium eine längere Wirkungsdauer (24 Stunden gegenüber 8 Stunden) (JEPSEN et al. 2000).
Von BARTON (2005) wurde die Wirkung von Ipratropium und Tiotropium auf die Bronchokonstriktion an equinen PCLS getestet. Es zeigte sich eine deutlich reduzierte Kontraktionsbereitschaft auf das zugegebene Methacholin.
2.4.2 Histamin
Histamin ist ein biogenes Amin, das durch Decarboxylierung des L-(+)-Histidins mit Hilfe der Histidindecarboxylase gebildet wird. Es kommt vorwiegend in Mastzellen und basophilen Granulozyten vor. Die Konzentration in den Geweben ist unterschiedlich und hängt von dem Gehalt an Mastzellen ab (STARKE und PALM
1992). Histamin ist ein wichtiger Entzündungsmediator, der als Antwort auf eine entzündliche Stimulation aus Mastzellen freigesetzt wird. Es induziert die Hypersensitivität und ist bei allergischen Reaktionen für das klinische Bild verantwortlich (MIRBAHAR et al. 1985).
L-(+)-Histidin Histidindecarboxylase Histamin
2.4.2.1 Histaminrezeptoren
Für Histamin sind vier Histaminrezeptoren bekannt, die sich postsynaptisch befinden und in die Kategorie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören.
An der Lunge findet man den H1- und den H2-Rezeptor. Der H1-Rezeptor ist ein exzitatorischer Rezeptor, der sich bei Mensch und Tier in der Atemwegsmuskulatur befindet (CHAND et al. 1979). Er ist über ein Gq/G11-Protein an eine Phospholipase gekoppelt, die nach Aktivierung die Freisetzung von Calciumionen aus den intrazellulären Speichern veranlasst. Folge ist eine Bronchokonstriktion, ein Spasmus der Gefäße und eine erhöhte Gefäßpermeabilität (WANG und KOTLIKOFF 2000).
Durch das Klonen des H1-Rezeptors verschiedener Tiere wurde gezeigt, dass große tierartliche Unterschiede in den Rezeptorsequenzen bestehen. Diese tierartlich unterschiedlichen H1-Rezeptoren sind eine Erklärung für die unterschiedlich starken Reaktionen der Tiere auf Histamin (BARNES 2001).
Der H2-Rezeptor ist ein inhibitorischer Rezeptor, der sich bei Katze, Schwein, Pferd und Meerschweinchen in der Trachea befindet. Außerdem wurde er bei Menschen, Pferden, Schafen, Schweinen und Meerschweinchen in den Bronchien nachgewiesen (CHAND et al. 1979). Der H2-Rezeptor ist über ein Gs-Protein an eine Adenylatzyclase gebunden, die nach Aktivierung zur Akkumulation von intrazellulärem cAMP führt (CARDELL und EDVINSSON 1994). Folge dieser
Aktivierung ist die Phosphorylierung von Schlüsselproteinen, die für den Muskeltonus verantwortlich sind. Schlüsselproteine sind z.B. der IP3-Rezeptor, die MLCK, die PLC oder der Gq-gekoppelte-Rezeptor. Diese Phosphorylierung verursacht einen reduzierten Calciumfluss, eine reduzierte Calciummobilisierung und eine gesenkte Calciumaffinität für Calmodulin. Folge ist die Relaxation der Atemwegsmuskulatur (JOHNSON 1998).
Die Relaxation der Atemwegsmuskulatur kann auch cAMP-unabhängig verlaufen über die direkte Interaktion vom Gsα-Protein mit Kalium-Kanälen. Die PKA phosphoryliert dabei einen bestimmten K-Kanal, was zu seiner Öffnung und damit zum Kaliumeinfluss führt. Die Folge ist eine Hyperpolarisation und eine Relaxation der Muskulatur. Kaliumkanäle spielen eine wichtige Rolle in der Erholung der Atemwegsmuskelzelle nach einer Depolarisation. Medikamente, die Kaliumkanäle öffnen, wirken als Bronchodilatatoren (BARNES 1998).
Der H3-Histaminrezeptor ist vorwiegend auf Zellen des Zentralnervensystems und nur in geringer Anzahl in der Peripherie zu finden. Im ZNS befindet sich der H3- Rezeptor präsynaptisch und agiert dort als Autorezeptor, der die Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren reguliert (ARRANG et al. 1983). In der Peripherie hemmt der H3-Rezeptor die Histaminfreisetzung und bewirkt dadurch eine Bronchorelaxation. Bei Meerschweinchen moduliert der H3-Rezeptor die cholinerge Neurotransmission in der Trachea und hemmt nicht-adrenerge, nicht-cholinerge Bronchokonstriktionen und Plasmaextravasationen (CARDELL und EDVINSSON 1994).
An equinen Atemwegen wurde gezeigt, dass H3-Rezeptor-Antagonisten die Sensibilität des Gewebes gegenüber Histamin erhöhen. Für das Pferd konnte die bronchorelaxierende Wirkung des H3-Rezeptors bestätigt werden (OLSZEWSKI et al.
1999b).
Der H4-Rezeptor wurden erst im Jahr 2000 von einer japanischen Arbeitsgruppe entdeckt (NAKAMURA et al. 2000). In den folgenden Jahren wurde dieser Rezeptor für den Menschen und mehrere Tierarten kloniert (LIU et al. 2001). Der H4-Rezeptor
befindet sich auf Zellen des Immunsystems, vor allem auf dendritischen Zellen (BÄUMER et al. 2006) und auf hämatopoetischen Zellen. Beim Menschen konnte er in geringer Anzahl in Lunge, Herz, Milz, Dünn- und Dickdarm und im Gehirn nachgewiesen werden (AKDIS und SIMONS 2006). Der H4-Rezeptor, der die größte Verwandtschaft zum H3-Rezeptor besitzt (HOUGH 2001; LIU et al. 2001), weist die geringste Homologie zwischen den einzelnen Spezies auf, wobei bei verwandten Tierarten (Maus-Ratte) die Homologie deutlich höher ist als bei verschiedenen Tierarten (Maus-Schwein) (LIU et al. 2001; JIANG et al. 2008). Die Bindungsaffinität des H4-Rezeptors unterliegt starken tierartlichen Variationen (LIM et al. 200), während die Gewebsexpression fast identisch ist (LIU et al. 2001). Er gehört in die Familie der Gi/oa-Rezeptoren und ist für die Hemmung der intrazellulären cAMP- Formation, die Aktivierung der Phospholipase C und die Phosphorylierung der MAP- Kinase verantwortlich (NAKAMURA et al. 2000; LIU et al. 2001). Der H4-Rezeptor besitzt eine zentrale Rolle im Ablauf der Immunantwort. Bei In-vitro-Versuchen beeinflusst er die Zellaktivierung, die Zellmigration und die Zytokin- und Chemokinproduktion verschiedener Immunzellen. In In-vivo-Versuchen wurde die wichtige Rolle des H4-Rezeptors im Entzündungsgeschehen und der Juckreizentstehung beschrieben (THURMOND et al. 2004; THURMOND et al. 2008)
Histamin besitzt eine konzentrationsabhängige Wirkungsweise. In geringen Konzentrationen übt es eine relaxierende Wirkung auf präkontraktile isolierte Lungenarterien und Trachealsegmente aus. In hohen Dosen bewirkt es sowohl an präkontrahierten als auch an ruhenden Segmenten eine Kontraktion (CARDELL und EDVINSSON 1994).
Die Reaktion auf Histamin unterliegt einer interindividuellen und intraindividuellen Variabilität, deren Ursache bisher nicht bekannt ist. Vermutet werden funktionelle Variationen der adrenergen und H2-histaminergen Rezeptoren, ein unterschiedlicher Immunstatus oder Unterschiede in der Atemwegssensibilität auf inhaliertes Histamin (MIRBAHAR et al. 1985). Außerdem sinkt die bronchokonstriktorische Antwort der glatten Atemwegsmuskulatur auf Histamin mit zunehmendem Alter (JEFFREY 1998).
2.4.2.2 Zusammenhang zwischen Histamin und der COB-Problematik
Die Rolle des Histamins bei der COB-Entwicklung wird kontrovers diskutiert. Es wurde nachgewiesen, dass Pferde, die an COB leiden, stärker auf Histamin reagieren als gesunde, was beim Histamin-Inhalations-Provokationstest genutzt werden kann (KLEIN und DEEGEN 1986).
Dieser Test wird als Nachweis für die unspezifische Reagibilität der Atemwege genutzt. Histamin wirkt über die Irritation des N. vagus oder direkt über die Histaminrezeptoren, wodurch es zu einer Dyspnoe kommt. Die dynamische Compliance wird als geeigneter Lungenfunktionsparameter zur Messung der bronchokonstriktorischen Antwort genutzt (MUYLLE und OYAERT 1973). Sie ist ein Maß für die Hyperreagibilität RAO-erkrankter Pferde auf Histamin. Schon bei geringen Anzeichen einer COB sinkt die dynamische Compliance im Vergleich zu der von gesunden Tieren. Die exspiratorische Atemarbeit und die Atemfrequenz sind dagegen erhöht.
Die bronchiale Hyperreagibilität zeigt sich selbst bei der Remission der Krankheit und bei klinisch unauffälligen Tieren, wodurch auch an IAD erkrankte Pferde erkannt werden (HOFFMANN 1998; HOFFMANN 2002).
TRAUB (2005) ermittelte keinen Zusammenhang zwischen der gemessenen Histaminkonzentration und der COB. Nach der Aktivierung der Mastzellen und der daraus resultierenden Histaminausschüttung konnte kein Histamin in der BAL festgestellt werden. Als Ursache kann eine lokale Adsorption oder der Abbau des Histamins durch Histaminasen gesehen werden. Außerdem bestehen starke interindividuelle Schwankungen, die durch den unterschiedlichen Mastzellgehalt in der BAL oder die unterschiedlichen Histamingehalte pro Mastzelle erklärt werden können. Der maximale Histamingehalt in den Mastzellen der BAL von erkrankten und gesunden Tieren zeigt keinen Unterschied.
2.4.2.3 Effekt von Histamin auf die Bronchokonstriktion anhand von PCLS Bei dem Vergleich der Bronchokonstriktionsstärke von Histamin und Methacholin wurde gezeigt, dass Histamin eine deutlich schwächere Reaktion aufweist. Dieses Ergebnis wurde von VIETMEIER (2004) und BARTON (2005) für equine PCLS bestätigt.
An den Atemwegen verschiedener Tierarten wurde beobachtet, dass die Sensibilität gegenüber Histamin in der Peripherie ansteigt. Als mögliche Erklärung wird die histaminbedingte erhöhte Stimulierung der cholinergen Nerven vermutet.
Nach einer Blockade der muscarinergen Rezeptoren der tiefen Atemwege können durch Histamin kleine inkonstante Kontraktionen induziert werden, was auf eine geringe inhibitorische Innervation in den tiefen Atemwegen schließen lässt (OLSZEWSKI et al. 1997).
OLSZEWSKI et al. (1999a) beobachteten an equinen Atemwegen, dass der H1- Rezeptor in diesem Gewebe dominiert und für alle exzitatorischen Effekte in der Trachea verantwortlich ist. Der H3-Rezeptor soll einen schwachen hemmenden Effekt besitzen, der jedoch durch die Wirkung des H1-Rezeptors überschattet wird. Laut OLSZEWSKI et al. (1999a) besitzt der H2-Rezeptor an den Atemwegen vom Pferd keine Wirkung.
2.4.3 4-Methylhistamin
Das 4-Methylhistamin wurde ursprünglich als H2-Rezeptoragonist entwickelt, der bei Meerschweinchen für die Kontraktion von Trachea und einigen Lungensegmenten verantwortlich ist (CARDELL und EDVINSSON 1994). Beim Rind verursacht das 4- Methylhistamin eine Relaxation von Trachea und Bronchus (CHAND et al. 1979).
Da 4-Methylhistamin eine höhere Selektivität zum H4-Rezeptor als zum H2-Rezeptor aufweist (LIU et al. 2001), wird es heutzutage als potenter H4-Agonist eingesetzt.
2.4.4 Histaminantagonisten
Histaminantagonisten besitzen in hohen Konzentrationen nur einen geringen klinischen Erfolg, so dass sie für die COB-Therapie als uneffektiv eingeschätzt werden (BARNES 2001).
2.4.4.1 H1-Rezeptorantagonisten
H1-Rezeptorblocker, die klassischen Antihistaminika, besitzen neben ihrer kompetitiven Blockierung der H1-Rezeptoren auch antiadrenerge, anticholinerge und antitryptaminerge Wirkungen. Dadurch können Nebenwirkungen wie Blutdruckabfall, Durchfall oder Obstipation auftreten (LÖSCHER et al.2003).
H1-Antagonisten der ersten Generation wie Diphenhydramin oder Mepyramin können durch ihre hohe Lipophilie die Blut-Hirn-Schranke passieren und dadurch einen sedativen Effekt auslösen. Beim Pferd wird Diphenhydramin zur Behandlung der paoxysomalen Myoglobinurie, der Azoturie, der periodischen Konjunktivitis oder des pulmonalen Emphysems verwendet (ADAMS 2001).
Cetirizin ist ein H1-Antagonist der zweiten Generation, die über eine geringe Penetrationsfähigkeit der Blut-Hirn-Schranke verfügen und daher eine deutlich reduzierte sedative Wirkung besitzen (DITTMANN und MOHR 2004). Bei oraler Applikation besitzt Cetirizin eine hohe Bioverfügbarkeit, die durch seine schnelle Aufnahme durch passive Diffusion und das schnelle Erreichen hoher Plasmakonzentrationen charakterisiert ist. Die Plasmakonzentrationen unterliegen nur geringen interindividuellen Variationen. Die Ausscheidung erfolgt in großen Mengen mit dem Harn (OLSEN et al. 2007).
Bei Menschen wird Cetirizin zum Beispiel zur Behandlung allergischer Urtikaria oder des anaphylaktischen Schocks verwendet. Es hemmt die Freisetzung von GM-CSF und IL-8 aus den Atemwegsepithelzellen. Zudem reduziert es die durch TNF-α induzierte Hyperaktivierung von NFκB in den Endothelzellen. Da bei der COB der TNF-α-Spiegel und die NFκB-Aktivität erhöht sind, wird vermutet, dass Cetirizin analog zum Menschen die Hyperaktivierung reduzieren kann (OLSEN et al. 2008).
2.4.4.2 H2-Rezeptorantagonisten
H2-Rezeptorantagonisten, wie das Ranitidin, werden zur Behandlung von säurebedingter Gastritis oder Magenulzera eingesetzt, da sie die Magensäureproduktion reduzieren (PETZINGER 1996). OLSZEWSKI et al. (1999b) konnten an equinen Atemwegen keine klinische Wirksamkeit des Ranitidins nachweisen.
2.4.4.3 H3-Rezeptorantagonisten
H3-Antagonisten werden in der Humanmedizin zur Therapie von Schlafstörungen, Morbus Alzheimer, Schizophrenie, Ischämie-bedingten Herzarrhythmien und Migräne sowie bei Adipositas eingesetzt (LEURS et al. 2005). Beim asthmatischen Menschen wird ein positiver Effekt der H3-Antagonisten durch Modulation der cholinergen Bronchokonstriktion und Hemmung der neurogenen Entzündung angenommen.
Klinisch konnte jedoch keine therapeutische Wirkung beobachtet werden (BARNES 2001). Die Wirksamkeit verschiedener H3-Antagonisten wird weiterhin in klinischen Studien untersucht.
Thioperamid ist ein inverser Agonist, der bei allen Tierarten über den H3- und H4- Rezeptor wirkt (FUNG-LEUNG et al. 2004). Er hemmt die histamininduzierte Calciummobilisierung der eosinophilen Granulozyten und führt zu einer Rechtsverschiebung der Histamin-Dosis-Kurve (RAIBLE et al. 1994).
2.4.4.4 H4-Rezeptorantagonisten
Einer der ersten hochselektiven H4-Rezeptorantagonisten ist JNJ7777120 (1-[(5- Chloro-1Hindol-2-yl)carbonyl]-4-methylpiperazin). Es besitzt eine hohe Affinität und Selektivität zum H4-Rezeptor. Die orale Bioverfügbarkeit von JNJ7777120 ist tierartlich sehr unterschiedlich. Während sie beim Hund 100 % beträgt, liegt sie bei der Ratte nur bei 22 %. Die Halbwertszeit liegt zwischen einer und drei Stunden (FUNG-LEUNG et al. 2004).
Bei Mäusen, die mit JNJ7777120 vorbehandelt wurden, wurde eine deutlich reduzierte Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in das Entzündungsgewebe
ermittelt. Als Ursache wird die gehemmte Leukotrien-B4-Produktion der Mastzellen angesehen (FUNG-LEUNG et al. 2004). In einem Ovalbumin-induzierten Asthma- Modell der Maus wurde durch JNJ7777120 eine Reduktion des allergeninduzierten inflammatorischen Zellinflux erzielt (DUNFORD et al. 2007).
2.4.5 Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT)
Serotonin wirkt als Hormon und Neurotransmitter und besitzt in der Tierwelt ein ubiquitäres Vorkommen. Serotonin konnte beim Mensch, Rind, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen und Ratte bisher im Gehirn, Lunge, Leber und im Gastrointestinaltrakt nachgewiesen werden, wo es in Thrombozyten und enterochromaffinen Zellen gespeichert wird (MOHAMMAD-ZADEH et al. 2008). Zusätzlich ist es in neuroendokrinen Zellen der Atemwege und peripheren Nerven zu finden. Bei Nagetieren befindet sich das Serotonin in Mastzellen (BARNES 2001).
L-Tryptophan Tryptophan- 5-Hydroxy- Dopa- 5-HT Hydroxylase tryptophan Decarboxylase
Die Synthese außerhalb des ZNS ist auf die enterochromaffinen Zellen beschränkt.
Die Thrombozyten besitzen keine Fähigkeit, Serotonin zu synthetisieren. Sie sind jedoch ebenso wie die enterochromaffinen Zellen für die Speicherung von großer Bedeutung. Frei zirkulierendes Serotonin wird sofort metabolisiert und ist daher nur in geringen Mengen vorhanden (MOHAMMAD-ZADEH et al. 2008).
Das Serotonin kann seine Wirkung über eine Vielzahl von Rezeptoren ausüben. Es gibt 5-HT1-, 5-HT2- und 5-HT3-Rezeptoren, wobei sich der 5-HT1-Rezeptor in vier Untergruppen (5-HT1A-D) unterteilen lässt. Die 5-HT-Rezeptoren sind G-Protein-
gekoppelte Rezeptoren. Einzige Ausnahme ist der 5-HT3-Rezeptor, der nach seiner Aktivierung Natrium- und Kaliumionenkanäle öffnet und damit eine Depolarisation der Zelle bewirkt. Die 5-HT2- und 5-HT1c-Rezeptoren aktivieren die Phospholipase C, während der 5-HT1A-Rezeptor zur Stimulierung der Adenylatzyclase führt. Diese wird durch den 5-HT1B-und 5-HT1D-Rezeptor gehemmt (FRAZER et al. 1990).
Serotonin bewirkt bei Nagetieren eine konzentrationsabhängige Bronchokonstriktion.
Diese kann direkt über die Aktivierung von 5-HT2-Rezeptoren erfolgen, die sich auf Atemwegsmuskelzellen befinden, oder indirekt durch die Stimulierung cholinerger Nerven und die dadurch bedingte Freisetzung von Acetylcholin hervorgerufen werden. Bei Mäusen wurde gezeigt, dass Serotonin ebenso eine Freisetzung von Acetylcholin aus dem Epithel bewirkt (DE SWERT et al. 2007). Beim Menschen wird durch Serotonin keine Bronchokonstriktion induziert. Die Vermutung, dass humane Mastzellen kein Serotonin bilden können, kann durch die Anwesenheit der Tryptophan-Hydroxylase und von Serotonin auf den Mastzellen widerlegt werden. Im Vergleich zu Nagetieren sind diese Mengen jedoch sehr gering (CYPHERT et al.
2009).
Der 5-HT3-Rezeptor ist bei vielen Tierarten, wie zum Beispiel der Maus, an der Aktivierung und Depolarisierung sensorischer Nerven beteiligt. Es ist möglich, dass der bronchiale Reflex durch die Aktivierung sensorischer Nerven durch Serotonin ausgelöst wird (CYPHERT et al. 2009).
Anhand der Trachea von Mäusen wurde die kontraktile Antwort auf Serotonin und Ovalbumin untersucht. Es wurde beobachtet, dass der 5-HT2-Rezeptor und das Serotonin bei der antigeninduzierten Atemwegskontraktion eine Rolle spielen (DE SWERT et al. 2007). Die Hemmung der Serotoninsynthese oder die Blockade des 5HT2-Rezeptors verhindert eine antigeninduzierte Atemwegsreaktion (CYPHERT et al. 2009).
Bei Meerschweinchen hemmt Serotonin durch die Freisetzung von Tachykinin über den auf sensorischen Nervenenden lokalisierten 5-HT1-Rezeptors die nicht- adrenerge-nicht-cholinerge (NANC) Bronchokonstriktion (BARNES 2001).
