3 Eigene Untersuchungen
3.2 Teil 2: Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der PCLS
Um die PCLS auf ihre Eignung bezüglich der Durchführung von pharmakologischen Studien hin zu überprüfen, erfolgte ein Untersuchung an zehn equinen Lungen unter standardisierten Bedingungen.
3.2.1 Material und Methode
3.2.1.1 Patientengut
Zehn Pferde, die im Rahmen der studentischen Ausbildung in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover euthanasiert wurden, konnten in die Studie einbezogen werden. Das Alter der Pferde lag zwischen 2 und 25 Jahren. In Tabelle 3-1 sind die Rassen- und Altersverteilung, sowie das jeweilige Gewicht, Stockmaß und Geschlecht der Probanden zusammengefasst.
Tabelle 3-1: Angaben zu den Probanden
Pferd Nr. Rasse Stockmaß (cm) Gewicht
3.2.1.2 Allgemeiner Versuchsablauf
Eine allgemeine klinische Untersuchung, eine spezielle Untersuchung der Atemwege inklusive Tracheobronchoskopie und Entnahme von Tracheobronchialsekret (TBS) sowie eine arterielle Blutgasanalyse erfolgten einen Tag vor der Euthanasie. Am darauf folgenden Tag wurde unmittelbar post mortem der Lobus accessorius entfernt und für die Dauer des Transportes in steriler NaCl-Lösung auf Eis gelagert. Die weitere Bearbeitung des Lungengewebes erfolgte im Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Das Befüllen der Lunge mit Agarose und das Erstellen der ca. 250 µm dicken Schnitte wurde umgehend durchgeführt, bei vier Pferden musste es mit einer Verzögerung von 1-2 Stunden stattfinden.
Die mit Agarose gefüllten PCLS wurden anschließend in Zellkulturmedium (RPMI-1640 Medium, Biochrom AG Berlin) bei 37° C inkubiert, wobei das Medium innerhalb der ersten 5 Stunden mehrmals gewechselt wurde. Es folgten eine Inkubation über Nacht und ein erneuter Mediumwechsel am darauf folgenden Tag.
Die Versuche an den Schnitten mit Applikation von Testsubstanzen fanden unter einem inversen Mikroskop mit Hilfe einer angeschlossenen Digitalkamera statt. Die Daten wurden auf einen Computer übertragen und dort ausgewertet.
3.2.1.3 Klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle Untersuchung der Atemwege Allen im Untersuchungsgang erhobenen klinischen Parametern wurde anhand eines Score-Systems, welches in der Klinik für Pferde entwickelt wurde (OHNESORGE et al, 1998), entsprechend ihrer Bedeutung eine Punktzahl zugeordnet (Tabelle 3-2).
Die für jedes Pferd ermittelte Summe ließ eine Einteilung der Probanden in Gruppen mit unterschiedlichem Krankheitsgrad einer COB zu.
Tabelle 3-2: Score-System, Untersuchung des Atmungsapparates beim Pferd (OHNESORGE et al., 1998)
Untersuchungsmerkmal Befunde Punktzahl
Hustenauslösung nicht auslösbar 0
mehrfach 1
Auswurf 1
Spontaner Husten 1
Ruhedyspnoe Einsinken der IC-Räume 3
Nüsternblähen 3
Lungenperkussion Erweiterung 3 Finger 0
Erweiterung handbreit 1
Dämpfung 2
Endoskopie Sekret deutlich vermehrt 1
Sekret mäßig viskös 1
Sekret hochgradig vermehrt 2
Sekret zähviskös 2
Bifurcatio tracheae deutl. verdickt 1 TBS-Analyse Neutrophile Granulozyten, Makrophagen oder
eosinophile Granulozyten mittelgradig bis hochgradig vermehrt
1
Blutgasanalyse AaDo2 7-14 mmHg 1
AaDo2 >14 mmHg 2
Zu Beginn der Allgemeinuntersuchung wurden die Kennzeichen des Pferdes aufgenommen (Name, Alter, Geschlecht, Rasse, Farbe, Stockmaß, Gewicht). Ein Vorbericht konnte in den meisten Fällen nicht erhoben werden, da die Pferde der Euthanasie zugeführt werden sollten und weitergehende Informationen nicht vorlagen.
Die klinische Untersuchung beinhaltete neben der Allgemeinuntersuchung eine Lungenauskultation, Lungenperkussion, Tracheobronchoskopie, TBS-Analyse und arterielle Blutgasanalyse.
Die Allgemeinuntersuchung umfasste die Aufnahme der Ruhepulsfrequenz, Ruheatemfrequenz und der Körperinnentemperatur. Die Schleimhautbeschaffenheit der Lidbindehäute wurde überprüft und das Herz auskultiert. Die Haltung, das Verhalten und der Habitus sowie der Pflege- und Ernährungszustand des Pferdes waren weitere Untersuchungskriterien.
Im Rahmen der speziellen Untersuchung des Atmungsapparates wurde auf Nasenausfluss geachtet und seine Lokalisation und der Sekretcharakter bestimmt.
Die adspektorische Untersuchung des Patienten richtete sich weiter auf den Atemtyp (kostal, kostoabdominal, abdominal) und das Vorhandensein einer inspiratorischen (Nüsternblähen, Afteratmung, Einziehen der Interkostalräume), exspiratorischen (Doppelschlägigkeit, Dampfrinne, Afteratmung) oder gemischten Dyspnoe. Das Auftreten von spontanem Husten sowie durch Druck auf die Kehlkopfknorpel auslösbarer Husten wurden festgehalten. Größe und Konsistenz der Kehlgangslymphknoten sowie eventuelle Schmerzhaftigkeit waren ein weiterer Untersuchungspunkt.
Die Auskultation der Lunge fand am ruhigen Pferd unter Vergleich beider Lungenflügel statt. Das Auftreten eines verschärft vesikulären Atemgeräusches in der Inspirationsphase, ein bronchiales Atemgeräusch in der In- und Exspirationsphase, sowie Rasseln, Giemen und Knistern wurde im Protokoll vermerkt und im Score-System mit Punkten bewertet.
Perkutorisch wurden mit der Hammer-Plessimeter-Methode (DEEGEN und ZIRCHNER, 1970) die caudo-ventralen Lungengrenzen ermittelt.
Für die Blutgasanalyse war es notwendig, die rechte Arteria carotis communis im unteren Halsdrittel in der Drosselrinne mit einer Kanüle (BD Mikcrolance , 0,7 x 30 mm) zu punktieren. Die Analyse des in Glaskapillaren aufgefangenen Blutes erfolgte anschließend in einem automatischen Blutgasanalysegerät (AVL OMNI, AVL Medizintechnik GmbH, Bad Homburg, Deutschland). Gemessen wurden der Sauerstoff- und Kohlendioxid-Partialdruck und die alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz (AaDO2) in mm Hg. Im Score-System wurde nur der AaDO2
berücksichtigt. Er errechnet sich aus der Blutgasanalyse und dem Luftdruck und berücksichtigt damit Höhenlage, Wetter und Ventilation.
Zur Tracheobronchoskopie wurden die Pferde in einem Untersuchungsstand fixiert und mit Xylazin (0,2-1,1 mg/kg i.v.) sediert. Gemäß FISCHER (1980) wurde die Untersuchung mit einem flexiblen Endoskop durchgeführt. Es wurden die Farbe der tracheobronchialen Schleimhaut, die Breite des Bifurkationsseptums, Sekretmenge und Sekretviskosität in Trachea und Hauptbronchien beurteilt. Über einen in den Arbeitskanal eingeführten Katheter wurde unter Sichtkontrolle eine Sekretprobe, möglichst im caudalen Trachealbereich, entnommen und zytologisch untersucht. Die Beurteilung der Sekretmenge sowie der Sekretviskosität erfolgten nach DIECKMANN (1987) (Tabelle 3-3):
Tabelle 3-3: Beurteilung des TBS nach DIECKMANN (1987)
Sekretmenge Sekretviskosität
0 = keine Sekretansammlungen, keine Sekretflocken
0 = Schleimhaut feucht, nur geringe Mengen wässrigen Sekretes aspirierbar 1 = keine Sekretansammlungen,
einzelne Sekretflocken
1 = Schleimhaut feucht, einzelne feine Sekretflocken in wässrigem Sekret, leicht Quetschpräparat angefertigt, das luftgetrocknet nach Pappenheim gefärbt werden konnte. Die Untersuchung wurde unter einem Mikroskop vorgenommen und bei 500-facher Vergrößerung eine semiquantitativen Schätzung der Zellen durchgeführt.
3.2.1.4 Euthanasie
Die Euthanasie der Pferde erfolgte nach der am Vortag durchgeführten klinischen Untersuchung mit Pentobarbital (Eutha77 , 80 mg/kg KGW, Essex Tierarznei München). Umgehend nach Feststellung des Herzstillstandes wurde der Lobus accessorius gemäß den Angaben unter 3.1.1.1 entfernt und in steriler NaCl-Lösung mit Hilfe von Eis auf ca. 4°C gekühlt.
3.2.1.5 Erstellen und Mikroskopieren der PCLS
Die Erstellung der PCLS erfolgte gemäß den Angaben unter Kapitel 3.1.1.2.
Zu Beginn eines Versuches wurden die einzelnen PCLS unter einem inversen Mikroskop (Axiovert 25 C, Carl Zeiss, Jena) auf ihre Eignung für die Experimente überprüft. Sie mussten folgende Anforderungen erfüllen, um auswertbar zu sein:
1. Es musste ein frequenter Zilienschlag des Flimmerepithels vorhanden sein.
2. Die glatte Muskulatur des Atemweges musste unversehrt sein.
3. Der PCLS musste im rechten Winkel zum Verlauf des Atemweges geschnitten sein.
4. Die Epithelgrenze durfte nicht diskontinuierlich sein.
5. Es durften keine Agarose oder Zelldetritus im Lumen vorhanden sein.
6. Eine Vorkontraktion mit Faltenbildung der Atemwegsschleimhaut durfte nicht vorliegen.
Das Behandeln der PCLS mit verschiedenen Substanzen und die digitale Erfassung der Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen dieser Stoffe erstreckte sich über einen Zeitraum von mehreren Stunden. Es war daher nötig, die Schnitte während des Versuchsablaufs unter Zellkulturbedingungen zu lagern, um ihre Vitalität zu erhalten. Hierzu eignete sich ein speziell für diese Experimente angefertigtes Glasgefäß (Abbildung 3-6), dass unter 3.2.2.2 näher beschrieben wird. Die
Lungenschnitte durften nicht frei im Medium schwimmen, da das eine gezielte Betrachtung und ein Fotografieren unmöglich macht. Um eine Fixation des Gewebes zu gewährleisten, wurde ein triangelförmiges Stück chirurgischer Stahl auf dem Schnitt platziert, ohne die Sicht auf den Bronchus zu behindern. Die in Medium fixierte Lunge konnte bei einer fünffachen Vergrößerung über einen Zeitraum von mehreren Stunden untersucht werden (Abbildung 3-5).
Abbildung 3-5: Versuchsaufbau zum Mikroskopieren der PCLS
a = Inverses Mikroskop
b = Glasgefäß (siehe Abbildung 3-6) c = Adapteransatz für Digitalkamera
Um die Fläche und die induzierte Bronchokonstriktion des Bronchuslumen auswerten zu können, mussten die einzelnen Bilder digital aufgezeichnet werden. Dies geschah mit einer Digitalkamera (Canon, Powershot A70), die über einen Adapter (Zeiss,
b
c
a
Göttingen) mit dem Mikroskop verbunden war. Das Mikroskop besaß einen Beobachtungsstrahlengang und einen Strahlengang für Zusatzgeräte. So konnte das über das Mikroskop eingestellte Bild abfotografiert und von der Kamera direkt auf einen Computer übertragen werden. Die Fläche des Bronchiallumens wurde vor und nach provozierter Kontraktion mit Hilfe des Computerprogramms Scion Image (http://www.scioncorp.com) ausgemessen. Die ursprüngliche Innenfläche des unbehandelten Bronchus wurde gleich 100 % gesetzt und die Änderung der Fläche bei den verschiedenen Kontraktionszuständen prozentual berechnet. Vergleichend wurde der Durchmesser der Atemwege aus der Fläche rechnerisch bestimmt.
3.2.1.6 Vitalität der Schnitte
Als ein Parameter zum Nachweis der Vitalität wurde der frequente Zilienschlag des Flimmerepithels herangezogen. Dieser konnte bei zehnfacher Vergrößerung unter dem Mikroskop gesehen werden. Jeder Schnitt wurde vor der Auswertung daraufhin überprüft. Nach zwölf und vierundzwanzig Stunden folgte exemplarisch eine erneute Untersuchung, um festzustellen, ob der Zilienschlag weiterhin vorhanden war.
Eine weitere Vitalitätskontrolle des Lungengewebes wurde mit Hilfe des so genannten MTT-Test vorgenommen (Bestimmung der Stoffwechselaktivität kultivierter Zellen). Ein dem Gewebe zugesetztes Substrat (Dimethylthiazol-diphenyl-tetrazolium-bromid, MTT) wird von den Zellen aufgenommen und durch das mitochondriale Enzym Succinat-Dehydrogenase umgesetzt. Dabei wird das Substrat um so stärker verstoffwechselt, je aktiver die Zellen sind. Das entstehende Formazan ist in Isopropanol löslich und wird photometrisch bestimmt. Es wurden jeweils über Nacht inkubiertes Gewebe und Gewebe, mit dem zuvor unter dem Mikroskop gearbeitet wurde, untersucht.
Um festzustellen, ob es Unterschiede in der Kontraktionsbereitschaft der Schnitte gab, die mit dem Alter des Gewebes in Zusammenhang standen, wurden Schnitte nach zwölf und vierundzwanzig Stunden vergleichend mit einer Konzentration von 10-6 mol/l Metacholin kontrahiert.
Eine weitere Fragestellung war, ob die PCLS nach einer gewissen Anzahl von Kontraktionen Ermüdungserscheinungen zeigen. Hierfür wurden Schnitte mit 10-6 mol/l Metacholin behandelt und nachfolgend die Kontraktion der glatten Muskulatur durch Wechsel des Mediums wieder aufgehoben. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt, bis der Lungenschnitt nicht mehr die volle Kontraktion zeigte.
3.2.1.7 Behandlung der Schnitte mit pharmakologisch wirksamen Substanzen
Um eine Bronchokonstriktion zu erzielen, wurden Schnitte von sechs Pferden mit Metacholin (Acetyl-β-Methylcholinchlorid, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland) behandelt. Als zweite bronchokonstriktorische Substanz wurde Histamin (Histamindihydrochlorid, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland) an PCLS von sechs Pferden getestet. Es wurden für beide Stoffe Konzentrations-Wirkungsbeziehungen ermittelt. Die Anfangskonzentration lag bei beiden Stoffen bei 10-10 mol/L; sie wurde in Zehnerpotenzen bis 10-3 mol/L gesteigert. Die Zeit zwischen den Konzentrationserhöhungen betrug jeweils fünf Minuten. Vorversuche zeigten, dass in dieser Zeit eine Bronchokonstriktion vollständig eintrat. Nach Ablauf der fünf Minuten wurde der Bronchus fotografiert und die Konzentration erhöht. Um auszuschließen, dass der Reiz des Mediumwechsels allein genügt, um eine Kontraktion zu provozieren, wurden Versuche mit reinem Medium durchgeführt.
Um eine induzierte Bronchokonstriktion aufzuheben, wurde das mit Metacholin versetzte Medium durch frisches Medium ersetzt, dem Clenbuterol in einer Konzentration von 10-3 mol/L zugegeben wurde. Die Reaktion der PCLS wurde zwanzig Minuten lang beobachtet und in Zeitabständen von je fünf Minuten abfotografiert.
Um zu prüfen, ob die Schnitte durch den mechanischen Reiz des Schneidevorganges oder die multiplen Mediumwechsel minimal vorkontrahiert waren, wurde an Schnitten von sieben Pferden der ursprüngliche Atemweg ausgemessen und diese danach vier Stunden lang in einer konzentrierten Lösung (10-3 mol/l) Clenbuterol und Medium inkubiert. Nach Ablauf der vier Stunden wurde der Atemweg erneut vermessen und eine mögliche Erweiterung festgehalten.
3.2.1.8 Statistische Auswertung
Um eine erste orientierende Aussage treffen zu können wurden die Ergebnisse aus Kapitel 3.2.2.5.3 einem nicht parametrischen U-Test nach Mann-Whitney unterzogen.
3.2.2 Ergebnisse
3.2.2.1 Probandengut
In der Bewertung nach dem Score-System (OHNESORGE et al., 1998) konnten die untersuchten Pferde eine maximale Punktzahl von 14 Punkten erreichen. Sie wurden in vier Gruppen unterteilt: lungengesund (0-1), geringgradig erkrankt (2-3), mittelgradig erkrankt (4-6) und hochgradig erkrankt (7-14). Die einzelnen Punktzahlen sind Tabelle 3-4 zu entnehmen. Dem zu Folge waren drei Pferde als hochgradig erkrankt (Pferd Nr. 1, 6, 10), ein Pferd als mittelgradig erkrankt (Pferd Nr.
8), zwei Pferde als geringgradig erkrankt (Pferd Nr. 2, 4) und vier Pferde als lungengesund (Pferd Nr. 3 ,5 ,7 ,9) einzustufen.
56
Hustenauslösung nicht auslösbar 0 X X X X X X X X
mehrfach 1 X
Auswurf 1
Spontaner Husten 1 X
Ruhedyspnoe Einsinken der IC-Räume 3 X
Nüsternblähen 3 X
Lungenperkussion Erweiterung 3 Finger 0
Erweiterung handbreit 1 X
Dämpfung 2
3.2.2.2 Mikroskopie der PCLS
Die Untersuchungen der PCLS erstreckten sich über einen Zeitraum von mehreren Stunden. Um die Vitalität der Schnitte nicht herabzusetzen, und um standardisierte Bedingungen während des Versuchsablaufes zu erhalten, wurde ein Glasgefäß entworfen und in Einzelanfertigung hergestellt, in welchem die PCLS unter Zellkulturbedingungen inkubiert werden konnten. Dabei handelt es sich um einen doppelwandigen Behälter, dessen Innenraum von Wasser umspült werden kann, welches auf 37° C erwärmt und über einen angeschlossenen Kunststoffschlauch unter Druck durch den Zwischenraum der beiden Glaswände gespült wird. So hielt das in den Innenraum gegebene Zellmedium seine ursprüngliche Temperatur konstant. Der Boden des Gefäßes aus dünnem Glas erlaubte eine uneingeschränkte Betrachtung des Gewebes durch das Mikroskop (Abbildung 3-6a und b). Die Fixation der PCLS durch einen triangelförmig gebogenen Stahlstift erlaubte eine Beobachtung und die Applikation von Substanzen ohne Bewegung der Schnitte im Medium.
b
c
a
Abbildung 3-6a: Glasgefäß zum Mikroskopieren der PCLS unter Zellkulturbedingungen
a = Kammer für PCLS und Zellmedium b = Wasserzulauf
c = Wasserablauf
3.2.2.3 Vitalität und morphologische Beschaffenheit der PCLS
Der unter dem Mikroskop gut visualisierbare Zilienschlag der Flimmerepithels war ein zuverlässiger Parameter, um die Vitalität des Gewebes einschätzen zu können. So war festzustellen, dass eine aussagekräftige Kontraktion nur mit vorher einwandfrei feststellbarem Zilienschlag möglich war. Während bei Pferd Nr. 8 zu keinem Zeitpunkt Zilienschlag nachgewiesen werden konnte und die Ergebnisse dieser Versuchsreihe nicht in die Auswertung einbezogen wurden, war bei den PCLS aus den restlichen neun Pferdelungen auch nach vierundzwanzig Stunden Lagerung im Inkubationsschrank Zilienschlag nachweisbar. Ergänzend zur Beurteilung des Zilienschlages wurde die Stoffwechselaktivität der Zellen bei vier Pferden mit einem
a b
c
Abbildung 3-6b: Schema
modifizierten MTT-Test bestimmt. Dabei wurden PCLS, die nach dem Schneidevorgang über Nacht inkubiert wurden, mit PCLS an denen zuvor Versuche mit bronchokonstriktorischen Substanzen durchgeführt worden waren verglichen (Tabelle 3-5). Bei drei Pferden konnte kein Abfall in der Aktivität gemessen werden.
Die PCLS von einem Pferd wiesen nach Ablauf der Versuche einen Abfall der Aktivität auf.
Tabelle 3-5: Stoffwechselaktivität der über Nacht inkubierten PCLS vor und nach den Versuchreihen, gemessen mittels MTT-Test
Pferd Zeitpunkt der Messung µg Formazan/mg Protein
1 PCLS vor den Versuchsreihen 0,222
PCLS nach den Versuchsreihen 0,177
2 PCLS vor den Versuchsreihen 0,187
PCLS nach den Versuchsreihen 0,197
3 PCLS vor den Versuchsreihen 0,150
PCLS nach den Versuchsreihen 0,159
4 PCLS vor den Versuchsreihen 0,180
PCLS nach den Versuchsreihen 0,185
Um zu überprüfen, ob das Alter der PCLS einen Einfluss auf die Kontraktionsbereitschaft hat, wurden nach zwölf und vierundzwanzig Stunden Kontraktionen der Atemwege mit 10-6 mol/l Metacholin induziert. Es konnten keine Unterschiede im Ausmaß der Kontraktion zwischen den PCLS unterschiedlichen Alters festgestellt werden. Ermüdungserscheinungen der Schnitte nach multiplen Kontraktionen konnten ab der vierten Kontraktion, in Form einer Verlängerung der Reaktionszeit beobachtet werden. Ein Verlust der Kontraktionsbereitschaft trat nach sieben bis neun provozierten Kontraktionen auf.
Die erstellten PCLS mussten neben dem vorhandenen Zilienschlag weitere Bedingungen, die unter 3.2.1.5 näher erläutert sind, erfüllen, um auswertbar zu sein.
In Abbildung 3-7 werden die Anzahl der PCLS pro Pferd, die Vitalität und die Auswertbarkeit der PCLS miteinander verglichen. Durchschnittlich erfüllten 40 % der angefertigten Schnitte die Kriterien für eine mögliche Messung einer pharmakologischen Beeinflussung.
Abbildung 3-7: Anzahl der angefertigten, vitalen und auswertbaren PCLS pro Pferd
0
3.2.2.4 Prüfung auf Vorkontraktion der PCLS
Eine starke Vorkontraktion, erkennbar anhand der Fältelung der Atemwegsschleimhaut, führte zu einem Ausschluss der PCLS aus den Versuchsreihen. Die Inkubation der PCLS von sechs Pferden für vier Stunden in 10-3 mol/L Clenbuterol führte in fünf Fällen zu keiner messbaren Dilatation der Atemwege.
Bei einem Pferd führte die Inkubation des Schnittes dagegen zu einer Erweiterung des Lumens um 100%.
3.2.2.5 Pharmakologische Beeinflussbarkeit der PCLS
3.2.2.5.1 Bronchokonstriktion mit Metacholin
Es wurde eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung an PCLS von sechs Pferden mit Metacholin-Konzentrationen von 10-10 bis 10-3 mol/L ermittelt (Abbildung 3-8). Die Konzentrationssteigerung erfolgte in Zehnerpotenzen. Abbildung 3-10 zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion nach Applikation der unterschiedlichen Konzentrationen von Metacholin. Um auszuschließen, dass der Reiz der Applikation eine Kontraktion provoziert wurden Vorversuche mit reinem Medium durchgeführt, welche keine Bronchokonstriktion zur Folge hatten.
Abbildung 3-8: Auslösung einer Bronchokonstriktion durch Applikation von Metacholin. Dosis-Wirkungsbeziehung für Metacholin mit einer Steigerung der Konzentrationen in Zehnerpotenzen in einem Abstand von je 5 Minuten, Angaben der Fläche des Bronchuslumen in % des Ausgangswertes, (n=6)
Die ermittelte ED50 liegt im Bereich von 1,6 x 10-7 mol/L Metacholin. Bei dem Vergleich des rechnerisch aus der Fläche ermittelten Durchmessers mit der gemessenen Fläche (Abbildung 3-9, Abbildung 3-12), war die Fläche das geeignetere Maß, um eine Bronchokonstriktion zu beschreiben (4.2). Bei der Gegenüberstellung der beiden Kurven deutet sich für den Durchmesser ein etwas flacherer Kurvenverlauf an als bei der Fläche. Die ermittelte ED50 für den Durchmesser liegt im Bereich von 1,5 x 10-7 mol/L.
Abbildung 3-9: Auslösung einer Bronchokonstriktion mit Metacholin. Vergleich der Bronchusfläche mit dem rechnerisch ermittelten Durchmesser. Angaben jeweils in % des Ausgangswertes.
0 25 50 75 100 125
Lumen [%]
0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Metacholin [mol/l]
Fläche Durchmesser
Abbildung 3-10: PCLS mit einem Blutgefäß (BL) und einem Broncholus (BR). Applikation von unterschiedlichen Konzentrationen (10-10 mol/L-10-3 mol/L) von Metacholin in Abständen von fünf Minuten, beginnende Bronchokonstriktion bei einer Konzentration von 10-8 mol/L Metacholin, vollständiger Verschluss des Broncholus bei 10-4 mol/L Metacholin.
BL BR
BR BR
BL
BL
BL
10-9 mol/L Metacholin 10-10 mol/L
Metacholin
10-8 mol/L Metacholin
10-7 mol/L Metacholin BR
Abbildung 3-10: Fortsetzung
BR
BR BL
BL 10-4 mol/L
Metacholin 10-3 mol/L
Metacholin 10-6 mol/L
Metacholin
10-5 mol/L Metacholin
BL
BL BR
BR
3.2.2.5.2 Bronchokonstriktion mit Histamin
An PCLS von sechs Pferden wurde die bronchokonstriktorische Wirkung von Histamin gemessen. Die applizierten Histamin-Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-10 mol/L auf 10-3 mol/L gesteigert und eine Wirkungsbeziehung ermittelt (Abbildung 3-11). Im Vergleich mit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung von Metacholin (Abbildung 3-8) deutet sich für Histamin ein flacherer Kurvenverlauf an. Die ermittelte ED 50 liegt im Bereich von 1,5 x 10-7 mol/L.
Im Vergleich liegt die ED50 des aus der Fläche berechneten Durchmessers (Abbildung 3-12) ebenfalls im Bereich von 1,5 x 10-7 mol/L. Abbildung 3-13 zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion nach Applikation der unterschiedlichen Konzentrationen von Histamin.
Abbildung 3-11: Auslösung einer Bronchokonstriktion durch Applikation von Histamin. Dosis-Wirkungsbeziehung für Histamin mit einer Steigerung der Konzentrationen in Zehnerpotenzen in einem Abstand von je 5 Minuten, Angaben der Fläche des Bronchuslumen in % des Ausgangswertes, (n=6)
Abbildung 3-12: Auslösung einer Bronchokonstriktion mit Histamin. Vergleich der Bronchusfläche mit dem rechnerisch ermittelten Durchmesser. Angaben jeweils in % des Ausgangswertes.
0 25 50 75 100 125
Lumen [%]
0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Histamin [mol/l]
Fläche Durchmesser
Abbildung 3-13: PCLS mit einem zentral gelegenen Broncholus (BR), Applikation von unterschiedlichen Konzentrationen (10-10 mol/L-10-3 mol/L) von Histamin in Abständen von fünf Minuten, vollständiger Verschluss bei 10-3 mol/L Histamin.
BR
10-10 mol/L Histamin
10-9 mol/L Histamin
10-8 mol/L Histamin
10-7 mol/L Histamin BR
BR
BR
Abbildung 3-13: Fortsetzung
10-6 mol/L Histamin
10-5 mol/L Histamin
10-4 mol/L Histamin
10-3 mol/L Histamin BR
BR
BR
BR
3.2.2.5.3 Bronchodilatation nach provozierter Konstriktion mit Metacholin
Um eine zuvor induzierte Kontraktion mit Metacholin in einer Konzentration von 10-3 mol/L aufzuheben, wurden die kontrahierten Schnitte in frisches Medium überführt, dem Clenbuterol in einer Konzentration von 10-3 mol/L beigefügt war, und über einen Beobachtungszeitraum von zwanzig Minuten in Abständen von fünf Minuten fotografiert. Die PCLS der Pferde, die hochgradig an COB erkrankt waren (Pferd Nr.
1, 6, 10), zeigten nach zwanzig Minuten eine maximale Lumenerweiterung des Atemwegs um nur ca. 20%, während bei lungengesunden und geringgradig erkrankten Pferden (Pferd Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 9) nach dieser Zeitspanne eine Öffnung des Lumens um 70% zu beobachten war (Abbildung 3-14).
Abbildung 3-14: Bronchodilatation nach induzierter Konstriktion mit Metacholin (Zeitpunkt null) in einer Konzentration von 10-3 mol/L, durch Überführung des PCLS in frisches Medium und Applikation von Clenbuterol (10-3 mol/L), lungengesunde und geringgradig an COB erkrankte Pferde (n=4), hochgradig an COB erkrankte Pferde (n=3), * Mann-Whitney-U-Test: p< 0,05
0
4 Diskussion
Ziel der durchgeführten Studie war es, eine Methode zur Erfassung der Bronchokonstriktion in Precision Cut Lung Slices (PCLS) aus equinem Lungengewebe zu etablieren. Die anatomischen Strukturen des Gewebes bleiben erhalten, so dass der Bronchus in seinem ursprünglichen Gewebeverband beobachtet werden kann. Der Versuchsaufbau zur Untersuchung der PCLS erlaubt die direkte Erfassung der Kontraktion und bietet die Möglichkeit einer digitalen Aufzeichnung.
Es existieren verschiedene Methoden zur in-vitro-Untersuchung von Lungengewebe beim Pferd. Um die Bronchokonstriktion untersuchen zu können, ist es wichtig, Studien an der glatten Muskulatur der Atemwege durchzuführen. So haben
Es existieren verschiedene Methoden zur in-vitro-Untersuchung von Lungengewebe beim Pferd. Um die Bronchokonstriktion untersuchen zu können, ist es wichtig, Studien an der glatten Muskulatur der Atemwege durchzuführen. So haben