3 Material und Methode
3.4 Versuche an equinen PCLS
3.4.1 Herstellung der verwendeten Bronchokonstriktoren und Rezeptorantagonisten
Angaben zu den verwendeten Substanzen, die verwendeten Konzentrationen und die Herstellung der Konzentrationen sowie der Konzentrationsreihe sind in der Tabelle 3 und Abbildung 2 festgehalten. Die Stammlösungen aller Substanzen wurden nach dem Herstellen in mehrere Portionen aufgeteilt und bei -18°C eingefroren. Für jede Versuchsreihe wurde eine dieser Portionen aufgetaut.
Tab. 3: Darstellung der verwendeten Substanzen mit ihrem Molekulargewicht, der Konzentration ihrer Stammlösung und der verwendeten Endkonzentration.
Stoff Molekulargewicht Stammlösung [mol/l]
Endkonzentration im well
[mol/l]
Histamin 111,00 10-2 10-4 bis 10-8
4-Methylhistamin 202,59 10-3 10-5
Cetirizin 461,81 10-3 10-5
Ranitidin 350,86 10-3 10-5
Thioperamid 292,44 10-3 10-5
JNJ7777120 277,75 10-3 10-5
Serotonin 387,40 10-3 10-5 bis 10-9
Ketanserin 545,51 10-3 10-5
Methacholin 195,69 10-3 10-5
Abb. 2: Herstellung der gewünschten Konzentration aus einer Stammlösung für die Konzentrationsreihe am Beispiel von Histamin
3.4.2 Versuchsablauf
Die PCLS befanden sich für die Versuche in mit 1 ml RPMI-Medium befüllten 12- bzw. 24-well-Kulturplatten. Vor Versuchsbeginn wurde die Vitalität der Bronchioli getestet. Als Vitalitätskriterium galt das Ausmaß der Kontraktionsstärke auf das zugegebene Methacholin (10-5 mol/l). Für die Versuche wurden nur PCLS verwendet, die mit einer deutlichen Bronchokonstriktion reagierten und eine fast vollständige Dilatation nach dem wiederholten Auswaschen des Methacholins zeigten.
Der Ausgangszustand des Bronchiolus, der als 100 % definiert wurde und die Präkontraktion, die die Reduktion des Bronchuslumen im Verhältnis zum Ausgangszustand dargestellt hatte, wurden fotografisch, mittels an das Mikroskop angeschlossener Digitalkamera, festgehalten. Die Wiederöffnung des Bronchiolus wurde ebenfalls fotografisch erfasst und als neuer Nullwert, der ebenfalls als 100 % definiert war, festgehalten. Diese zweite Nullwerterfassung erfolgte aufgrund der Tatsache, dass der Bronchiolus nach der Vitalitätsprüfung evtl. nicht vollständig
hergestellte
Konzentration 10-2 mol/l 10-3 mol/l 10-4 mol/l
Konzentration im well
10-4 mol/l 10-5 mol/l 10-6 mol/l
10 µl 10 µl 10 µl
……
……
Stammlösung Zugabe zu
990 µl RPMI
Verdünnung
dilatiert war. Die Berechnung des Bronchioluslumens wurde daher immer auf die jeweilige Größe nach der Vitalitätsprüfung und zum Versuchsbeginn bezogen.
3.4.3 Durchführung der Histaminkonzentrationsreihe
An den PCLS von sechs Pferden wurde der Effekt von Histamin auf die Bronchokonstriktion geprüft. Anhand einer Konzentrationsreihe, bei der Histamin im Abstand von fünf Minuten in aufsteigender Konzentration akkumulierend zugegeben wurde, sollte getestet werden, ob sich eine konzentrationsabhängige Kontraktion induzieren lässt. Die Reaktion der Bronchioli wurde drei Minuten nach Zugabe der jeweiligen Konzentration fotografisch festgehalten.
In einer zweiten Konzentrationsreihe wurde getestet, ob sich der in der ersten Kontraktionsreihe induzierte Effekt durch eine Inkubation von dreißig Minuten mit einem Histaminrezeptorantagonisten hemmen ließ (zu den verwendeten Rezeptorantagonisten und Konzentrationen s. Tabelle 3).
Für jeden der verwendeten Rezeptorantagonisten gab es eine Kontrollgruppe mit zwei bis drei PCLS, die als Vergleich der möglichen Bronchokonstriktionsstärke ohne Antagonist dienten.
3.4.4 Durchführung des 4-Methylhistamin-Versuchs
Bei diesem Versuch sollte geprüft werden, ob die Pferdelunge einen H4-Rezeptor besitzt, der auf die Zugabe eines H4-Agonisten mit einer Bronchokonstriktion reagiert.
Das 4-Methylhistamin wurde in einer Konzentration von 10-5 mol/l an den PCLS von drei Pferden getestet. Fünf Minuten nach der Substanzzugabe wurde die Reaktion der Bronchioli fotografisch festgehalten und auf Signifikanz im Vergleich zum Ausgangszustand geprüft.
3.4.5 Durchführung der Serotoninkonzentrationsreihe
Mit Serotonin wurde analog zum Histaminversuch verfahren (s. Abschnitt 3.4.3).
3.4.6 Versuchsdurchführung für die passive Sensibilisierung
Für die passive Sensibilisierung wurde ein Pferd aktiv gegen das verwendete Allergen (Ovalbumin) sensibilisiert. Die aktive Sensibilisierung erfolgte im Zuge einer bereits gelaufenen Studie durch eine einmalige intramuskuläre Ovalbumininjektion und eine zweimalige Ovalbumininhalation über jeweils fünf Tage im Abstand von zwei und vier Wochen (BARTON 2009). Das Serum wurde zwei Wochen nach der letzten Inhalation gewonnen und bis zum Versuchsbeginn bei -18°C gelagert.
Als Kontrollgruppe für den Versuch der passiven Sensibilisierung wurde Serum von einem kurz zuvor aus Island importierten Pferd gewonnen, das bisher keinen Kontakt zum Ovalbumin gehabt haben sollte.
Mit Hilfe eines FIT-Tests (funktioneller In-vitro Test zur Bestimmung des Sensibilisierungsgrades basophiler Granulozyten) und eines indirekten ELISA wurde der Gehalt an Ovalbumin-bindenen Antikörpern in den beiden Seren bestimmt. Der Antikörpertiter im Serum des zuvor aktiv sensibilisierten Pferdes lag bei 1:10000 während in dem Kontrollserum keine Antikörper nachgewiesen werden konnten (BARTON 2009).
Der Versuch der passiven Sensibilisierung erfolgte an den PCLS von 10 Pferden.
Vor Versuchsbeginn wurde die Vitalität der PCLS getestet (gemäß Abschnitt 3.4.2).
Nach der Dilatation der Bronchioli wurde der einen Hälfte der PCLS das Kontrollserum, der anderen Hälfte das Serum des zuvor aktiv sensibilisierten Pferdes zugegeben. Der Versuchsablauf wurde analog zu dem von WOHLSEN et al. (2001) an Ratten etablierten Modell durchgeführt. Die optimale Ovalbuminkonzentration wurde bei 0,1 % festgelegt, da sich durch eine geringere Konzentration kaum eine Bronchokonstriktion induzieren ließ. Eine maximale Reaktion konnte bei der Ratte nach einer Inkubationszeit von vier Stunden erreicht werden, weswegen die PCLS vom Pferd mindestens vier Stunden im Wärmeschrank inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurde bei allen Schnitten das Serum durch frisches RPMI-Medium ersetzt und der neue Nullwert, der als 100 % definiert war, erfasst. Anschließend wurde den PCLS das Ovalbumin zugegeben und die Reaktion der Bronchioli zwei und zehn Minuten nach der Zugabe fotografisch festgehalten. WOHLSEN et al. (2001) hatten
bei der Ratte gezeigt, dass erst nach zwei Minuten eine sichtbare Kontraktion aufgetreten ist, die bereits nach acht Minuten wieder verschwand.
Zur Prüfung der bestehenden Vitalität und der Aussagefähigkeit des Versuchs wurde im Anschluss Methacholin in einer Konzentration von 10-5 mol/l zugegeben und die Reaktion fünf Minuten nach der Zugabe fotografisch festgehalten.
3.4.7 Auswertung
Für die Auswertung wurden die über eine an das Mikroskop angeschlossene Digitalkamera angefertigten Fotos mit Hilfe des Bildbearbeitungsprogramms „Irfan view“ komprimiert, so dass mit Hilfe des Programms „scion image Version Beta 4.0.2“ (www.scioncorp.com) die Fläche des Bronchioluslumens ausgemessen werden konnte.
Die statistische Auswertung der erfassten Daten erfolgte mit Hilfe des Programms Graph Pad Prism 5.
Bei den Konzentrationsreihen und der passiven Sensibilisierung wurde der Friedman-Test gewählt, einem nicht parametrischen ANOVA für verbundene Stichproben. Außerdem wurde ein Dunn’s Test durchgeführt, bei dem die Werte der einzelnen Konzentrationsstufen mit dem Ausgangszustand verglichen wurden. Die Signifikanz wurde anhand der Mittelwerte der absoluten Werte berechnet, während die grafische Darstellung anhand der prozentualen Werte erfolgte.
Mit Hilfe eines Wilcoxon Test für gepaarte nicht parametrische Werte wurde getestet, ob eine Signifikanz zwischen der Kontraktionsstärke ohne und mit Antagonist besteht. Hier wurden die Werte aus der ersten Kontraktionsreihe, ohne Antagonist, mit denen der Zweiten, mit Antagonist, verglichen.
Die Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % zeigte eine schwache Signifikanz, 1 % war signifikant und 0,1 % wurde als hochsignifikant definiert.