3 Eigene Untersuchungen
4.5 Pharmakologische Beeinflussbarkeit der PCLS
Die Applikation von Metacholin führt zu einer direkten Bronchokonstriktion in den PCLS. Der Verlauf der Konzentrations-Wirkungsbeziehung von PCLS aus equinem Lungengewebe (Abbildung 3-8) ist vergleichbar mit dem Verlauf der Kurven in PCLS aus humanen Lungen (WOHLSEN et al., 2003), Mäuselungen (MARTIN et al., 1996) und Rhesusaffenlungen (KOTT et al., 2002). Der Effekt von Metacholin auf equine Trachealmuskelstreifen (VAN NIEUWSTADT et al., 1997), entspricht ebenfalls den Ergebnissen dieser Studie, ebenso wie die Reaktionen von isolierten Bronchien aus equinem Lungengewebe (OLSZEWSKI et al., 1997).
Ein beim Pferd in-vivo angewendeter Histamin-Inhalations-Provokationstest zeigt, dass inhaliertes Histamin COB-ähnliche Symptome hervorruft (KLEIN, 1984). Auch in in-Vitro-Modellen kontrahiert Histamin equine Trachealmuskelstreifen (CHAND u.
EYRE, 1978; OLSON et al., 1989; DOUCET et al., 1990) und isolierte Bronchien aus equinem Lungengewebe (OLSZEWSKI et al., 1997). Um diese Bronchokonstriktion zu visualisieren, wurde in dieser Untersuchung eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung von Histamin in equinen PCLS ermittelt. Entsprechende Ergebnisse aus Untersuchungen an PCLS anderer Spezies fehlen bislang. Die graphische Darstellung der Konzentrations-Wirkungsbeziehung von Histamin (Abbildung 3-11) deutet im Vergleich zu Metacholin einen flacheren Kurvenverlauf an. Die Kontraktion der glatten Muskulatur wird bei diesen Substanzen durch unterschiedliche Rezeptoren vermittelt, so dass die Kurvenverläufe voneinander abweichen können. Weiterhin ist Metacholin im Gegensatz zu Histamin ein synthetischer Stoff mit einer größeren Wirkungspotenz, was ebenfalls den steileren Verlauf dieser Konzentrations-Wirkungskurve erklären könnte.
Die Aufhebung der Bronchokonstriktion erfolgte in den eigenen Untersuchungen durch einen Mediumwechsel und Zugabe von Clenbuterol. Eine Öffnung der Broncholi um ca. 70% konnte bei den lungengesunden und geringgradig an COB erkrankten Pferden (n=4) binnen 20 Minuten beobachtet werden (Abbildung 3-14).
Dies entspricht Ergebnissen von WOHLSEN et al. (2003), die eine vollständige Öffnung von mit Acetylcholin kontrahierten, humanen PCLS binnen 30 Minuten beobachten. In diesen Untersuchungen erfolgte eine Dilatation ohne Zugabe von Clenbuterol, da das zugegebene Acetylcholin enzymal abgebaut wird. Da das in der eigenen Untersuchung verwendete Metacholin im Vergleich zu Acetylcholin eine längere Verweilzeit besitzt, erfolgte ein Austausch des Mediums und eine zusätzliche Applikation von Clenbuterol zu den kontrahierten PCLS. Ob die Applikation von Clenbuterol notwendig ist, oder ob ein Austausch des Mediums ausreicht, konnte in der eigenen Untersuchung nicht hinreichend geklärt werden. Es sind weitere Untersuchungen nötig, um diese Fragestellung zu beantworten, da die Probandenzahlen hierfür in dieser Studie zu gering waren. Festzustellen ist jedoch, dass bei hochgradig an COB erkrankten Pferden (n=3) offensichtlich eine Verzögerung der Bronchodilatation vorliegt. Nach Ablauf von 20 Minuten konnte hier eine Öffnung der Bronchien um nur ca. 20 % beobachtet werden (Abbildung 3-14).
Da die glatte Muskulatur von an COB erkrankten Pferden nicht überschießend auf die Applikation von Acetylcholin reagiert (LEBLANC et al., 1991) und es zu keiner vermehrten Expression von muskarinergen Rezeptoren in dem Lungengewebe dieser Pferde kommt (ABRAHAM et al., 2003), muss die reduzierte Dilatationsbereitschaft der Bronchien andere Gründe haben. Die verzögerte Reaktion an PCLS von hochgradig an COB erkrankten Pferden könnte letztlich zur Prüfung der Wirksamkeit pharmakologischer Substanzen herangezogen werden.
Wie Abbildung 3-10 auch zeigt, ist es grundsätzlich ebenfalls möglich, eine Vasokonstriktion mit diesem ex-vivo-Modell zu quantifizieren, da die angeschnittenen Gefäße in ähnlicher Weise untersucht werden können. Dies bleibt nachfolgenden Untersuchungen vorbehalten.
4.6 Probandengut
Zur Etablierung der Methode (Teil 1) mussten acht Pferde mit dem Präparat T61 eingeschläfert werden. Da diese Injektionslösung jedoch neben einem Allgemeinanästhetikum und einem Lokalanästhetikum auch ein Muskelrelaxans beinhaltet, wurden nachfolgend alle Pferde mit Pentobarbital euthanasiert, um eine nicht sicher ausschließbare Wirkung auf die glatte Muskulatur der Atemwege zu vermeiden.
Da die Methodenetablierung das Ziel dieser Untersuchung war, können die Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussbarkeit der PCLS aufgrund der geringen Probandenzahlen nur orientierenden Charakter haben. Mit der Möglichkeit, PCLS aus equinem Lungengewebe erstellen zu können, existiert eine zusätzliche ex-vivo-Methode, um den Ablauf der Bronchokonstriktion beim Pferd und deren pharmakologische Beeinflussbarkeit in weiteren Studien zu untersuchen. Denkbar ist, dass die Entnahme des Lungengewebes über die Durchführung von Lungenbiopsien auch am lebenden Pferd möglich ist und somit die Vielfalt der Untersuchungsmöglichkeiten noch erweitert werden kann.
5 Zusammenfassung
Julia Vietmeier
Untersuchung zur Atemwegsreagibilität an „Precision Cut Lung Slices“ (PCLS) beim Pferd.
Ziel dieser Arbeit war es die Methodik zur Erstellung von Precision Cut Lung Slices (PCLS), die von MARTIN et al. (1996) für die Mäuselungen beschrieben wurde, für die Anwendung an equinem Lungengewebe zu etablieren.
Lungen von 12 Pferden dienten zur Erarbeitung einer Methodik, PCLS aus equinem Lungengewebe zu gewinnen. Dies umfasste die Herausnahme des Gewebes über einen interkostalen Zugang, die Befüllung mit Agarose und das Schneiden der PCLS mit einem speziellen Mikrotom. Weiterhin wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, um die pharmakologische Beeinflussbarkeit der gewonnenen PCLS untersuchen zu können.
An weiteren 10 Pferden wurde die erarbeitete Methodik unter standardisierten Bedingungen überprüft. An allen Pferden erfolgte eine klinische Allgemeinuntersuchung, eine spezielle Untersuchung der Atemwege, eine arterielle Blutgasanalyse und eine endoskopische Untersuchung der tiefen Atemwege mit Entnahme von Tracheobronchialsekret einen Tag vor der Euthanasie. Die Entnahme des Lungengewebes erfolgte unmittelbar post mortem, um die Vitalität des Gewebes zu erhalten. Nach dem Anfertigen der ca. 250 µm dicken PCLS wurden diese unter Zellkulturbedingungen bei 37°C inkubiert. Es folgten mehrere Mediumwechsel bis die PCLS schließlich unter dem Mikroskop auswertbar waren. Die Vitalität der PCLS, feststellbar über den Zilienschlag des Flimmerepithels, war mindestens 24 Stunden vorhanden.
Der bronchokonstriktorische Einfluss verschiedener pharmakologisch wirksamer Substanzen, in Abhängigkeit zum Atemwegsquerschnitt, wurde bestimmt. Die Ergebnisse der ex-vivo-Untersuchungen wurden in Bezug gesetzt zu eventuell
vorhandenen Lungenerkrankungen der Pferde. Durch die Applikation von Metacholin bzw. Histamin (jeweils als Hydrochlorid) zu den PCLS konnte dosisabhängig eine Bronchokonstriktion induziert werden. Es wurden für beide Substanzen Konzentrations-Wirkungskurven ermittelt. Eine induzierte Bronchokonstriktion konnte durch Wechsel des Mediums mit Zugabe von Clenbuterol wieder aufgehoben werden. Es zeigten sich Unterschiede in der Dilatationsbereitschaft zwischen PCLS aus Lungengewebe von lungengesunden und geringgradig an COB erkrankten Pferden und PCLS, die aus Lungengewebe von hochgradig an COB erkrankten Pferden gewonnen wurden.
In der vorliegenden Studie wurden die Grundlagen für Untersuchungen an PCLS zur Reagibilität, einer eventuellen Hyperreagibilität sowie zur Beeinflussung der Reagibilität durch unterschiedliche pharmakologische Substanzen quantitativ ex- vivo beim Pferd erarbeitet. Durch die Vielzahl an PCLS pro Pferd können verschiedene pharmakologische Studien an einem Probanden geprüft werden, so dass auch die Anzahl erforderlicher Tierversuche vermindert wird.
6 Summary
experimental set up was developed to analyse the pharmacological influences on the extracted PCLS.Within standardised conditions the acquired method was checked on 10 other horses. All horses passed a general basic clinical examination, a special exploration of the airways, an arterial blood gas analysis and a bronchoscopic examination of the distal airways with an extraction of transtracheal aspirates taken under endoscopic control one day before euthanasia. The extraction of the lung tissue was performed directly post mortem to conserve the vitality of the tissue. After the preparation of PCLS with a thickness of 250 µm they were stored with 37°C under cell culture conditions. After several changes of medium the PCLS were evaluated under the microscope. The vitality of the lung slices (detectable by the striking of the ciliated epithelium) remained for over 24 hours.
The bronchoconstrictorical influence of different pharmacological effective substances, relative to airway area was determined. The results of the ex-vivo-study were set in reference to an eventually potential lung disease of the horses.
By application of metacholine and histamine (both as hydrochloride) to the PCLS it was possible to induce a dose dependent bronchoconstriction. We investigated
dose-response-curves for both substances. With the change of medium and the use of clenbuterol the formerly induced bronchoconstriction could be abolished. There were differences in dilatation of the bronchi observed between PCLS from lung tissue from healthy and mildly affected horses and PCLS from horses with recurrent airway obstruction.
In the present study the basic principles of examinations with PCLS on the reactivity, eventually hyperreactivity and the influence on reactivity by different pharmacological substances were developed for the horse ex- vivo. By the quantity of slices, taken from one horse, different pharmacological studies are possible on one subject, which leads to a reduction of animal experiments.
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