Aus der Klinik für Pferde und
dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchung zur Atemwegsreagibilität an „Precision Cut Lung Slices“ (PCLS)
beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Julia Vietmeier aus Horn-Bad Meinberg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann Privatdozent Dr. B. Ohnesorge
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann Privatdozent Dr. B. Ohnesorge
2. Gutachter: Prof. Dr. F. -J. Kaup
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2004
Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Chronisch obstruktive Bronchitis 3
2.1.1 Terminologie 3
2.1.2 Klinische Symptome 4
2.1.3 Ätiologie 6
2.1.3.1 Allergie 6
2.1.3.2 Toxische Genese 6
2.1.3.3 Viruserkrankungen 7
2.1.3.4 Genetische Faktoren 7
2.1.3.5 Bewegungsmangel 7
2.1.4 Pathogenese der COB 8
2.1.4.1 Obstruktion 8
2.1.4.2 Entzündung 9
2.1.4.3 Hyperreagibilität 10
2.1.5 Pathomorphologische Veränderungen 10
2.2 Regulation des Bronchotonus 11
2.2.1 Parasympathisches Nervensystem 11
2.2.1.1 Muskarinerge Rezeptoren 12
2.2.1.2 Parasympathomimetika 13
2.2.1.3 Beteiligung des Parasympathikus an der chronisch
obstruktiven Bronchitis 14
2.2.2 Sympathisches Nervensystem 15
2.2.2.1 2-Rezeptor-Agonisten 16
2.2.3 Nicht-adrenerge nicht-cholinerge Innervation der Atemwege (NANC) 18 2.2.3.1 Nicht-adrenerges nicht-cholinerges exzitatorisches System (eNANC) 18 2.2.3.2 Nicht-adrenerges nicht-cholinerges inhibitorisches System (iNANC) 18
2.2.4 Histamin 19
2.2.5 Provokationstests der Atemwege beim Pferd in vivo 20 2.2.5.1 Der Histamin-Inhalations-Provokationstest (HIPT) 21 2.2.5.2 Provokationstests der Atemwege mit Parasympathomimetika 21 2.3 In-vitro-Methoden zur Untersuchung von Lungengewebe 22 2.3.1 Untersuchungen am Musculus trachealis 22 2.3.2 Untersuchungen mit Lungenparenchymstreifen 23 2.3.3 Untersuchungen an isolierten Bronchien 24
2.3.4 Precision Cut Lung Slices (PCLS) 25
2.3.4.1 Methodik zum Erstellen von PCLS aus der Mäuselunge 26 2.3.4.2 Methodik zum Erstellen von PCLS aus der Menschenlunge 27
2.3.4.3 Untersuchungen an PCLS 27
2.3.4.4 Messung der Atemwege 28
2.3.4.5 Kontraktilität 28
2.3.4.6 Relaxation 29
2.3.4.7 Passive Sensibilisierung 29
2.3.4.8 Infektionen der PCLS mit Bakterien und Viren 30
3 Eigene Untersuchungen 32
3.1 Teil 1: Etablierung der Methode zur Herstellung von PCLS 32
3.1.1 Material und Methode 32
3.1.1.1 Entnahme des Lungengewebes 33
3.1.1.2 Befüllung des Lungengewebes mit Agarose 34 3.1.1.2.1 Befüllung des Lungensegmentes aus dem Lobus caudalis 35
3.1.1.2.2 Befüllung des Lobus accessorius 35
3.1.1.3 Herstellen der Präzisionslungenschnitte 37
3.1.1.4 Auswaschen der Agarose 40
3.1.1.5 Beurteilung der Vitalität der PCLS 40
3.1.2 Ergebnisse 41
3.1.2.1 Entnahme des Lungengewebes 41
3.1.2.2 Befüllung des Lungengewebes 41
3.1.2.3 Schneiden des Lungengewebes mit dem Tissue Slicer 42 3.2 Teil 2: Untersuchungen zur pharmakologischen
Beeinflussung der PCLS 44
3.2.1 Material und Methode 44
3.2.1.1 Patientengut 44
3.2.1.2 Allgemeiner Versuchsablauf 45
3.2.1.3 Klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle
Untersuchung der Atemwege 45
3.2.1.4 Euthanasie 50
3.2.1.5 Erstellen und Mikroskopieren der PCLS 50
3.2.1.6 Vitalität der Schnitte 52
3.2.1.7 Behandlung der Schnitte mit pharmakologisch wirksamen Substanzen 53
3.2.1.8 Statistische Auswertung 54
3.2.2 Ergebnisse 55
3.2.2.1 Probandengut 55
3.2.2.2 Mikroskopie der PCLS 57
3.2.2.3 Vitalität und morphologische Beschaffenheit der PCLS 58
3.2.2.4 Prüfung auf Vorkontraktion der PCLS 60
3.2.2.5 Pharmakologische Beeinflussbarkeit der PCLS 61 3.2.2.5.1 Bronchokonstriktion mit Metacholin 61
3.2.2.5.2 Bronchokonstriktion mit Histamin 66
3.2.2.5.3 Bronchodilatation nach provozierter Konstriktion mit Metacholin 70
4 Diskussion 71
4.1 Erstellen der PCLS 72
4.2 Mikroskopie und Auswertung der PCLS 75
4.3 Vitalität der PCLS 76
4.4 Eignung der PCLS für pharmakologische Studien 76 4.5 Pharmakologische Beeinflussbarkeit der PCLS 78
4.6 Probandengut 80
5 Zusammenfassung 81
6 Summary 83
7 Literaturverzeichnis 85
8 Tabellarischer Anhang 102
9 Danksagung 108
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb Abbildung
BALF Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit COB Chronisch obstruktive Bronchitis
COPD Chronic obstructive pulmonary disease HIPT Histamin-Inhalations-Provokations-Test IAD Inflammatory airway disease
LDH Laktat Dehydrogenase
MTT Dimethylthiazol-diphenyl-tetrazolium-bromid PCLS Precision-Cut-Lung-Slice
PCO2 Kohlendioxidpartialdruck im arteriellen Blut PO2 Sauerstoffpartialdruck im arteriellen Blut RAO Recurrend airway obstruction
RSV Respiratorisches Synzytial Virus TBS Tracheobronchialsekret
1 Einleitung
Erkrankungen des Atmungsapparates haben in der Pferdemedizin seit jeher einen hohen Stellenwert. Die chronisch obstruktive Bronchitis der Pferdes ist hinsichtlich Ätiologie, Pathogenese und klinischer Symptome ein komplexes Krankheitsgeschehen. Die Erkennung der einzelnen Komponenten dieser Krankheit, und die Ermittlung ihrer Bedeutung für das Gesamtgeschehen sowie deren pharmakologische Beeinflussung sind seit langem Gegenstand der Forschung.
Provokationstests der Atemwege beim Pferd enthalten viele Einflussfaktoren und sind oftmals kaum zu standardisieren. Um neue Erkenntnisse zu erlangen und standardisierte Untersuchungen durchführen zu können, ist es sinnvoll, Studien auch in vitro an vitalem Lungengewebe durchzuführen. In-vitro-Untersuchungen finden bisher hauptsächlich an isolierten Strukturen wie der glatten Muskulatur der Trachea oder isolierten Bronchien aus der Lungenperipherie statt. Weiterhin ist das Lungenparenchym mit allen vorkommenden Strukturen Gegenstand der Forschung.
Durch die Vielzahl an Einzelstrukturen ist hier eine Zuweisung von Effekten allerdings schwierig.
MARTIN et al. (1996) entwickelten unter Verwendung von Mäuselungen eine Methodik zur Erstellung von präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (Precision Cut Lung Slices, PCLS). Diese Schnitte mit einer definierten Schichtdicke beinhalten einen Atemweg, der in sein ursprüngliches Parenchym eingebettet ist. Das Gewebe ist vital; der Atemweg kann aktiv auf Stimuli verschiedener Art reagieren. Mit diesem Modell steht eine Möglichkeit zur Verfügung, die Atemwege in ihrem Gewebeverband zu untersuchen, was sich der Untersuchung am lebenden Organismus annähert, allerdings unter weitgehend standardisierten Bedingungen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, diese Methodik für das Pferd zu etablieren, um einen weiteren Ansatz in der Erforschung der Atemwegserkrankungen des Pferdes zu bekommen. Zur besseren Übersicht wird die Arbeit in zwei Abschnitte unterteilt.
Der erste Abschnitt erläutert die Etablierung der Methodik, wobei das zu Grunde liegende Material, die angewendeten Methoden und die erhaltenen Ergebnisse
dargestellt werden. Im zweiten Abschnitt wird die erarbeitete Methodik unter standardisierten Bedingungen überprüft und die pharmakologische Beeinflussbarkeit der PCLS untersucht. Material, Methoden und Ergebnisse werden auch hier gesondert besprochen.
2 Literaturübersicht
2.1 Chronisch obstruktive Bronchitis
Die chronisch obstruktive Bronchitis (COB) ist hinsichtlich Ätiologie, Pathogenese und klinischer Symptome ein komplexes Krankheitsgeschehen. Sie zählt zu den häufigsten Lungenerkrankungen des Pferdes und verursacht durch eine eingeschränkte Leistungsfähigkeit einen erheblichen finanziellen Schaden.
2.1.1 Terminologie
Der von SASSE (1971) eingeführte und über viele Jahre zur Beschreibung der chronischen Lungenerkrankung des Pferdes angewendete Terminus COPD (Chronic obstructive pulmonary disease) aus der Humanmedizin, sollte bezüglich seiner Verwendung in der Pferdemedizin überdacht werden (ROBINSON, 2000). Die equine COB ist charakterisiert durch eine reversible Bronchokonstriktion, die mehr Ähnlichkeit mit humanem Asthma besitzt als mit COPD, welche normalerweise mit der Inhalation von Zigarettenrauch vergesellschaftet ist (BARNES, 2000;
MAGNUSSEN et al., 1998) und im Gegensatz zum humanen Asthma nicht reversibel ist (ROBINSON, 2000; MAGNUSSEN et al., 1998). Neben dem, in dieser Untersuchung gewählten Terminus COB, sollten vorzugsweise die Bezeichnungen Recurrent airway obstruction (RAO) oder „Heaves“ für diese Erkankung der Atemwege des Pferdes verwendet werden (ROBINSON, 2000). Abzugrenzen von der COB ist die Inflammatory airway disease (IAD), die vor allem bei jungen, trainierten Pferden gesehen wird. Die Ursachen für diese Erkrankung sind noch unklar und ein ursächlicher Zusammenhang zwischen dem Auftreten von IAD und COB konnte bislang nicht erwiesen werden (ROBINSON, 2000; HODGSON u.
HODGSON, 2002).
2.1.2 Klinische Symptome
Die klinischen Symptome differieren mit dem Ausprägungsgrad der Krankheit. In leichten Fällen ist oft als einziges Symptom eine Leistungsminderung durch den Reiter festzustellen (LITTLEJOHN, 1980; ROBINSON et al. 1996). Oft besteht die subklinische Erkrankung jedoch über längere Zeit, ohne erkannt zu werden.
HERHOLZ et al. (1994) konnte bei etwa 50% als lungengesund beschriebenen Sportpferden eine gering- bis mittelgradige Bronchitis nachweisen. Ein oft nur vereinzelt auftretender Husten ist ein wichtiges Merkmal (LITTLEJOHN, 1980;
ROBINSON et al. 1996), das häufig unterschätzt wird. Dabei ist nach LITTLEJOHN (1980) die Dauer des Auftretens von Bedeutung. Ein intermittierender Husten über einen Zeitraum von drei Monaten, der ursächlich nicht in den oberen Atemwegen und im Herz-Kreislaufsystem begründet ist, lässt zusammen mit einer Leistungsschwäche die Diagnose COB zu. Auch McPHERSON u. THOMSON (1983) halten ein chronisches Husten über drei Monate für ein klinisches Anzeichen der COB. Besteht der Husten für die Dauer von einem Jahr, ist die Diagnose einer COB höchst wahrscheinlich. Weiterhin ist eine erhöhte Atemfrequenz zu beobachten. Die Pferde zeigen eine erschwerte, doppelschlägige Ausatmung sowie ein inspiratorisches Nüsternblähen (McPHERSON u. THOMSON,1983). Nach DEEGEN u. ZIRCHNER (1970) treten klinische Anzeichen einer Ruhesdyspnoe erst bei einer hochgradigen chronischen Bronchitis auf, wobei Husten schon bei einer geringgradigen Ausprägung vorhanden ist. Seröser bis mukopurulenter Nasenausfluss kann in vielen Fällen beobachtet werden (McPHERSON u. THOMSON,1983; LITTLEJOHN, 1980).
Zur Diagnosesicherung werden Auskultation, Perkussion, Endoskopie, Röntgen, Zytologie des Tracheobronchialsekretes (TBS) und der Spülflüssigkeit der bronchoalveolären Lavage (BALF) sowie die Lungenfunktionsanalyse eingesetzt (DEEGEN, 1986).
Bei der Lungenauskultation findet man die unterschiedlichsten Befunde (SASSE, 1971). Diese Annahme begründet sich zum einen in den unterschiedlichen pathologischen Verlaufsformen der COB und in der Subjektivität der Interpretationen (LITTLEJOHN, 1980). Ein verschärft vesikuläres Atemgeräusch während der
Inspiration tritt schon bei geringgradiger Ausprägung der chronischen Bronchitis auf (DEEGEN u. ZIRCHNER, 1970) und ist zusammen mit dem sporadischen Husten oft das einzige typische Merkmal. Ein erweitertes Lungenfeld kann perkutorisch häufig bei einer mittelgradigen chronischen Bronchitis nachgewiesen werden.
Bei der endoskopischen Untersuchung der unteren Atemwege kann bei klinisch lungengesunden Pferden kein Sekret in Trachea und Bronchien nachgewiesen werden. Dagegen ist bei klinisch diagnostizierten chronischen Bronchitiden eine deutliche Hypersekretion feststellbar, auch wenn weder Husten noch Nasenausfluss vorhanden sind (FISCHER, 1980).
Anhand von Tracheobronchialsekret-Aspiraten kann man die in den Atemwegen ablaufenden Reaktionen darstellen. Auch ist eine Diagnose von subklinischen Lungenerkrankungen möglich (BEECH, 1975). Bei der chronisch obstruktiven Bronchitis bestimmen neutrophile Granulozyten das Zellbild. Ihre Anzahl nimmt mit der Schwere der Erkrankung zu (DIECKMANN u. DEEGEN, 1990). Bei einem Vergleich der Befunde, die aus der BALF gewonnen werden und der Tracheobronchialsekretzytologie werden zum Teil deutliche Abweichungen gefunden. Auch wenn die Auswertung des TBS eine klinisch leichter zugängliche Methode darstellt, kann sie die BALF nicht ersetzen, da das Sekret, das aus den oberen Atemwegen entnommen wird, nur einen Gesamtüberblick über die Vorgänge in den tiefen Atemwegen vermitteln kann (DERKSEN et al., 1989).
Unumstritten ist jedoch der Anstieg der neutrophilen Granulozyten in beiden Methoden im Zusammenhang mit einer COB (ROBINSON et al., 1996).
Ein weiteres diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung respiratorischer Imbalancen ist die arterielle Blutgasanalyse. Bei Störung des pulmonalen Gasaustausches kommt es zunächst zu einem Abfall des Sauerstoffpartialdruckes bei einem unveränderten Kohlendioxidpartialdruck (respiratorische Partialinsuffizienz). Erst bei massiven Gasaustauschstörungen ist auch der Kohlendioxidpartialdruck verändert (respiratorische Globalinsuffizienz) (DEEGEN, 1998).
2.1.3 Ätiologie
Die chronisch obstruktive Bronchitis wurde von DERKSEN (1993) als
„Berufskrankheit“ des Pferdes beschrieben, die sich aus den Haltungsbedingungen ergibt. Es ist ein multifaktorielles Geschehen, für das eine Vielzahl von Ursachen diskutiert werden:
2.1.3.1 Allergie
Eine allergische Komponente bei der Entstehung einer chronischen Bronchitis ist heute unbestritten. Verschiedene Allergene wie Mikropolyspora faeni, Aspergillus fumigatus und Futterstäube führen bei prädisponierten Pferden in bronchialen Provokationstests innerhalb von Stunden zu Obstruktionen der Atemwege.
Kontrolltiere zeigen auf diese Behandlung keine Reaktion. (McPHERSON et al., 1979). Messungen des Histamingehaltes in Plasma und BALF sowie der die Lungenepithelien bedeckenden Flüssigkeit zeigen bei COB Pferden 5 h nach Heuexposition einen signifikanten Anstieg des Histamins gegenüber den Kontrolltieren (McGORUM et al., 1993a). Die Autoren schließen auf eine allergische Spätreaktion.
Obwohl Hauttests mit spezifischen Antigenen an COB Pferden mehr positive Ergebnisse zeigen als an lungengesunden Pferden ist die Interpretation schwierig, da immunologische Reaktionen in beiden Gruppen auftreten (McGORUM et al., 1993b).
2.1.3.2 Toxische Genese
Das bei Rindern für das Weideemphysem (Fog fever) verantwortliche 3-Methylindol ist ein Abbauprodukt der Aminosäure L-Tryptophan. Diese kommt in Heu niedriger Qualität häufig vor (DERKSEN, 1991). Es scheint aber unwahrscheinlich, dass 3- Methylindol eine Rolle in der Ätiologie der COB spielt, da es beim Pferd, im
Gegensatz zum Rind kein übliches gastrointestinales Abbauprodukt darstellt (ROBINSON et al., 1996).
Stallstaub und Ammoniakdämpfe sowie mögliche Umweltgifte kommen ebenfalls als ein möglicher Auslöser in Betracht. Untersuchungen aus der Humanmedizin sehen einen Zusammenhang zwischen Luftverschmutzung und einer höheren Inzidenz an Asthma. Dieser Zusammenhang kann für das Pferd bislang nicht bestätigt werden, bedarf aber weiterer Untersuchungen (MAIR, 1995).
2.1.3.3 Viruserkrankungen
Im Anschluss an Virusinfektionen ist zu beobachten, dass bei einigen Pferden Krankheitssymptome persistieren, deren Verlauf in der Chronizität endet.
ROBINSON et al. (1996) sehen aber keinen kausalen Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Virusinfektion und der Auslösung von COB-ähnlichen Symptomen.
2.1.3.4 Genetische Faktoren
MARTI et al. (1991) beschreiben die chronische Bronchitis als eine multifaktorielle Erkrankung mit relativ starker genetischer Basis. Angaben über die Heritabilität fehlen jedoch. Da nicht alle Pferde unter den gleichen Haltungsbedingungen Symptome einer chronischen Bronchitis zeigen, ist anzunehmen, dass eine genetische Disposition für die Hyperreagibilität der Atemwege besteht.
2.1.3.5 Bewegungsmangel
Durch die physiologische Adrenalinfreisetzung bei Belastung wird die Lungenfunktion verbessert. Die sympathoadrenerge Reaktion führt zu einer Erhöhung der Zilienaktivität und durch Bronchialschleimverflüssigung zu einer Aktivierung der mukoziliären Clearance. Weiterhin kommt es zu einer Bronchialerweiterung und
Surfactantfreisetzung (DEEGEN et al., 1990; VERTER et al., 1999).
Bewegungsmangel führt zu einem Absinken der physiologischen Abläufe und somit zu einer Verminderung der Lungenfunktion.
2.1.4 Pathogenese der COB
Für die Ausprägung der charakteristischen Symptome der COB sind drei zentrale Pathomechanismen verantwortlich - die Obstruktion, die Entzündung und die unspezifische Hyperreagibilität (ROBINSON et al., 1996).
2.1.4.1 Obstruktion
Die Konstriktion der glatten Bronchialmuskulatur ist über eine Aktivierung muskarinerger Rezeptoren für den überwiegenden Anteil der Atemwegsobstruktion verantwortlich. Die Verabreichung von Atropin an Ponys mit COB zeigt eine deutliche Verringerung der Atemwegsobstruktion. Auch die Anwendung von Ipratropiumbromid, einem synthetischen Derivat des Atropins, zeigt eine Verminderung der Obstruktion bei an COB erkrankten Pferden (DUVIVIER et al., 1997; KREIME, 1981). Bei lungengesunden Ponys hat die Gabe von Atropin keinen Effekt, so dass hier von einem geringen initialen Tonus der glatten Muskulatur auszugehen ist. Da Atropin bei den erkrankten Ponys nicht zu einer vollständigen Aufhebung der Obstruktion führt, muss davon ausgegangen werden, dass auch Schleimansammlungen und entzündliche Schwellung der Bronchialschleimhaut einen Anteil an der Obstruktion der Atemwege haben (BROADSTONE et al., 1988).
Weiterhin führt eine Entzündung des Atemwegsepithels zu einem Freiliegen sogenannter „Irritant Receptors“. Sie gehören zu einer Gruppe von Rezeptortypen, die für den Hustenreflex verantwortlich sind und liegen unter dem Atemwegsepithel.
Die Erregung dieser Rezeptoren führt ebenfalls zu einer Bronchokonstriktion (WIDDICOMBE, 1975).
SCOTT et al. (1988b) zeigten eine erhöhte α1-Rezeptorempfänglichkeit, deren Ursache noch ungeklärt ist. Die Stimulation dieser Rezeptoren kann ebenfalls zu einer Bronchokonstriktion führen. Allerdings vermuten sie nur eine minimale Beteiligung an der mit einer COB verbundenen Bronchokonstriktion, da ein α1- Rezeptor-Antagonist zu keiner Besserung der Symptome führt.
Die Modulation der Acetylcholinausschüttung wird unter anderem über einen präsynaptisch lokalisierten α2-Rezeptor reguliert. Eine endogene Katecholaminausschüttung führt somit zu einer verminderten Freisetzung. WANG et al. (1995a) zeigten, dass dieser Rezeptor-Subtyp in COB erkrankten Pferden nicht voll funktionsfähig ist. Auch ZHANG et al. (1999) bestätigten diese Vermutung.
Allerdings ist die Bedeutung dieser Dysfunktion noch nicht untersucht.
Ein weiterer Ansatz, um die entstehende Bronchokonstriktion zu erklären, ist die verminderte Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) durch die Atemwegsschleimhaut von Pferden mit COB. PGE2 ist ein potenter Inhibitor der glatten Muskulatur und kann somit einer Kontraktion entgegenwirken (WANG et al., 1992). Durch eine eingeschränkte Produktion des PGE2 wird die Kontraktionsbereitschaft der Atemwege bei an COB erkrankten Pferden gefördert.
Es scheint, als sei das Resultat der Bronchokonstriktion nicht allein einer Ursache zuzuschreiben, sondern eine Interaktion zwischen glatter Muskulatur, neuronaler Kontrolle und multiplen Mediatoren (ROBINSON et al., 1996).
2.1.4.2 Entzündung
Wenn man an COB erkrankte Pferde in eine Umgebung mit Heu und Stroh bringt, bewirken diese Umweltbedingungen eine entzündliche Reaktion in den Atemwegen (ROBINSON et al., 1996). Neutrophile Granulozyten akkumulieren in der BALF innerhalb von 5 Stunden (McGORUM et al. 1993a). Von Neutrophilen freigesetzte Sauerstoffradikale, Entzündungsmediatoren und Enzyme schädigen das Lungengewebe und leisten der Entzündung Vorschub (ROBINSON et al., 1996).
2.1.4.3 Hyperreagibilität
Die Atemwege besitzen die Fähigkeit, ihren Durchmesser reversibel zu verändern, um sich den entsprechenden Umweltanforderungen anzupassen. Unter Hyperreagibilität versteht man eine überschießende Verengung der Atemwege als Antwort auf eine Vielzahl von auslösenden Faktoren wie beispielsweise Neurotransmitter, Entzündungsmediatoren und unspezifische Reize. Der Mechanismus der Hyperreagibilität beim Pferd ist unklar (ROBINSON et al., 1996).
Da die glatte Muskulatur der Atemwege von an COB erkrankten Pferden in vitro nicht übermäßig auf die Applikation von Acetylcholin oder Histamin reagiert (LeBLANC et al., 1991), muss die Hyperreagibilität durch die lokalen Umstände in den Atemwegen bedingt sein (ROBINSON et al., 1996). Die Hyperreagibilität entsteht in zeitlicher Abhängigkeit mit der Invasion der neutrophilen Granulozyten und könnte somit im Zusammenhang mit der Entzündungsreaktion stehen. Die entstehende Anschwellung der Atemwegsschleimhaut führt zu einer erheblich stärkeren Einengung der Atemwege im Zusammenhang mit einer Bronchokonstriktion, als dies allein durch Kontraktion der glatten Muskulatur möglich wäre (ROBINSON et al., 1996).
2.1.5 Pathomorphologische Veränderungen
Eine chronische Bronchiolitis resultiert in einer Hyperplasie und Metaplasie des Epithels (DAMSCH, 1988; SCHOON u. DEEGEN, 1983). Eine Erweiterung der Interzellularspalten konnte von IREGUI (1985) beobachtet werden. Weiterhin kann man eine Vermehrung und Größenzunahme der Becherzellen beobachten. Es erfolgt eine Verlegung der kleinen luftführenden Wege mit Schleim und neutrophilen Granulozyten. Peribronchiolär findet man zelluläre Infiltrate aus Lymphozyten, Plasmazellen, eosinophilen Granulozyten und Mastzellen (SCHOON u. DEEGEN, 1983; KAUP et al. 1985; IREGUI, 1985). Zusätzlich kann ein Verlust von zilientragenden Zellen beobachtet werden (KAUP et al., 1990a; KAUP et al., 1985;
IREGUI, 1985). Peribronchioläre Fibrosen treten zusammen mit Arealen eines chronischen alveolären Emphysem auf (SCHOON u. DEEGEN, 1983).
Clarazellveränderungen in Form von Granulaverlust und Zunahme des endoplasmatischen Retikulums können schon bei geringgradig erkrankten Pferden gesehen werden. Mit Verschlechterung des Krankheitsbildes nehmen auch die Veränderungen an den Clarazellen zu und es wird angenommen, dass Clarazellen als Zielzellen für Antigene und Entzündungsmediatoren eine Rolle spielen (KAUP et al. 1990b). Intrazelluläre Kristalle, die als Charcot-Leyden-Kristalle angesprochen werden, werden von mehreren Autoren gefunden (DAMSCH, 1988, KAUP et al., 1985, IREGUI, 1985) Man findet derartige kristalline Ablagerungen allerdings regelmäßig in entzündlichen Veränderungen beim Pferd, so dass ein Zusammenhang mit einem Degradationsprodukt eosinophiler Granulozyten mittlerweile eher spekulativ ist (KAUP, 2004; persönliche Mitteilung).
2.2 Regulation des Bronchotonus
2.2.1 Parasympathisches Nervensystem
Das parasympathische Nervensystem ist der nervale Hauptmechanismus, zur Regulation der Bronchialweite. Dies gilt sowohl für den Menschen als auch für die meisten bisher untersuchten Tierspezies (MINETTE u. BARNES, 1990).
Die rasche Abnahme des pulmonalen Widerstandes und die Zunahme der Lungencompliance nach Blockade der muskarinergen Rezeptoren durch Atropin bei an COB erkrankten Ponies legen nahe, dass ein Großteil des Bronchospasmus auch beim Pferd durch parasympathische Mechanismen vermittelt wird (BROADSTONE et al., 1988).
2.2.1.1 Muskarinerge Rezeptoren
Acetylcholin als Überträgerstoff des parasympathischen Nervensystems reagiert an prä- und postsynaptischen Membranen mit muskarinergen Rezeptoren. Diese Rezeptoren sind nicht homogen. Sie lassen sich nach ihrem molekularen Aufbau, der Art der Signaltransduktion und der Affinität unterschiedlicher Liganden verschiedenen Subtypen zuordnen (LÜLLMANN et al., 1996). Beim Pferd sind fünf Rezeptorsubtypen bekannt, von denen vier mit Hilfe verschiedener subtyp- spezifischer Antagonisten nachgewiesen werden konnten (VAN NIEUWSTADT et al., 1997; TÖRNEKE et al., 2002, MATERA et al., 2002). Der Nachweis geschieht in der glatten Muskulatur der Trachea, da nur in dieser Lokalisation pures Muskelgewebe vorhanden ist. Es ist bekannt, das die Spezifizierung der einzelnen Subtypen schwierig ist, da für ihre Ermittlung nur semiselektive Substanzen zur Verfügung stehen (TÖRNEKE et al., 2002).
M1-Rezeptoren finden sich an Nervenzellen, wo sie an der Überleitung der Aktionspotentiale beteiligt sind (VAN NIEUWSTADT et al., 1997). Der M2- Rezeptor ist sowohl präsynaptisch an der Nervenfaser als auch postsynaptisch an der glatten Muskulatur lokalisiert. An der Nervenfaser hemmen die präsynaptischen Rezeptoren im Sinne eines negativen Feedback die Acetylcholinausschüttung. Postsynaptisch mindern sie die Fähigkeit der β-Rezeptor-Agonisten, die Muskelfaser zu dilatieren (2.2.2). Zusätzlich können sie unabhängig von den β-Adreno-Rezeptoren die Bronchokonstriktion durch eine Erhöhung der Ca+-Sensibilität positiv beeinflussen (TÖRNEKE et al., 2002).
Hinsichtlich der Vermittlung einer Konstriktion der glatten Muskulatur in der Trachea gilt der M3-Subtyp als wichtigster Rezeptor (VAN NIEUWSTADT et al., 1997; EGLEN et al., 1996; YU et al. 1992). Bei Erregung des Rezeptors kommt es zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur durch die Erhöhung des intrazellulären Ca+- Spiegels (EGLEN et al., 1996). Es wird angenommen, dass der M4-Subtyp einen präsynaptischen Rezeptor darstellt, der die Ausschüttung des Acetylcholins aus den Nervenendigungen steuert (KILBINGER et al. 1995; WANG et al., 1995b).
Die Bedeutung der M2- und M4-Rezeptoren der Atemwege für das Pferd ist noch nicht hinreichend geklärt. YU et al. (1992) fanden keine Anzeichen für ein Vorhandensein präsynaptischer M2 Rezeptoren beim Pferd, schlossen aber deren Existenz nicht aus.
Studien über die Verteilung muskarinerger Rezeptoren entlang der Atemwege beim Pferd zeigen, das es keinen Gradienten von der Trachea bis zu den kleinen Bronchien gibt. Die Anzahl ist auf jedem Level etwa gleich. Die Exprimierung der einzelnen Subtypen in der glatten Muskulatur der Trachea zeigen eine Dominanz der M2- und M4-Rezeptoren (TÖRNEKE et al., 2002).
Eine Charakterisierung den Subtypen in Trachea, Bronchien und Lungenparenchym mittels Radioligandbindungsstudien wurde von ABRAHAM et al. (2003) durchgeführt.
In den Membranen von Tracheal- und Bronchalepithel mit darunterliegender glatter Muskulatur ist der M2 Rezeptor höher exprimiert als der M3 Rezeptor (80%:20%, M2:M3). Dagegen wurde im Lungenparenchym eine ausgewogene Verteilung von M1, M2 und M3 Subtypen gefunden.
2.2.1.2 Parasympathomimetika
Der natürliche Transmitter des parasympathisches Nervensystems ist Acetylcholin (Abbildung 2-1). Es wird im Axoplasma der präsynaptischen Nervenendigungen synthetisiert und in Vesikeln gespeichert. Die Freisetzung erfolgt durch einen Ca+- Einstrom in die Nervenfaser infolge eines Aktionspotentials was eine Verschmelzung der Vesikel mit der Zellmembran zur Folge hat. Im synaptischen Spalt wird das Acetylcholin sehr schnell durch die ortsständige Acetylcholinesterase gespalten; das führt zu einer vollständigen Inaktivierung. Neben dieser spezifischen Acetylcholinesterase existiert eine unspezifische im Plasma und in der Leber. Der Abbau des Acetylcholins erfolgt so rasch, dass keine therapeutische Anwendung möglich ist. Ein synthetischer Cholinester ist das Metacholin (Abbildung 2-2). Es wurde durch Substitution einer Methylgruppe aus Acetylcholin entwickelt und ist so vor dem Abbau durch die unspezifische Cholinesterase geschützt. Ein weiteres direkt wirksames Parasympatomimetikum ist der Carbaminsäureester Carbachol. Durch
seinen langsameren Abbau ist es auch zur therapeutischen Anwendung geeignet (LÖSCHER, 2002).
Abbildung 2-1: Strukturformel von Acetylcholin
Abbildung 2-2: Strukturformel von Metacholin
2.2.1.3 Beteiligung des Parasympathikus an der chronisch obstruktiven Bronchitis Klinisch an COB erkrankte Ponys zeigen eine signifikante Erniedrigung des Lungenwiderstandes nach intravenöser Applikation von Atropin. Dies legt nahe, dass ein Großteil des erhöhten Lungenwiderstandes durch die Kontraktion der Atemwege über die Erregung von muskarinergen Rezeptoren vermittelt wird (BROADSTONE et al., 1988).
YU et al. (1992) vermuten, dass dies an einer Up-Regulation der M3-Rezeptoren liegen könnte. In-vitro-Versuche an glatter Muskulatur der Atemwege zeigen eine geringere Reaktionsbereitschaft auf Acetylcholin bei an COB erkrankten Pferden im Gegensatz zur Kontrollgruppe (LEBLANC et al. 1991). Diese Ergebnisse sprechen gegen eine Erhöhung der M3-Rezeptorzahl. Auch ein Vergleich der Gesamtrezeptorzahl und der Subtypenverteilung bei gesunden und an COB erkrankten Pferden mittels Radioligandbindungsstudie ergab keine signifikanten Unterschiede (ABRAHAM et al. 2003).
Der negative Feedback-Mechanismus der präsynaptischen Rezeptoren, der die eigene Acetylcholinausschüttung kontrolliert, kann ebenfalls an der Entstehung der chronisch obstruktiven Bronchitis beteiligt sein. Menschen, die an Asthma erkrankt sind, zeigen eine Dysfunktion des präsynaptischen M2-Rezeptors (MINETTE et al., 1989). Eine Dysfunktion dieser die Acetycholinfreisetzung hemmenden Rezeptoren würde zu einem Anstieg des Acetylcholins im synaptischen Spalt führen und somit zu einer verstärkten Bronchokonstriktion (ZHANG et al. 1999; WANG et al. 1995a).
2.2.2 Sympathisches Nervensystem
Das sympathische Nervensystem hat als Überträgerstoffe an der Erfolgszelle Noradrenalin aus den Varikositäten der Nervenaxone. Es wirkt über eine Erregung der α1- ,α2-, β1- und β2-Rezeptoren. An der glatten Muskulatur führen α1-Rezeptoren zu einem Anstieg der intrazellulären Ca+-Konzentration, das zu einem Tonusanstieg führt. Im Gegenzug vermitteln β2-Rezeptoren über eine Erhöhung des cAMP- Spiegels eine Dilatation der glatten Muskulatur. α2-Rezeptoren senken den cAMP- Spiegel in der Zelle und wirken so der Dilatation entgegen (LÜLLMANN et al. 1996).
Bei an Asthma erkrankten Menschen führt eine Blockade der β-Rezeptoren zu einer Bronchokonstriktion während gesunde Individuen nicht oder nur gering reagieren (RICHARDSON u. STERLING, 1969). Entsprechend führt eine Blockade der β- Rezeptoren bei an COB erkrankten Ponys zu einem signifikanten Anstieg des Lungenwiderstandes, hat aber keinen Effekt auf die Compliance und die Reagibilität der Atemwege. Lungengesunde Ponys zeigen keine Reaktion auf eine β- Rezeptorblockade (SCOTT et al., 1988a).
Die Bronchodilatation nach Applikation von β-Agonisten wird beim Pferd wie bei den meisten anderen Spezies über eine Interaktion mit β2-Rezeptoren vermittelt (OLSON et al.,1989; SCOTT et al., 1991). Radioligandbindungsstudien bestätigen, dass die Dichte der β-Rezeptoren im Epithel der Trachea höher ist als in der glatten Muskulatur (TÖRNEKE, 1999).
2.2.2.1 β2-Rezeptor-Agonisten
Aus der Gruppe der β2-selektiven Sympathomimetika ist nur Clenbuterol (Abbildung 2-3) ein in der Veterinärmedizin zugelassenes Broncholytikum. Es wird in einer Dosierung von 0,8 µg/kg KGW (2 x tgl.) beim Pferd eingesetzt. Die Wirkungsdauer beim Pferd ist relativ lang, da die Halbwertzeit bei 20 Stunden liegt (LÖSCHER, 2002). Nach einer Applikation (oral oder intravenös) von Clenbuterol in der oben genannten therapeutischen Dosierung, konnte bei Pferden mittels HPLC/ELISA im Serum bis zu 24 Stunden (i.v.) und 48 Stunden (oral) ein Nachweis erbracht werden.
Im Urin gelang der Nachweis bis zu über vier Tage (Nachweisgrenze 0,04 ng/ml) (HAGEDORN et al., 1995).
Nach einer oralen Applikation von Clenbuterol in der therapeutisch vorgeschriebenen Dosierung von 0,8 µg/kg KGW zweimal täglich wird ein Plasmaspiegel von 0,45-0,75 ng/ml mit einem Plateau nach 36 Stunden erreicht (KALLINGS et al. 1991).
Abbildung 2-3: Strukturformel von Clenbuterol
DERKSEN et al. (1987) versuchte, eine histamin-induzierte Bronchokonstriktion mit Clenbuterol aufzuheben. Er konnte aber bis zu einer Dosierung von 1,6 µg/kg KGW Clenbuterol keinen Effekt nachweisen. Im Gegensatz dazu zeigte SASSE (1988) in einer Studie, dass Clenbuterol die Lungenfunktion von an COB erkrankten Pferden signifikant verbesserte. In einer Untersuchung mit 239 Pferden versuchten ERICHSEN et al. (1994), die Effizienz von Clenbuterol bei COB Pferden zu belegen.
Die Dosierungen wurden in Abhängigkeit vom Wirkungseintritt in mehreren Schritten von 0,8 µg/kg KGW auf 3,2 µg/kg KGW erhöht. 25% der Pferde reagierten auf eine Dosierung von 0,8 µg/kg KGW. Nach Verdopplung auf 1,6 µg/kg KGW zeigten 50%
der Pferde eine Besserung und 75% Besserung wurden nach Verabreichung von 3,2 µg/kg KGW erreicht. Die Studie zeigt, dass unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur 25% der Pferde einen positiven Effekt zeigen, wenn die übliche Dosierung von 0,8 µg/kg KGW eingehalten wird.
Eine von INGVAST-LARSSON (1991) durchgeführte In-vitro-Untersuchung belegt, dass der relaxierende Effekt von Clenbuterol auf mit Carbachol kontrahierten Trachealstreifen sehr variabel ist. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, das die Effizienz von Clenbuterol abhängig ist von der Konzentration des zur Bronchokonstriktion verwendeten Carbachols. Wird eine niedrigere Carbachol- konzentration eingesetzt, werden die Muskelstreifen durch das Clenbuterol zu 100%
relaxiert (TÖRNEKE et al. 1998).
Ein weiterer Effekt der β2-selektiven Sympathomimetika ist eine Steigerung der mukoziliären Transportrate. Die Aufgabe der mukoziliären Clearance ist die Entfernung von Partikeln aus den tiefen Atemwegen. Bei an COB erkrankten Pferden ist dieser Mechanismus gestört. Nach Applikation von Clenbuterol kann ein signifikanter Anstieg der mukoziliären Transportrate sowohl in den gesunden als auch in den an COB erkrankten Pferden festgestellt werden (TURGUT u. SASSE, 1989).
Nach längerer Applikation von β2-selektiven Sympathomimetika kommt es zu einer Desensibilisierung (Down-Regulation) der β2-Rezeptoren. Auch Lymphozyten enthalten eine homogene Population an β2-Rezeptoren, die in Anzahl und Eigenschaften vergleichbar sind mit denen in anderen Geweben. Die Studien über agonist-induzierte oder krankheitsbedingte Rezeptorveränderungen können an diesem Modell hinreichend untersucht werden. Bei einer Behandlung lungengesunder Pferde mit Clenbuterol in der empfohlenen therapeutischen Dosierung kommt es innerhalb von 48 Stunden zu einer Abnahme der Dichte der lymphozytären β2-Rezeptoren um etwa 30-40%. Im Verlauf der Behandlung bleibt die Gesamtzahl auf diesem niedrigen Niveau. Nach dem Absetzen des Medikamentes
werden die Ausgangswerte erst nach 4 Tagen wieder erreicht. Inwiefern diese Veränderungen auch bei an COB erkrankten Pferden auftreten, ist noch nicht untersucht (ABRAHAM et al., 2001).
2.2.3 Nicht-adrenerge nicht-cholinerge Innervation der Atemwege (NANC)
Neuronale Reaktionen der Atemwege, die weder durch Adreno- Rezeptorantagonisten noch durch Cholino-Rezeptorantagonisten blockiert werden können, bezeichnet man als nicht-adrenerg nicht-cholinerg (NANC) (MATERA et al., 2002).
2.2.3.1 Nicht-adrenerges nicht-cholinerges exzitatorisches System (eNANC)
Histologische und pharmakologische Studien haben gezeigt, dass eNANC Nerven Drüsen, Blutgefäße, und glatte Muskulatur in der Lunge direkt innervieren und unter dem Epithel ein Netzwerk aus Nervenfasern formen, die teilweise die Epithelschicht penetrieren (MATERA et al., 2002). Als Neurotransmitter des eNANC wird Substanz P beschrieben. Eine Radioligand-Bindungsstudie zeigt eine dreifach höhere Konzentration an Substanz P-Rezeptoren in Epithel, Blutgefässen und Drüsen, im Gegensatz zur glatten Muskulatur (SONEA et al., 1999). Die aus einer Aktivierung des eNANC resultierenden Effekte sind unter anderem Vasodilatation, Aktivierung von Entzündungszellen, Kontraktion der glatten Muskulatur, und Mukus Sekretion (MATERA et al., 2002).
2.2.3.2 Nicht-adrenerges nicht-cholinerges inhibitorisches System (iNANC)
Die inhibitorische Innervation der glatten Muskulatur der Trachea und der Stammbronchien wird zum großen Teil durch das iNANC vermittelt (YU et al., 1994).
Stickstoffmonoxid (NO) gilt als Neurotransmitter des iNANC (DERKSEN u.
ROBINSON, 2002; MATERA et al., 2002). Die physiologische Bedeutung des NO für das Pferd ist unklar (DERKSEN u. ROBINSON, 2002). MATERA et al. (2002) sehen die Funktion des NO in der Antagonisierung der parasympathischen Neurotransmission und der Modulation der sensorischen Nervenfasern. In an COB erkrankten Pferden scheint das iNANC gestört durch einen raschen Abbau des NO, bedingt durch erhöhte Level freier Sauerstoffradikale, die als Folge der Entzündungsreaktion auftreten (DERKSEN u. ROBINSON, 2002; MATERA et al., 2002).
2.2.4 Histamin
Histamin (Abbildung 2-4) ist ein biogenes Amin, welches durch Decarboxylierung aus Histidin gebildet wird. Katalysiert wird diese Reaktion durch das Enzym Histidindecarboxylase. Histamin kommt hauptsächlich in der Speicherform gebunden an Heparin und in Mastzellen vor. In den einzelnen Geweben ist es unterschiedlich verteilt, abhängig vom Mastzellgehalt. Im Hypothalamus existieren weiterhin histaminerge Neurone, die den Schlaf-Wach-Rhythmus regulieren (STARKE u.
PALM, 1992).
Abbildung 2-4: Strukturformel von Histamin
HN N
CH
2CH
2NH
2Die unterschiedlichen biologischen Wirkungen des Histamins lassen sich verschiedenen Rezeptoren (H1, H2, H3, H4) zuordnen. Alle Rezeptoren finden sich postsynaptisch. Die H3-Rezeptoren wurden auch präsynaptisch nachgewiesen. H4- Rezeptoren sind bislang nur bei Menschen, Mäusen, Ratten und Meerschweinchen
sicher nachgewiesen (LIU et al, 2001). Die Bronchokonstriktion ist H1-Rezeptor vermittelt (CHAND u. EYRE, 1978). In-vitro-Versuche zeigen, dass die Applikation von Histamin auf isolierte Muskelstreifen aus Trachea und Bronchien zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur führt (CHAND u. EYRE, 1978; DERKSEN et al., 1987; OLSON et al., 1989; DOUCET et al., 1990). Die intravenöse Applikation von Histamin führt bei lungengesunden Pferden erst in einer Dosierung von 1mg/500 kg KGW zu Änderungen des intrathorakalen Druckes und zu respiratorischen Erscheinungen, wogegen an COB erkrankte Pferde schon bei einer Dosierung von 0,05 mg/ kg KGW mit einer Veränderung des intrathorakalen Druckes reagieren und eine Erhöhung auf 0,25 mg/500 kg KGW zu ausgeprägter Dyspnoe führt (OBEL u.
SCHMITERLÖW, 1948).
Wird das Histamin von Pferden als Aerosol eingeatmet, werden höhere Konzentrationen (20 mg/500 kg KGW) benötigt, um respiratorische Effekte zu beobachten (MIRBAHAR et al., 1985).
McGORUM et al. (1992) untersuchten die Konzentrationen von Histamin in Plasma und broncho-alveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) von lungengesunden Pferden und Pferden mit COB. Die Histaminkonzentrationen wurden ermittelt bevor und nachdem die Pferde Heu und Stroh ausgesetzt waren. In dieser Studie lagen die Histaminkonzentrationen im Plasma bei 0,24 ng/ml und in der BALF bei 1,78 ng/ml.
Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den an COB erkrankten Tieren.
2.2.5 Provokationstests der Atemwege beim Pferd in vivo
Die beim Pferd angewendeten Bronchoprovokationstests sind abgeleitet aus der Humanmedizin (COCKCROFT et al., 1977). Die Lungenfunktion kann mit unterschiedlichen Verfahren wie der konventionellen Lungenfunktionsprüfung mittels Oesophagusdrucksonde (KLEIN u. DEEGEN, 1986, VANDENPUT et al., 1998) oder der Oszillometrie (VAN ERCK et al., 2003) gemessen werden (HOFFMANN, 2002a).
Ziel dieser Messungen ist es einerseits frühe Stadien der Lungenerkrankungen zu
erkennen. Weiterhin wird mit Hilfe dieser Methoden auch die pharmakologische Beeinflussung und die Reagibilität der Atemwege mittels Bronchoprovokation gemessen (HOFFMANN, 2002a).
2.2.5.1 Der Histamin-Inhalations-Provokationstest (HIPT)
Beobachtungen von WEISS et al. (1929) zeigten, dass lungenkranke Patienten auf eine intravenöse Gabe von Histamin mit einer stärkeren Atemnot reagieren als gesunde Menschen. Auch inhaliertes Histamin führte zu ähnlichen Ergebnissen (CURRY, 1946). KLEIN (1984) etablierte den HIPT für die Anwendung beim Pferd und konnte in seinen Untersuchungen zeigen, dass an COB erkrankte Pferde deutlich stärker auf inhaliertes Histamin reagierten als lungengesunde Pferde. Auch DOUCET et al. (1991) konnten diese Beobachtung in eigenen Untersuchungen bestätigen. DERKSEN et al. (1987) fanden eine Hyperreagibilität klinisch an COB erkrankter Ponys auf inhaliertes Histamin, aber keine Reaktion derselben Tiere während der klinischen Remission. HOFMANN (2002b) zeigte auf, dass Pferde ohne Hinweis auf das Vorliegen einer COB aber mit abnormen zytologischen Befunden in der BALF ebenfalls eine Hyperreagibilität nach Histamin-inhalation aufweisen und somit der HIPT auch zur Erkennung einer IAD ohne klinische Ausprägung geeignet ist. Die Wirkung des Histamins beruht auf einer lokalen Reaktion an der glatten Muskulatur der Atemwege über Histaminrezeptoren, was zu einer Bronchokonstriktion führt (2.2.4). Weiterhin erfolgt über die Reizung von „irritant Receptors“ (2.1.4.1) eine vagus-induzierte Reflexbronchokonstriktion (COCKCROFT et al., 1977).
2.2.5.2 Provokationstests der Atemwege mit Parasympathomimetika
Neben der Inhalation von Histamin, kann auch Metacholin als Aerosol an Pferde verabreicht werden, wo es dosisabhängig zu einer unspezifischen Bronchokonstriktion führt (ARMSTRONG et al., 1986; FAIRBAIRN et al., 1993; VAN
ERCK et al., 2003). Metacholin provoziert über muskarinerge Rezeptoren eine Kontraktion der glatten Muskulatur der Atemwege, was eine Bronchokonstriktion bewirkt (2.2.1.1, 2.2.1.2). Auch Carbachol führt als Aerosol zu einer Bronchokonstriktion. Allerdings wurde hier als Nebenwirkung eine starke Salivation beschrieben, die eine Lungenfunktionsprüfung erst 20 Minuten nach Carbacholinhalation möglich machte. Nach diesem Zeitraum waren die respiratorischen Symptome der Pferde abgeklungen (MIRBAHAR et al., 1985).
2.3 In-vitro-Methoden zur Untersuchung von Lungengewebe
Es existieren verschiedene Methoden zur Untersuchung von Lungengewebe beim Pferd in vitro. Die Notwendigkeit, den Ablauf der Bronchokonstriktion bis ins Detail zu verstehen und den Einfluss verschiedener pharmakologischer Substanzen auf das Lungengewebe zu erforschen, machen es notwendig, entsprechende Untersuchungsmethoden zu etablieren.
2.3.1 Untersuchungen am Musculus trachealis
Um die Bronchokonstriktion untersuchen zu können, ist es wichtig, Studien an der glatten Muskulatur der Atemwege durchzuführen. Um isolierte Muskulatur zu erhalten, eignet sich am besten der M. trachealis, der die Knorpelspangen der Trachea zu einem Ring zusammenfügt. Hier kann man durch einfache Präparation Muskelgewebe ohne anhängendes Lungenparenchym gewinnen.
Zur Präparation wird das Mittelstück der Trachea, ca. zwischen der 16. und 25.
Knorpelspange über der Carina tracheae, entnommen. Der Musculus trachealis wird freipräpariert und in ein Gewebebad mit Nährlösung überführt. Die Trachealmuskulatur wird an beiden Enden fixiert und die Kontraktionen über einen Spannungsmesser aufgezeichnet (CHAND u. EYRE, 1978; OLSON et al., 1989;
WANG et al., 1995a; WANG et al., 1995b; KILBINGER et al., 1995; ZHANG et al., 1999; VAN NIEUWSTADT et al., 1997). Die Kontraktionen können mit Hilfe der
elektrischen Feldstimulation provoziert werden (WHANG et al., 1995b; KILBINGER et al., 1995). Hierzu werden zwei Elektroden in dem Gewebebad platziert und über eine Stromquelle elektrische Reize erzeugt. Eine weitere Methode zur Erzeugung von Kontraktionen ist die Applikation von bronchokonstriktorischen Substanzen wie Acetylcholin oder Histamin in das Gewebebad (CHAND u. EYRE, 1978; OLSON et al., 1989; DOUCET et al., 1990).
Der Vorteil dieser Methode ist, dass man mit reinem Muskelgewebe arbeitet und störende Interaktionen mit Lungenparenchym vermeidet. Die Entnahme des Gewebes und die Präparation der Muskelstreifen gestaltet sich zudem relativ einfach. Allerdings ist es schwierig, eine Aussage über die Abläufe im distalen Atmungstrakt mit dieser Methode zu treffen.
2.3.2 Untersuchungen mit Lungenparenchymstreifen
Um die Reaktionen der distalen Atemwege zu untersuchen, kann man Studien mit Parenchymstreifen aus Lungengewebe durchführen (DOUCET et al., 1990;
OLZWESKI et al., 1997). Hierfür wird Gewebe aus der Lungenperipherie entnommen, welches augenscheinlich frei ist von größeren Blutgefässen. Die Gewebestreifen werden an beiden Seiten mit Seidenfäden befestigt und in einem Gewebebad platziert. Mit Hilfe eines Spannungsmessers wird die Kontraktion der Gewebeproben aufgezeichnet. Nach DOUCET et al. (1990) ist es notwendig, die Untersuchungen auf drei Stunden post mortem zu begrenzen, da das Parenchym schnell autolytisch wird. Im Gegensatz zu den oben besprochenen Trachealstreifen zeigen Parenchymstreifen während der Versuche oftmals spontane Kontraktionen;
das erschwert die Erstellung stabiler Basiswerte. Obwohl das Lungenparenchym ebenfalls auf die Applikation von Metacholin, Histamin und Serotonin mit Kontraktionen antwortet, sind die Ergebnisse beträchtlichen Variationen unterworfen (DOUCET et al., 1990). OLSZEWSKI et al. (1997) wiesen ebenfalls Kontraktionen auf applizierte Spasmogene nach. Allerdings war die kontraktile Antwort des
Lungenparenchyms im Vergleich zu isolierten Atemwegen deutlich geringer. Die Autoren vermuten als Ursache eine geringere Anzahl an kontraktilen Elementen.
Die heterogene Natur der Parenchymstreifen macht auch hier die Interpretation der Ergebnisse schwierig, da man eine Interaktion mit Blutgefäßen und anderen Zelltypen nicht ausschließen kann (DOUCET et al., 1990).
2.3.3 Untersuchungen an isolierten Bronchien
Die Untersuchung von Atemwegsegmenten, die weiter distal in den Atemwegen lokalisiert sind, findet an isolierten Bronchien statt. Es werden Bronchien mit einem Durchmesser von 3-4 mm und einer Länge von 5mm präpariert. Nachdem das überflüssige Gewebe abpräpariert worden ist, werden sie in ein Gewebebad mit Nährlösung überführt (LeBLANC et al., 1991; LeBLANC et al., 1993; BENAMOU et al., 2003). Die Ringsegmente werden an zwei Bügeln befestigt. Einer der beiden Bügel ist beweglich und mit einem Spannungsmesser verbunden. Die Kontraktionen der Bronchien können so aufgezeichnet werden.
OLSZEWSKI et al. (1997) etablierten eine Methodik zur Isolation terminaler Atemwege mit einem Durchmesser von 1-2,5 mm. Die isolierten Atemwege zählen zur Generation 12-16 und sind die kleinsten Atemwege, die noch Knorpelelemente enthalten (OLSZEWSKI et al., 1999). Es werden Parenchymsäulen aus dem Lungengewebe herausgeschnitten, die einen zentralen Atemweg enthalten. Das überschüssige Gewebe sowie alle sichtbaren Blutgefäße werden bis auf eine schmale Säule um den Atemweg abpräpariert. Dieser Atemweg wird an seinen Enden mit Seidenfäden befestigt und mit dem Spannungsmesser verbunden. Der schmale Anteil an Parenchym, der für die Befestigung notwendig ist, scheint für die Interpretation der Ergebnisse unbedeutend zu sein (OLSZEWSKI et al., 1997).
2.3.4 Precision Cut Lung Slices (PCLS)
Eine Methode zum Erstellen von präzisionsgeschnittenem Gewebe wurde erstmals von KRUMDIECK et al. (1980) vorgestellt. Mit einem manuell zu bedienenden Mikrotom konnten Serienschnitte in einer nahezu identischen Dicke hergestellt und unter Zellkulturbedingungen inkubiert werden. Die Schichtdicke konnte zwischen 160-640 µm variiert werden. Um Lungengewebe in dieser Form schneiden zu können, musste eine Befüllungstechnik des Lungengewebes mit Agarose entwickelt werden (PLACKE u. FISHER, 1987).
DANDURAND et al. (1993) zeigten, dass man anhand von Lungenschnitten die Möglichkeit hat, eine Bronchokonstriktion zu untersuchen. Die Schichtdicke der PCLS betrug in dieser Untersuchung ca. 500-1000 µm.
MARTIN et al. (1996) entwickelten die Technik zum Erstellen von PCLS aus Lungengewebe von Mäusen, Ratten und Menschen weiter und waren so in der Lage, unter standardisierten Bedingungen Lungenscheiben in einer Schichtdicke von 250 µm zu erstellen und über 72 Stunden zu kultivieren. Die geringere Schichtdicke führt zu einem minimalen Auftreten von Artefakten und verringert das Auftreten von schräg angeschnittenen Atemwegen. Weiterhin ist durch die größere Oberfläche im Verhältnis zum Gewebe eine bessere Versorgung der Schnitte mit Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet (MARTIN et al., 1996).
Mit Hilfe der digitalen Aufzeichnung von Videoaufnahmen und Fotos ist es möglich die Bronchokonstriktion zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Methode, bei der die histologische Struktur des Gewebeverbandes erhalten bleibt, scheint den Parenchymstreifen und den isolierten Bronchien überlegen. Die Kontraktionen der Parenchymstreifen können nicht sicher den Atemwegen zugeschrieben werden, und die Untersuchungen an isolierten Atemwegen beziehen die Interaktionen mit dem umgebenden Parenchym nicht ein.
Ein weiterer Vorteil ist, dass man Atemwege verschiedener Größe miteinander vergleichen kann. Es können auch sehr weit distal gelegene Atemwege mit einem Durchmesser von bis zu 110 µm in die Untersuchungen miteinbezogen werden (WOHLSEN et al., 2001). MARTIN et al. (1996) konnten beispielsweise zeigen, dass
kleine Atemwege sensitiver auf Metacholin reagieren. Die Sensitivität der kleinen und großen Atemwege bezüglich unterschiedlicher Agonisten ist verschieden, (WOHLSEN et al., 2001) so dass mit dieser Methodik ein probates Mittel zur Untersuchung dieser Unterschiede vorhanden ist.
2.3.4.1 Methodik zum Erstellen von PCLS aus der Mäuselunge
Nach MARTIN et al. (1996) wird im Anschluss an eine Injektion von Pentobarbital die Trachea der Mäuse freipräpariert und über eine Inszision eine Beatmungsmaschine angeschlossen. Die Lunge wird während des gesamten Eingriffes mit einer Frequenz von 80 Zügen/Minute belüftet. Nach laparoskopischer Eröffnung wird das Diaphragma entfernt und Heparin in die rechte Herzkammer injiziert. Nachdem die Tiere über einen Schnitt in die Vena cava entblutet sind, wird die Lunge über einen Katheter gespült, bis sie blutleer ist.
Die Entnahme von Lunge und Herz geschieht im Verbund. Um mehr Stabilität in das Gewebe zu bekommen, werden die Lungen mit einem Agarose-Medium-Gemisch befüllt. Es wird hierfür eine low melting point agarose verwendet, die sich bereits bei einer Temperatur von 37°C verflüssigt. Die Befüllung erfolgt über die Trachea, bis die Lunge mit Agarose gefüllt ist. Um die Agarose auf 4°C herunterzukühlen wird die Lunge auf Eis überführt. Nachdem die Agarose ausgehärtet ist, werden aus dem Gewebe mit einem scharfen, rotierenden Gewebeschneider Kernstücke ausgeschnitten, die einen Durchmesser von 8 mm besitzen. Aus diesen Gewebezylindern werden mit Hilfe eines Mikrotoms (Krumdieck tissue slicer, Alabama Research and Development, Munford, USA) Gewebescheiben mit einer Schichtdicke von 250 ± 20 µm geschnitten, die sofort in Zellmedium überführt werden. Die Lungenschnitte werden anschließend bei 37°C inkubiert. Bei dieser Temperatur verflüssigt sich die in den Schnitten befindliche Agarose wieder und kann durch mehrfachen Mediumwechsel ausgewaschen werden (MARTIN et al. 1996).
2.3.4.2 Methodik zum Erstellen von PCLS aus der Menschenlunge
Um Untersuchungen an humanem Lungengewebe durchführen zu können, wurde von WOHLSEN et al. (2003) eine Methode entwickelt, PCLS aus Lungenflügeln von Menschen zu gewinnen. Operativ entfernte Lungenflügel werden über den Hauptbronchus mit ca. 500-800 ml Agarose befüllt und nach der Aushärtung das makroskopisch gesund erscheinende Gewebe zur Gewinnung der PCLS herangezogen. Das Erstellen der PCLS erfolgt analog der Methodik an der Mäuselunge (2.3.4.1).
2.3.4.3 Untersuchungen an PCLS
Unter den Bedingungen der Inkubation bei 37° C in Zellkulturmedium sind die PCLS bis zu 72 Stunden lebensfähig. Wenn man die Funktion berücksichtigt, konnten keine Unterschiede in der metacholin-induzierten Kontraktion über 28 Stunden festgestellt werden (MARTIN et al., 1996). Die Lebensfähigkeit kann nach Literaturangaben über das Austreten von LDH (Laktat Dehydrogenase) in das umgebende Medium beurteilt werden. Das Austreten von LDH kann vermindert werden, wenn die Inkubation anstatt in Gewebekulturplatten in einem dynamischen Rollersystem durchgeführt wird, in dem die Schnitte eine permanente Bewegung erhalten. Dieses System ist daher dem statischen vorzuziehen (MARTIN et al., 1996).
Ein weiterer potenter Vitalitätsfaktor ist der Zilienschlag des Flimmerepithels. EBSEN et al. (2002) beobachteten bei PCLS aus Ratten- und Affenlungen einen Zilienschlag bis zu 96 Stunden, wobei eine unverminderte Aktivität bis zu 72 Stunden zu beobachten war. Das Schlagen der Zilien entlang des Atemwegsepithels kann mit einer Kamera aufgezeichnet werden. Hierfür benötigt man ein Gerät welches mindestens 62 Bilder in der Sekunde aufnehmen kann. Die Schlagfrequenz kann durch spezielle Verfahren ermittelt werden. In PCLS aus menschlichen Lungen liegt die Schlagfrequenz zwischen 5-12 Hz bei einer Temperatur von 37°C (WOHLSEN et al., 2003).
Die Untersuchungen der Atemwege finden unter einem inversen Mikroskop statt. Die Schnitte verbleiben während der gesamten Zeit im Medium und können entweder in den Gewebekulturplatten unter dem Mikroskop untersucht werden (DANDURAND et al., 1993) oder in einer speziellen Inkubationskammer (MARTIN et al., 1996). Diese Kammer ist an ein Wasserbad angeschlossen, es gewährleistet eine konstante Temperatur der Schnitte. Die Schnitte befinden sich in Kammern mit Medium, die durch eine Öffnung mit verschiedenen Substanzen befüllt werden können. Damit die Schnitte nicht flotieren, werden sie durch dünne Nylonfäden gehalten, die an einem Platindraht befestigt sind.
2.3.4.4 Messung der Atemwege
Die Auswertung der Atemwegskontraktilität erfolgt über die Berechnung der Fläche des Atemwegslumens. Sie wird bestimmt, indem man entlang dem Atemwegslumen an der Epithelgrenze eine Markierung setzt und über eine Software die Fläche errechnet (MARTIN et al., 1996). Die ursprüngliche Fläche des unbehandelten Atemweges wird als 100% angenommen. Die Messung der Fläche scheint ein zuverlässiges Maß für die Untersuchungen an Atemwegen zu sein und sollte der Messung des Durchschnittes eines Atemweges vorgezogen werden (WOHLSEN et al., 2003)
2.3.4.5 Kontraktilität
Durch die Applikation von Metacholin konnten DANDURAND et al. (1993), MARTIN et al. (1996), und KOTT et al. (2002) in den Atemwegen der PCLS eine Bronchokonstriktion auslösen. Der Grad der Konstriktion ist konzentrationsabhängig.
Das Alter der Schnitte beeinflusst die Kontraktion nicht. Vergleiche an Schnitten nach 5-8 Stunden, 15-18 Stunden und 24-28 Stunden ergaben keinen signifikanten Unterschied (MARTIN et al., 1996).
Durch eine Inkubation von PCLS mit einer Mischung aus Tumor-Nekrose-Faktor α, Interleukin-1β und Interferon γ kann ebenfalls eine Kontraktion der Atemwege induziert werden (MARTIN et al., 2001).
Im Prinzip ist es auch möglich, in PCLS eine Vasokonstriktion zu erzeugen und zu quantifizieren. Problematisch ist dabei die Unterscheidung zwischen der A.
pulmonalis, der V. pulmonalis und der A. bronchialis (MARTIN et al., 1996).
2.3.4.6 Relaxation
Nach MARTIN et al. (1996) sind Bronchodilatatoren (z.B. β2-Agonisten) in der Lage, die Kontraktion der glatten Atemwegsmuskulatur nach Metacholin wieder aufzuheben. Präinkubation der Schnitte mit einem Bronchodilatator zeigten keine Änderung des initialen Atemwegsdurchmessers (MARTIN et al., 1996). WOHLSEN et al. (2003) konnte bei etwa 10% der PCLS aus menschlichen Lungen eine Präkontraktion beobachten.
2.3.4.7 Passive Sensibilisierung
WOHLSEN et al. (2001) studierten mit Hilfe der PCLS die allergische Reaktion als Antwort auf ein Allergen in den Atemwegen. Unter passiver Sensibilisierung versteht man die Sensibilisierung von Zellen oder Gewebe gegen ein Allergen, indem man es mit Serum von allergischen Tieren oder Menschen inkubiert. Hierfür wurden die PCLS aus der Rattenlunge 16 Stunden in Serum von mit Ovalbumin sensibilisierten Ratten inkubiert. Durch Zugabe des Ovalbumin zu den vorher inkubierten PCLS konnte eine Kontraktion nur einmal ausgelöst werden. Jede weitere Exposition mit dem Antigen blieb ohne Wirkung. Die Erklärung hierfür könnte eine abgelaufene
Mastzelldegranulation sein, die sich nicht wiederholen lässt. Allerdings gibt es keine direkten Beweise für die Präsenz von Mastzellen in PCLS (WOHLSEN et al., 2003).
Weitere Untersuchungen zeigten, das die PCLS wenigstens zwei Stunden dem Serum ausgesetzt werden mussten, um eine Reaktion auf das Antigen zu erlangen.
Die maximale Reaktion wurde erst nach vier Stunden Inkubation erreicht.
Das Modell der passiven Sensibilisierung wurde von WOHLSEN et al. (2003) auch auf das Modell an der menschlichen Lunge angewandt. Hierfür wurden die PCLS über Nacht mit einem 1% Serum von Menschen inkubiert, die an allergischer Rhinitis leiden. Am nächsten Morgen wurde auf die Schnitte ein Pollenextrakt gegeben, was zur Kontraktion der Atemwege führte.
Bei den Untersuchungen an menschlichem Lungengewebe muss jedoch beachtet werden, dass der größte Anteil des Lungengewebes von Rauchern stammt. Da die Inhalation von Rauch eine entzündliche Reaktion und eine Hyperreagibilität in den Atemwegen hervorrufen kann, ist nicht auszuschließen, dass dies einen Einfluss auf die beobachteten Reaktionen hat (WOHLSEN et al., 2003).
2.3.4.8 Infektionen der PCLS mit Bakterien und Viren
Effekte von bakteriellen und viralen Infektionen können mit Hilfe der PCLS an lebenden Gewebekomplexen untersucht werden (EBSEN et al., 2002). Der Vorteil dieser In-vitro-Methode gegenüber herkömmlichen Zellkuturmodellen ist die erhaltene Gewebeintegrität.
EBSEN et al. (2002) infizierten die PCLS mit Chlamydophila pneumoniae und dem RSV (Respiratorischen Synzytial Virus). Als Vitalitätsnachweis diente der Zilienschlag des Flimmerepithels, der bis zu 96 Stunden unabhängig von einer Infektion erhalten war. Die Schnitte wurden in Abständen auf morphologische Veränderungen und Bakterien- bzw. Viruspräsenz hin untersucht. Lichtmikroskopisch konnten nur geringgradige morphologische Unterschiede zwischen infizierten und nichtinfizierten Schnitten festgestellt werden. Mittels Immunfluoreszens wurden sowohl das Bakterium als auch das Virus nachgewiesen. Elektronenmikroskopisch konnten charakteristische Zellveränderungen beobachtet werden.
Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Dauer der Vitalität von PCLS begrenzt ist, und somit Untersuchungen über einem längeren Zeitraum unmöglich sind.
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Teil 1: Etablierung der Methode zur Herstellung von PCLS
Der erste Teil der experimentellen Arbeit diente dazu, eine Methode zu etablieren, die es ermöglicht Präzisionsschnitte von equinem Lungengewebe (Precision cut lung slices, PCLS) anzufertigen. Das Gewebe sollte nach dem Anfertigen der Schnitte weiterhin vital sein, so dass eine aktive Kontraktion auf Reize und applizierte bronchokonstriktorische Substanzen möglich ist.
3.1.1 Material und Methode
Unter Verwendung von Lungengewebe von 12 euthanasierten Pferden wurde eine Methodik erarbeitet, PCLS aus equinem Lungengewebe zu schneiden. Dies umfasste die Methodik der Entnahme des Lungengewebes sowie seine weitere Aufarbeitung und das Erstellen der PCLS.
Die verwendeten Pferde wurden aus unterschiedlichen Gründen (z.B. orthopädische Erkrankungen) euthanasiert. Weitere Angaben über diese Pferde wurden nicht erhoben, da das Lungengewebe ausschließlich zur Methodenentwicklung herangezogen wurde. Acht Pferde wurden mit dem Präparat T61 (5 ml/50 kg KGW) eingeschläfert. Bei den verbleibenden vier Pferden erfolgte die Euthanasie mit einer konzentrierten Lösung von Pentobarbital (Eutha 77, 80 mg/kg KGW, Essex Tierarznei München). Direkt nach dem Feststellen des Herzstillstandes, wurde das Lungengewebe gewonnen (3.1.1.1) und in steriler NaCl-Lösung mit Hilfe von Eis auf ca. 4°C gekühlt.
3.1.1.1 Entnahme des Lungengewebes
Um die anatomischen Gegebenheiten zu studieren und eine effiziente Möglichkeit der Gewebeentnahme zu erarbeiten, erfolgte bei fünf Pferden eine Fensterung der rechten Thoraxwand, indem drei Rippen reseziert wurden, um einen ausreichenden Einblick in den Thorax zu erhalten. Anschließend wurde bei diesen Pferden ein Randsegment aus dem dorsalen Bereich des Lobus caudalis und der Lobus accessorius entnommen.
Die Entwicklung einer weniger invasiven Methode war erforderlich, da die Pferde, deren Lungengewebe im zweiten Teil der Arbeit zu pharmakologischen Untersuchungen verwendet werden sollte, nachfolgend im Rahmen der studentischen Ausbildung zu anatomischen Studien herangezogen wurden. Sowohl das Randsegment aus dem Lobus caudalis als auch der Lobus accessorius wurden über einen 30 cm langen Schnitt im sechsten Interkostalraum entnommen. Die Schnittführung begann dorsal etwa auf Höhe des Buggelenkes und wurde nach ventral fortgesetzt. In den Schnitt wurde ein Rippenspreizer (Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) eingesetzt und der Zugang so unter Schonung der Rippen maximal erweitert.
Zur Entnahme des Randstückes aus dem L. caudalis wurde die Lunge aus der Thoraxöffnung vorgelagert, so dass ein dreieckiges Lungensegment (Kantenlänge ca. 10 cm) mit einer Schere herausgetrennt werden konnte. Um den L. accessorius durch den interkostalen Zugang zu entnehmen, wurde ein Entnahmegerät (Abbildung 3-1) entwickelt, welches eine minimal invasive Heraustrennung ermöglicht. Der L.
accessorius war manuell zu erfassen, sodass eine Liess`sche Säge, die durch das Gerät geführt war, um die Basis des Anhanglappens zu legen war. Ein Helfer trennte danach mit 2-3 Sägezügen den Lobus ab. Das gewonnene Gewebe wurde in sterile, gekühlte NaCl-Lösung verbracht und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelagert.
Abbildung 3-1: Gerät zur Entnahme des L. accessorius
a = Liess`sche Säge b = flexibles Endstück c = Handgriffe
3.1.1.2 Befüllung des Lungengewebes mit Agarose
Um aus dem weichelastischen Lungenparenchym Gewebeschnitte mit einer Schichtdicke von 250 µm erstellen zu können, musste die Konsistenz des Lungengewebes erhöht werden. Dazu erfolgte die Instillation von „Low melting point agarose“ (Typ VII, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland) über einen angeschnittenen Bronchus in das Gewebe. Diese Substanz ist bei 37°C flüssig und nimmt bei Raumtemperatur wieder den Gelzustand an, so dass höhere Temperaturen und damit verbundene Gewebsschäden vermieden werden.
a
b
c
Das Lungengewebe wurde zunächst mit 3%iger Agaroselösung (Ansatz der Lösung mit destilliertem Wasser) ohne Zusatz von Zellkulturmedium befüllt. In den folgenden Versuchsreihen wurde die Agarose zu gleichen Teilen mit Zellkulturmedium (RPMI- 1640 Medium, Biochrom AG Berlin) versetzt. Durch eine, in einen Bronchus im Anschnitt der Lunge eingeführte Metallknopfkanüle mit aufgesetzter Einmalspritze wurde das Agarose/Nährmedium-Gemisch langsam in das Gewebe instilliert. Der für die vollständige Befüllung erforderliche Druck machte es notwendig, sämtliche Anschnittflächen des Lungengewebes mit Hilfe von Pean-Arterienklemmen (16 cm) abzudichten. Das befüllte Lungengewebe wurde mitsamt Klemmen und ohne Entfernung der Spritze umgehend auf 4°C gekühlt und bis zur vollständigen Aushärtung der Agarose dort belassen.
3.1.1.2.1 Befüllung des Lungensegmentes aus dem Lobus caudalis
Das Randsegment aus dem L. caudalis besaß mehrere Schnittflächen, da es aus dem Lungenlappen herausgetrennt werden muss. Ein Abdichten dieser Anschnitte war notwendig, um eine ausreichende Befüllung des Gewebes mit Agarose zu gewährleisten. Dazu wurden unterschiedliche Methoden zur Abdichtung und Befüllung erprobt:
1. Setzen multipler Klemmen
2. Setzen von Klemmen in Kombination mit Ligaturen
3. Vollständige Einbettung des Gewebes in feste Agarose während der Befüllung 4. Einsaugen der Agarose über ein an die Atemwege angelegtes Vakuum
5. Kauterisieren der einzelnen Schnittflächen
3.1.1.2.2 Befüllung des Lobus accessorius
Alternativ zu dem Randsegment aus dem Lobus caudalis wurde eine Technik entwickelt, den L. accessorius mit Agarose zu befüllen. Dieser Teil der Lunge ist als
