Charakterisierung von
Zellwandproteinen des
Transglutaminase-Produzenten
Streptomyces mobaraensis
Vom Fachbereich Chemie
der Technischen Universität Darmstadt
zur Erlangung des Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
Dissertation
von
Anita Anderl
Erstgutachter: Prof. Dr. Harald Kolmar
Zweitgutachter: Prof. Dr. Hans-Lothar Fuchsbauer
Anderl, Anita: Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten
Streptomyces mobaraensis
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt
Jahr der Veröffentlichung der Dissertation auf TUprints: 2020 URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-115854
Veröffentlicht unter CC BY-NC 4.0 International
Tag der Einreichung: 17. Dezember 2019 Tag der mündlichen Prüfung: 5. März 2020
Zusammenfassung
Streptomyceten sind Gram-positive Eubakterien mit einem ausgeprägten Sekundärmetabolismus, die für das Wachstum Nährstoffe durch Zersetzung vorhandener Makromoleküle in Boden und Gewässern gewinnen. Dabei durchlaufen sie komplexe Differenzierungsphasen, in denen nährstoffanreicherndes Substrat- und reproduktives Luftmycel, das mit der Sporenbildung endet, entstehen.
Streptomyces mobaraensis unterscheidet sich von anderen Streptomyceten durch die Produktion des Proteinvernetzungsenzyms Transglutaminase, dessen physiologische Funktion noch wenig untersucht ist. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung amphiphiler Oberflächenproteine der Lufthyphen und Sporen von S. mobaraensis, bezeichnet als Chapline und Rodline, sowie ihre Interaktion mit Transglutaminase. Dazu wurde zunächst für das lange Chaplin 1 Chp1) und Rodlin 1 (Sm-Rdl1), als Vertreter der zwei Proteinklassen, ein effektives Produktionsverfahren zur Herstellung in
E. coli etabliert. Untersuchungen mittels CD- und Fluoreszenzspektroskopie zeigten, dass beide Proteine eine ungeordnete Struktur in Lösung besitzen, die sich bei erhöhter Exposition an der Luft/Wasser-Grenzfläche in eine -Faltblatt-reiche, amyloide Struktur umwandelt. Sm-Chp1 als auch Sm-Rdl1 bilden einen stabilen Proteinfilm an der Luft/Wasser-Grenzfläche aus und besitzen eine hohe Oberflächenaktivität, wie durch Experimente mit einem Langmuir-Trog nachgewiesen wurde. Über den enzymatischen Einbau von Monobiotinylcadaverin wurden beide Proteine in Lösung als Glutamindonor-Substrate der Transglutaminase identifiziert. Besonders Sm-Chp1 erwies sich als ein exzellentes Substrat im Vergleich mit bisher untersuchten Glutamindonor-Substraten von S. mobaraensis, was auch auf die ungeordnete Struktur von Sm-Chp1 zurückgeführt wurde. Der Austausch einzelner Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass Glutamine innerhalb der Chaplin-Domänen modifiziert wurden. Unter der Annahme, dass deren Zugänglichkeit im gefalteten Zustand von Sm-Chp1 eingeschränkt sein sollte, wurden erste Versuche unternommen, über die druck-induzierte Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche im Langmuir-Trog die natürliche Faltung zu simulieren. Nach dem Transfer der Sm-Chp1-Filme auf eine hydrophobe Membran erfolgte die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung, welche noch nicht zu einem zweifelsfreien Ergebnis führte. Weiterhin wurde für Sm-Chp1 mittels biochemischer Methoden Metallbindungseigenschaften für Nickel, Zink und Kupfer nachgewiesen. Diese wurden dabei auf ausgedehnte Histidin-reiche Domänen zurückgeführt, durch die sich Sm-Chp1 von Sc-ChpC aus S. coelicolor A3(2) unterscheidet. Isothermale Titrationskalorimetrie und andere Methoden legten eine Bindekapazität von sieben bis acht Metallionen und Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich für Nickel und Zink nahe. Damit gehört Sm-Chp1 zu den noch wenig charakterisierten Proteinen, die sich an der Versorgung von Enzymen mit essentiellen Metallen beteiligen und deren Proteinstruktur an den Metallbindestellen wegen der hohen Flexibilität von Histidin-reichen Domänen unbekannt ist.
In einem Nebenprojekt erfolgte die Charakterisierung einer Sortase der Klasse E aus S. mobaraensis, der
Sm-SrtE2, wofür zunächst ein Produktionsverfahren für die Herstellung in E. coli etabliert wurde. Das Enzym wies eine geringe Stabilität auf, welche vermutlich durch Entfernung des N-terminalen Membranankers entstand. Die im Vergleich mit anderen Proteinen aus S. mobaraensis niedrige Temperaturresistenz spricht für eine stabilisierende Funktion dieser Domäne. Der Nachweis der Aktivität, welche unabhängig von Metallionen ist, erfolgte durch die Spaltung von FRET-Pentapeptiden, die putative Sortaseerkennungsmotive beinhalteten. Das Pentapeptid LAETG war das bevorzugte Substrat der Sm-SrtE2. Die Transpeptidierungsaktivität wurde zusätzlich durch Fluoreszenzmarkierung des intrinsischen Substratproteins Chp1 mit dem Motiv LAHTG nachgewiesen. Dabei erwies sich Sm-Chp1 als ein besseres Substrat im Vergleich mit Sc-ChpC von S. coelicolor, welches das Sortaseerkennungsmotiv LAETG besitzt. Die Effizienz der Sm-SrtE2 ist offensichtlich auch von der Struktur des Substratproteins und weiteren Aminosäuren abhängig, die das Sortaseerkennungsmotiv flankieren. Die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung der N-terminalen Glutamine resultierte vermutlich aus der Einkürzung der Sm-SrtE2, was einen unstrukturierten, flexiblen N-Terminus ergab. Durch die N-terminale Verankerung des Enzyms in der Membran sollte Transglutaminase in vivo keine Wechselwirkung mit Sm-SrtE2 eingehen können.
Publikationen
Teile der vorliegenden Arbeit wurden publiziert in:
Anderl, A., Kolmar, H. & Fuchsbauer, H. L. (2019) The metal-binding properties of the long chaplin from Streptomyces mobaraensis: A bioinformatic and biochemical approach, J Inorg Biochem. 202, 110878. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2019.110878.
Anderl, A., Ferlemann, C., Muth, M., Henkel-Gupalo, A., Ebenig, A., Brenner-Weiß, G., Kolmar, H. & Fuchsbauer, H. L. (2019) Biochemical study of sortase E2 from Streptomyces mobaraensis and determination of transglutaminase cross-linking sites, FEBS Lett. 593, 1944-1965.
https://doi.org/10.1002/1873-3468.13466.
Weitere Publikationen:
Juettner, N. E., Schmelz, S., Anderl, A., Colin, F., Classen, M., Pfeifer, F., Scrima, A. & Fuchsbauer, H. L. (2019) The N-terminal peptide of the transglutaminase-activating metalloprotease inhibitor from Streptomyces mobaraensis accommodates both inhibition and glutamine cross-linking sites, FEBS J. 278, 708-720. https://doi.org/10.1111/febs.15044.
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ... 1
1.1. Streptomyceten ... 1
1.1.1. Lebenszyklus ... 2
1.1.2. Chapline und Rodline ... 3
1.2. Sortasen ... 6
1.3. Mikrobielle Transglutaminasen ... 9
1.4. Zielsetzung ... 14
2.
Material und Methoden ... 15
2.1. Material ... 15 2.1.1. Chemikalien ... 15 2.1.2. Kits ... 15 2.1.3. Mikroorganismen ... 15 2.1.4. Plasmide ... 15 2.1.5. Oligonukleotide (Primer) ... 16
2.1.6. Enzyme, Proteine und Molekulargewichtsstandards ... 18
2.1.7. Antikörper und Farbstoffkonjugate ... 18
2.1.8. Puffer und Lösungen ... 18
2.1.9. Kultivierungsmedien ... 19
2.1.10. Säulen und Säulenmaterialien ... 21
2.1.11. Geräte ... 21
2.1.12. Verbrauchsmaterialien ... 23
2.2. Molekularbiologische Methoden ... 24
2.2.1. Plasmidisolierung ... 24
2.2.2. Konzentrationsbestimmung von DNA ... 24
2.2.3. Polymerasekettenreaktion ... 24
2.2.4. Agarose-Gelelektrophorese ... 25
2.2.5. Enzymatische Restriktionshydrolyse ... 25
2.2.6. Ligation ... 26
2.2.7. Herstellung chemisch kompetenter E. coli -Zellen ... 26
2.2.8. Hitzeschock-Transformation ... 26
2.2.9. DNA-Sequenzierung ... 26
2.3. Mikrobiologische Methoden ... 26
2.3.2. Bestimmung der Zelldichte ... 27
2.3.3. Kultivierung von E. coli und Proteinproduktion ... 27
2.3.4. Zellernte und Zellaufschluss ... 27
2.4. Proteinchemische Methoden ... 27 2.4.1. Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie ... 27 2.4.2. Glutathion-Affinitätschromatographie ... 28 2.4.3. Kationenaustauschchromatographie ... 28 2.4.4. Gelpermeationschromatographie ... 29 2.4.5. Dialyse ... 29
2.4.6. Konzentrierung von Proteinlösungen ... 29
2.4.7. Chaplinextraktion von Streptomyces-Lufthyphen und Sporen ... 29
2.5. Proteinanalytische Methoden ... 30
2.5.1. Bestimmung der Proteinkonzentration... 30
2.5.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 30
2.5.3. Western Blot ... 31
2.5.4. Biotinylierung von Proteinen mittels Transglutaminase ... 32
2.5.5. Biotinylierung von Sporen mittels Transglutaminase ... 32
2.5.6. Kontinuierlicher Aktivitätstest für Sortasen ... 32
2.5.7. Fluoreszenzmarkierung von Proteinen mittels Sortase ... 33
2.5.8. Schmelzpunktbestimmung mittels intrinsischer Fluoreszenz ... 33
2.5.9. Circulardichroismus-Spektroskopie ... 33 2.5.10. Thioflavin T-Assay ... 34 2.5.11. UV-Vis-Titration ... 34 2.5.12. Trübungsmessung ... 34 2.5.13. Isothermale Titrationskalorimetrie ... 34 2.5.14. Massenspektroskopie ... 35
2.5.15. N-terminale Sequenzierung und MALDI-TOF ... 35
2.6. Herstellung von Langmuir Monolayern ... 35
2.7. Organisch-chemische Methoden ... 36
2.7.1. Synthese von Glycin-Edans ... 36
3.
Ergebnisse ... 38
3.1. Charakterisierung der Chapline und Rodline ... 38
3.1.1. Gentechnische Arbeiten ... 38
3.1.2. Proteinproduktion und -reinigung ... 40
3.1.3. Fibrillenbildung ... 45
3.1.4. Grenzflächeneigenschaften ... 47
3.1.6. Metallbindungseigenschaften des langen Chaplin 1 ... 59
3.2. Charakterisierung der Sortase E2 ... 65
3.2.1. Bioinformatische Analyse ... 65
3.2.2. Gentechnische Arbeiten ... 66
3.2.3. Proteinproduktion und -reinigung ... 67
3.2.4. Aktivität und Substratspezifität ... 69
3.2.5. Spezifität für lange Chapline ... 72
3.2.6. Interaktion mit Transglutaminase ... 73
4.
Diskussion ... 75
4.1. Das lange Chaplin 1 als Metallbindeprotein ... 75
4.2. Chaplin 1 als Transglutaminase-Substrat ... 77
4.3. Der N-Terminus verleiht der Sortase E2 Stabilität ... 79
5.
Literaturverzeichnis ... 81
6.
Anhang ... 91
6.1. Zusätzliche Abbildungen ... 91 6.2. Abbildungsverzeichnis ... 96 6.3. Tabellenverzeichnis ... 97 6.4. Abkürzungsverzeichnis ... 987.
Danksagung ... 100
8.
Erklärungen ... 101
1. Einleitung
1.1. Streptomyceten
Streptomyceten sind filamentös wachsende, Gram-positive Bakterien mit Guanin- und Cytosin (GC)-reichem Genom und gehören zu den Actinomyceten [1]. Die aeroben, chemoorganotrophen Bakterien zählen zu den ökologisch und industriell wichtigsten Mikroorganismen, wodurch sie Gegenstand intensiver Forschung sind. Die Gattung Streptomyces ist in der Natur ubiquitär verbreitet und umfasst derzeit über 800 Arten mit gültig publizierten Namen [2]. Sie kommen überwiegend im Boden vor, wo sie durch Bildung von Geosmin den typischen Geruch von Waldboden erzeugen [3]. Des Weiteren sind sie in marinen Sedimenten und als Symbiont in Pflanzen und Tieren zu finden [4]. Durch ihre Fähigkeit komplexe, organische Substanzen zu zersetzen, nehmen Streptomyceten eine wichtige Funktion im Stoffkreislauf ein. Dazu sekretieren sie eine Vielzahl an extrazellulären Enzymen, um Makromoleküle wie Cellulose, Lignocellulose, Xylane, Chitin oder Proteine zu niedermolekularen Bestandteilen zu hydrolysieren, die sie als Nährstoffe aufnehmen und wiederverwerten [5, 6]. Neben biotechnologisch relevanten Enzymen produzieren Streptomyceten eine große Vielfalt an Sekundärmetaboliten, um in kompetitiven Bodenhabitaten mit zahlreichen Mikroorganismen zu überleben [4]. Die Sekundärmetabolite werden vor allem in der Pharma- und Agrarindustrie genutzt. Etwa Zweidrittel der natürlich vorkommenden Antibiotika sowie eine Vielzahl anderer biologischer Wirkstoffe mit fungiziden, antiparasitären, herbiziden, zytostatischen oder immun-suppressiven Eigenschaften stammen von Streptomyceten [7-9]. Die Forschung an Streptomyceten wurde bereits zweimal mit Nobelpreisen ausgezeichnet: Für die Entdeckung des zur Tuberkulosebehandlung eingesetzten Streptomycins aus
Streptomyces griseus bekam Selman Waksman 1952 den Nobelpreis [10]. Einen weiteren erhielten Satoshi Omura und William Campbell 2015 für das Antiparasitikum Ivermectin, welches auf Avermectin aus Streptomyces avermitilis basiert [11].
Die Diversität und Vielseitigkeit der Streptomyceten wird an dem Aufbau und Größe ihres Genoms ersichtlich. Im Vergleich zu anderen Bakterien besitzen sie mit 5,2 Mbp bis zu 12,7 Mbp ein außergewöhnlich großes Chromosom von linearem Aufbau und einen hohen GC-Gehalt von ungefähr 70 % [12, 13]. Mit bis zu 11.000 Genen gehören sie zu den Bakterien mit der höchsten Anzahl an Genen, wovon, je nach Streptomycet, noch 30-55 % ohne bekannte Funktion sind [14]. Während die relativ konservierte Kernregion des Chromosoms aus essentiellen housekeeping-Genen besteht, enthalten die Chromosomenenden Gene für die Synthese von Sekundärmetaboliten oder für Exoenzyme und variieren deutlich unter den Streptomyceten-Arten [15-17]. Diese Variabilität geht mit der genetischen Instabilität einher, insbesondere an den Chromosomenenden, was häufig zu Deletion, Amplifikation, oder Insertion und somit zur Neuanordnung des Chromosoms führt [17, 18]. Manche Streptomyceten verwenden zusätzlich lineare oder zirkuläre Plasmide, die über horizontalen Gentransfer effizient zwischen unterschiedlichen Arten ausgetauscht werden [19, 20]. Diese Fähigkeit der Genomexpansion und
-plastizität ermöglicht Streptomyceten die Adaption an wechselnde Umweltbedingungen und einen komplexen Lebenszyklus [21].
1.1.1. Lebenszyklus
Streptomyceten zeichnen sich durch einen komplexen Lebenszyklus mit morphologisch differenzierten Wachstumsphasen aus (Abbildung 1) [1]. Dabei ähneln sie mit ihrem, für Bakterien ungewöhnlichen, mycelartigen Wachstum in vielerlei Hinsicht filamentösen Pilzen [22]. Unter günstigen Bedingungen beginnt der Lebenszyklus von Streptomyceten durch die Keimung einer monogenetischen Spore unter Ausbildung von ein bis zwei Keimschläuchen. Diese wachsen durch apikale Spitzenverlängerung und unregelmäßige Verzweigung zu einem Geflecht aus Hyphen heran, das als Substratmycel bezeichnet wird [23].
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Lebenszyklus von Streptomyceten. Die Abbildung wurde von Barka et al. (2016) übernommen und modifiziert [24].
Dabei werden Exoenzyme sekretiert, um durch den Abbau von Polymeren wie Cellulose oder Chitin Nährstoffe zu erschließen, welche in Form von Glykogen als Nährstoffspeicher in den Zellen akkumuliert werden können [4, 25]. Während des vegetativen Wachstums erfolgt die Replikation des Chromosoms, ohne dass die Kopien durch Zellteilung voneinander getrennt werden [23]. Es entstehen multigenomische Hyphen, die in unregelmäßigen Abständen in verbundene Kompartimente durch Querwände begrenzt werden [26]. Verschlechtern sich die Lebensbedingungen, z.B. durch Nährstoffmangel, wird die nächste Wachstumsphase initiiert, in der das Substratmycel zum Luftmycel
unter der Kontrolle der bld-Gene differenziert [27, 28]. Ein Teil des Substratmycels wird durch programmierten Zelltod autolysiert und durch Nucleasen, Glycosidasen und Proteasen degradiert, wodurch die akkumulierten Nährstoffe frei werden, die nun der Bildung des Luftmycels dienen [29]. Gleichzeitig werden von einem nicht wachsenden Teil der Zellen Sekundärmetabolite wie Antibiotika produziert, um die Nährstoffe gegen motile Bakterien zu verteidigen [4, 29]. Aus den restlichen lebensfähigen Zellen bilden sich unverzweigte Lufthyphen [23, 29]. Durch Sekretion hydrophober Proteine, den Chaplinen, und mediumabhängig dem Lanthioninpeptid SapB, wird die Oberflächenspannung in der wässrigen Umgebung des Substratmycels abgesenkt [30-32]. Die Hyphen entweichen aus dem Substrat und wachsen in die Luft, ummantelt von einer hydrophoben Proteinschicht, bestehend aus Chaplinen und Rodlinen, deren Sekretion über den sky pathway kontrolliert wird [33, 34]. In den Lufthyphen werden durch synchrone Zellteilung monogenomische Vorsporen-Kompartimente gebildet, die anschließend zu einer langen Kette von abgerundeten, pigmentierten Sporen reifen [23]. Die Sporenbildung steht dabei unter Kontrolle der whi-Gene [35, 36]. Schließlich werden die austrocknungsresistenten Sporen durch Wind, Wasser, Insekten und andere Lebewesen in der Umwelt verbreitet, wo sie unter günstigen Bedingungen erneut auskeimen [37].
1.1.2. Chapline und Rodline
Die Regulation der Lufthyphenbildung ist komplex und umfasst mehrere regulatorische Wege, darunter die bld-Kaskade und der sky pathway, welche zusammen die Produktion von Strukturproteinen steuern, die am Aufbau des Luftmycels beteiligt sind [34]. Diese Strukturproteine verursachen bei dem Übergang von Substrat- zu Luftmycel eine Änderung der Oberflächeneigenschaften der Hyphen: Während vegetative Hyphen in der wässrigen Umgebung des Substrats eine hydrophile Oberfläche aufweisen, sind Lufthyphen und Sporen hydrophob [38]. Dies geht mit einer hydrophoben, fibrillären Schicht einher, die Lufthyphen und Sporen, aber nicht Substrathyphen umgibt [39-41]. Diese charakteristische Rodlet-Schicht besitzt eine mosaikartige Ultrastruktur mit paarweise angeordneten amyloiden Fibrillen von 8- 12 nm Breite und bis zu 450 nm Länge (Abbildung 2A) [42, 43]. Zwei Proteinklassen, Chapline und Rodline, wurden erstmals in dem Modellorganismus Streptomyces coelicolor als Bestandteil der Rodlet-Schicht identifiziert [30, 31, 38]. S. coelicolor produziert acht Chapline (coelicolor hydrophobic aerial
proteins), welche nach ihrer Größe in zwei Gruppen unterteilt werden: ChpA-C, die ungefähr 210- 230 Aminosäuren (AS) lang sind, und ChpD-H, die mit einer Länge von ungefähr 50-60 AS wesentlich kürzer sind [30, 31]. Neben einem N-terminalen Signalpeptid, das die Sekretion über das Sec-Transportsystem erlaubt, besitzen die kurzen Chapline eine, die langen Chapline zwei konservierte „Chaplin“-Domänen (Abbildung 2B) [31]. Die Chaplin-Domäne ist ungefähr 40 AS lang, sehr hydrophob (60-65 % hydrophobe AS) und enthält, mit Ausnahme von ChpE, zwei konservierte Cysteine, die intra- oder intermolekulare Disulfidbrücken bilden [31, 43, 44]. Zusätzlich ist am C-Terminus der langen Chapline ein Sortase-Erkennungsmotiv vorhanden, welches die kovalente Verankerung der langen
Chapline an das Peptidoglycan der Zellwand durch Sortase-Enzyme ermöglicht [45]. Dies ist wohlmöglich auch der Grund, weshalb nur die kurzen Chapline zusammen mit den Rodlinen aus SDS-behandelten Zellwänden mittels Trifluoressigsäure extrahiert werden [30, 38].
Abbildung 2: Die Funktion der Chapline und Rodline bei der Lufthyphenbildung in Streptomyces coelicolor. A) Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahme der Sporenoberfläche mit Rodlet-Ultrastruktur von S. coelicolor. Die Abbildung wurde von Di Berardo et al. (2008) übernommen und modifiziert [43]. B) Schematischer Aufbau der Chapline in Anlehnung an Claessen et al. (2003) [30]. Neben einem Sec-Signalpeptid (SP) besitzen die langen Chapline (ChpA-C) zwei hydrophobe Chp-Domänen sowie ein C-terminales Sortase-Erkennungsmotiv (blau), gefolgt von einer Sequenz hydrophober (orange) und positiv geladener AS (+). Die kurzen Chapline (ChpD-H) besitzen ein Sec-Signalpeptid (SP) und bestehen aus einer Chp-Domäne. C) Modell der Lufthyphenbildung nach Claessen et al. (2003) [30]. Die kurzen Chapline ChpE und ChpH werden von vegetativen Hyphen in die wässrige Umgebung des Substrats sekretiert (1). Diese assemblieren an der Grenzfläche zwischen Wasser und Luft, wodurch die Oberflächenspannung des Wassers gesenkt wird (2). Dies ermöglicht das Wachstum von Lufthyphen, welche ChpA-H und RdlA-B produzieren. An der Luft assemblieren die Proteine an der äußeren Zellwand zu einer unlöslichen Schicht aus amyloiden Fibrillen (3). Nach dem Modell von Yang et al. (2017) sind die sich entwickelnden Sporenketten von zwei amyloiden Schichten umgeben, wobei die innere aus Chaplinen und die äußere Schicht aus Rodlinen besteht [46].
Kurze Chapline bilden durch Selbst-Assemblierung an der Grenzfläche von Wasser und Luft amyloide Fibrillen und zählen zu den ersten funktionellen Amyloiden, die in Gram-positiven Bakterien entdeckt wurden [30, 44]. Sie besitzen ähnlich wie SapB oberflächenaktive Eigenschaften und reduzieren in vitro die Oberflächenspannung von Wasser von 72±1 mJ/m² auf 26±2 mJ/m² [30]. Durch Co-Assemblierung mit den Chaplin-Domänen der Zellwand-verankerten langen Chapline werden die kurzen Chapline vermutlich an der Zelloberfläche der Hyphen immobilisiert [22, 42]. Jedoch sind die langen Chapline dafür nicht unbedingt erforderlich, da ihre Deletion lediglich zu einer Verzögerung der Lufthyphenbildung führt [45]. Die Rolle der langen Chapline ist somit noch nicht eindeutig geklärt. Die Deletion aller Chaplin-Gene führt hingegen zu einer stark verminderten Anzahl an Lufthyphen ohne
fibrilläre Schicht, welche nun hydrophil sind, aggregieren und auf die darunter liegenden Substrathyphen zusammenbrechen [33, 47]. Die durch die Chapline vermittelte Oberflächen-hydrophobizität ist somit für die Rigidität von Lufthyphen essentiell [33].
Die Anzahl der langen und kurzen Chapline variiert je nach Streptomycetenart, wobei ChpC, ChpE und ChpH als konserviert gelten [42, 48]. Dieser minimale Satz an Chaplinen trägt wesentlich zur Bildung des Luftmycels in S. coelicolor bei, was eine gewisse Redundanz unter den Chaplinen aufzeigt [43]. ChpE und ChpH werden bereits vor der Lufthyphenbildung produziert, was zu dem folgenden Modell führt: Während des vegetativen Wachstums werden ChpE und ChpH in die wässrige Umgebung des Substrats sekretiert, wo sie an der Luft/Wasser-Grenzfläche zu einem dünnen Film selbst-assemblieren, die Oberflächenspannung absenken und somit das Lufthyphenwachstum ermöglichen (Abbildung 2C) [30]. Anschließend sekretieren die Lufthyphen alle Chapline, die an der Oberfläche der Hyphe zu einer amphiphilen und fibrillären Schicht assemblieren. ChpE, das einzige Chaplin ohne Cystein, wird dabei eine besondere und essentielle Funktion zugeordnet, indem es möglicherweise in der Regulation und Koordination der Assemblierung anderer Chapline oder Interaktion mit den Rodlinen involviert ist [43]. Zusätzlich interagieren Chapline mit Cellulose-Fasern, um adhesive Fimbrien zu bilden und ermöglichen somit den Hyphen an hydrophobe Oberflächen zu haften [49].
Eine weitere Proteinklasse, die für die äußere Rodlet-Schicht der Lufthyphen und Sporen in S. coelicolor essentiell ist, wird durch die Rodline RdlA und RdlB gebildet [38]. Nach der Abspaltung des N-terminalen Sec-Signalpeptids bestehen Rodline aus ungefähr 132 AS. Obwohl beide Rodline sehr ähnlich und zu 69,6 % identisch sind, ist ihre jeweilige Funktion nicht redundant [46]. Für die Bildung des Rodlet-Layers werden neben den Chaplinen RdlA und RdlB benötigt [33]. Obwohl Rodline nur in Lufthyphen produziert werden, hat ihre Deletion jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum der Lufthyphen und Sporen sowie deren Hydrophobizität [38]. Tatsächlich enthält das Genom von
S. avermitilis keine Gene für Rodline und dementsprechend produziert diese Spezies keine Rodlet-dekorierten Sporen [38]. Im Gegensatz zu RdlA besitzt RdlB die Fähigkeit, amyloide Fibrillen zu bilden, wie erst kürzlich gezeigt wurde [46]. Diese Eigenschaft von RdlB konnte auf einen N-terminalen Bereich von 26 AS zurückgeführt werden, der sich von RdlA durch einen geringeren Anteil geladener AS unterscheidet. Der Austausch drei geladener AS war ausreichend, damit RdlA in vitro als auch in vivo zu amyloiden Fibrillen assemblierte [46]. Die Rodlet-Schicht wird somit möglicherweise als eine separate Schicht von Rodlinen gebildet und nicht wie vorher vermutet, im Zusammenspiel mit Chaplinen, die durch Rodline in paarweise Fibrillen angeordnet werden [33, 46]. Dies führt zu einem Modell, in dem Lufthyphen und Sporen von zwei amyloiden Schichten umgeben werden: Die amyloide Schicht der Chapline gewährleistet die Hydrophobizität der Sporen für deren effiziente Verbreitung sowie Schutz vor Austrocknung, während die äußere Schicht der Rodline zu einer weiteren Stabilisierung der entstehenden Lufthyphen beiträgt und die Entwicklung der Sporen in enger Verbindung mit der Kolonie
sicherstellt, sodass diese erst nach Abschluss des Sporulationsprozesses freigesetzt werden (Abbildung 2C) [42, 46].
Die Morphologie der Lufthyphen und Sporenketten variiert unter den Streptomyceten von gerade, spiralförmig und gekrümmt zu wirtelartig [24, 50]. Streptomyceten, die ehemals zu der Gattung
Streptoverticillium gehörten, zeigen eine ausgeprägte Morphologie: Sie bilden lange, gerade Hyphen, die zu Wirteln mit endständigen sporenbildenden Dolden verzweigen [51]. Streptoverticillium und
Streptomyces wurden zu letzterer Gattung vereinigt, da u.a. ihre Zellwände den gleichen Chemotyp besitzen und 16S-rRNA-Sequenzanalysen ihre enge Verwandtschaft aufzeigten [52-54]. Ein Vertreter der Streptoverticillien ist Streptomyces mobaraensis (Sv. mobaraense), der als Industriestamm für die Produktion des Enzyms Transglutaminase bekannt ist [55]. Das ungefähr 7,5 Mbp große Genom wurde 2013 unabhängig von Yang et al. und im Rahmen der Dissertation von S. Zindel aus der Arbeitsgruppe Fuchsbauer sequenziert [56, 57]. Die Analyse des Genoms führte zur Identifizierung von Genen kodierend für ein langes Chaplin (chp1), fünf kurze Chapline (chp2-6) sowie für drei Rodline (rdl1-3) [57]. Ein Sequenzvergleich zeigte homologe Bereiche in den aus der DNA abgeleiteten Primärstrukturen der Rodline und Chaplindomänen von S. coelicolor und S. mobaraensis. Obwohl ChpE eine essenzielle Funktion bei der Entwicklung des Luftmycels von S. coelicolor zugeschrieben wird, besitzt S. mobaraensis interessanterweise kein Pendant zu ChpE, denn alle Chapline enthalten Cystein. Auffallend ist, dass das lange Chaplin Chp1 von S. mobaraensis (272 AS) mehr AS als ChpA-C aus S. coelicolor (210-230 AS) und einen fünften Cysteinrest aufweist. Zusätzliche AS befinden sich vor allem zwischen der zweiten Chaplindomäne und dem Erkennungsmotiv für Sortasen. Neben der Analyse der genetischen Organisation der Chapline und Rodline von S. mobaraensis gehen bisherige Untersuchungen jedoch nicht über grundlegende bioinformatische Analysen der Primärstruktur hinaus.
1.2. Sortasen
Die Zellwand Gram-positiver Bakterien besteht aus mehreren Schichten Peptidoglycan von 30-100 nm Dicke [58]. Das Peptidoglycan fungiert als schützende Barriere gegen äußere Umwelteinflüsse, bewahrt die Zellintegrität durch Entgegenwirken des Turgors und dient als Gerüst zur Verankerung von Teichonsäuren, Polysacchariden und Proteinen, um effektiv mit der Umgebung zu interagieren [59]. Ein Teil der Proteine, die an der Zelloberfläche Gram-positiver Bakterien exponiert sind, werden durch Sortase-Enzyme kovalent am Peptidoglycan verankert [60].
Sortasen sind Membran-gebundene Cystein-Transpeptidasen, die eine charakteristische -barrel-Struktur, bestehend aus acht -Faltblättern und einer katalytischen Triade aus Cystein, Histidin und Arginin, besitzen (Abbildung 3A) [61]. Sortasen erkennen ihre über das Sec-Transportsystem exportierten Substrate an einem C-terminalen cell wall sorting signal (CWSS) [60]. Dieses beinhaltet ein Sortase-spezifisches Pentapeptid-Motiv, gefolgt von einer Sequenz aus hydrophoben AS und einem
positiv geladenen C-Terminus, der das Substratprotein in der Zellmembran zurückhält und für die Prozessierung mittels Sortase positioniert [62]. Der Mechanismus der Transpeptidierungsreaktion ist für die Sortase A (SrtA) von Staphylococcus aureus am besten verstanden, da SrtA seit ihrer Entdeckung im Jahr 1999 intensiv untersucht wurde (Abbildung 3B, C) [63, 64].
Abbildung 3: Struktur und Mechanismus der Sortase A von Staphylococcus aureus. Kristallstruktur der SrtA mit katalytischer Triade und charakteristischer -barrel-Struktur bestehend aus acht -Faltblättern in rot, Helices in grün dargestellt (PDB 1IJA). B) Vorgeschlagener Mechanismus der SrtA in Anlehnung an Clancy et al. (2010) [65]. C) Schematische Darstellung der Sortase-vermittelten Verankerung von Proteinen an der Zelloberfläche Gram-positiver Bakterien. Das Oberflächenprotein (blau) besitzt ein N-terminales Sec-Signalpeptid und ein C-terminales cell wall sorting signal (CWSS) bestehend aus dem SrtA-Erkennungsmotiv LPXTG, einer Sequenz hydrophober AS (orange) und einem postiv geladenen C-Terminus (+). Nach der Sekretion über das Sec-Transportsystem wird das Protein durch das C-terminale Segment in der Membran zurückgehalten und von der SrtA an der Erkennungssequenz zwischen Threonin und Glycin gespalten. Es entsteht ein Acyl-Enzymkomplex, der durch den nukleophilen Angriff der N-terminalen α-Aminogruppe der Pentaglycin-Peptidbrücke von Lipid II aufgelöst wird. Das Protein wird dadurch kovalent mit dem Lipid II verbunden, welches im Verlauf der Zellwandsynthese im Peptidoglycan eingebaut wird.
Die Katalyse beginnt mit einem nukleophilen Angriff der Thiolatgruppe des Cys184 im Aktivzentrum auf die Carboxylgruppe des Threonins des SrtA-Erkennungsmotiv LPXTG, wodurch ein tetraedrisches Oxyanion-Intermediat entsteht, was durch Arg197 stabilisiert wird. Die Peptidbindung zwischen Threonin und Glycin wird unter Bildung eines Thioester-Acyl-Enzymkomplexes gespalten, wobei das Imidazoliumion von His120 für die Protonierung der Aminofunktion der Abgangsgruppe verantwortlich ist [65]. Als nächstes bindet das zweite Substrat, eine Pentaglycin-Peptidbrücke von Lipid II (Peptidoglycan-Vorstufe), an den Acyl-Enzymkomplex. Die N-terminale Aminogruppe des Pentaglycins greift nukleophil die Carboxylfunktion des Thioesters an, wodurch unter Ausbildung eines zweiten tetraedrischen Intermediats das Enzym verdrängt wird und eine neue Peptidbindung zwischen Sortasesubstrat und Lipid II entsteht. In weiteren Reaktionen der Zellwandsynthese wird über Transpeptidierung und Transglycosylierung das Lipid II-gebundene Sortasesubstrat in das Peptidoglycan eingebaut [66].
Anhand ihrer Primärstruktur und Funktionen werden Sortasen in die Klassen A-F eingeteilt, wobei jede Klasse ein spezifisches Pentapeptid-Motiv im CWSS und Varianten davon erkennt [60, 67]. Sortasen der Klasse A treten in den meisten Gram-positiven Bakterien auf, wo sie durch ihre housekeeping-Funktion Proteine, darunter viele Virulenz-Faktoren, mit dem Erkennungsmotiv LPXTG kovalent an der Zelloberfläche verankern [63]. Die Gene für potentielle Substrate der housekeeping-Sortasen liegen im Genom verteilt vor, während Sortasen mit einer spezialisierten Funktion, meistens SrtB-D/F, und ihre Substrate von einem Gen-Cluster kodiert werden [67]. Sortasen der Klasse B sind an der Eisenakquisition beteiligt, indem sie Häm-Bindeproteine an der Zelle befestigen. Sie besitzen das Erkennungsmotiv NP(Q/K)TN [68]. Des Weiteren sind SrtB, wie Sortasen der Klasse C, an der Assemblierung von Pili beteiligt [69]. Sortasen der Klasse D sind bisher wenig charakterisiert. In Bacillus anthracis verankern sie Proteine, die an der Sporulation beteiligt sind und das Motiv LPNTA aufweisen [70]. Sortasen der Klasse E und F kommen überwiegend in Gram-positiven Bakterien mit hohem GC-Gehalt vor und wurden bisher wenig untersucht. Erst kürzlich erfolgte die erste Charakterisierung einer SrtF anhand der einzigen Sortase aus Propionibacterium acnes [71]. Sortasen der Klasse E sind in bodenbewohnenden und aquatischen Actinobakterien, wie Streptomyces und Corynebacterium, weit verbreitet [45, 67, 72, 73]. SrtE besitzen mit LAXTG ein ungewöhnliches Erkennungsmotiv, in welchem das hoch konservierte Prolin durch Alanin ersetzt ist [66, 67]. Das Genom von Streptomyces coelicolor enthält neben fünf SrtF-Genen zwei nebeneinander liegende Gene für Sortasen der Klasse E, SrtE1 und SrtE2 [45]. Da ihre Gene nicht benachbart zu ihren vorhergesagten Substraten positioniert sind, werden SrtE1/2 housekeeping-Funktionen zugeordnet [45]. Zu ihren Substraten gehören die langen Chapline ChpA-C mit den Erkennungsmotiven LAETG und LAHTG, deren Spaltung auf Peptidebene in vitro und die Verankerung von ChpC in der Zellwand in vivo nachgewiesen wurde [45]. Die Kristallstruktur von SrtE1 wurde 2016
als erste Struktur einer Sortase der Klasse E gelöst, worauf die Charakterisierung und Kristallstruktur der housekeeping-Sortase SrtE3 aus S. avermitilis folgte [73, 74].
Aufgrund ihrer Transpeptidierungsreaktion haben Sortasen in der Biotechnologie an Bedeutung gewonnen, da sie Moleküle ortsspezifisch modifizieren können. Durch das Einbringen eines spezifischen Erkennungsmotivs werden Proteine (Enzyme, Antikörper etc.) durch Sortase-vermittelte Ligation kovalent an Zellen, andere Proteine, Fluorophore oder Toxine gebunden, zyklisiert oder auf festen Oberflächen immobilisiert [75-77].
1.3. Mikrobielle Transglutaminasen
Transglutaminasen (Protein-Glutamin:Amin-γ-Glutamyltransferase, EC 2.3.2.13) gehören wie Sortasen zu der Enzymklasse der Transferasen und modifizieren Proteine post-translational. Sie katalysieren den Acyl-Transfer zwischen der γ-Carboxyamidgruppe eines Protein- oder Peptid-gebundenen Glutamins (Donor) und primären Aminen (Akzeptor) [78]. Dient ein Protein-gebundenes Lysin als Acyl-Akzeptor werden inter- oder intramolekulare Isopeptidbindungen ausgebildet, die zur Vernetzung des Proteins führen können [79]. Steht kein primäres Amin zur Verfügung, agiert Wasser als Acyl-Akzeptor und Glutamin wird zu Glutamat deamidiert. Als Nebenprodukt wird Ammoniak freigesetzt (Abbildung 4) [78].
Abbildung 4: Reaktionen katalysiert durch Transglutaminase. A) Transamidierung B) Vernetzungsreaktion C) Deamidierung. Nach Jaros et al. (2006) [80].
Transglutaminasen sind in der Natur weit verbreitet. Sie sind in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen zu finden, wo sie an physiologischen und zellulären Prozessen wie Wundheilung, Apoptose, Signaltransduktion, Gewebestabilisierung, Zellwandaufbau oder Photosynthese beteiligt sind [81-83]. Dysregulation humaner Transglutaminasen führt zu Krankheiten wie Gerinnungsstörung, Autoimmunerkrankungen oder Alzheimer [84]. Im Gegensatz zu eukaryotischen Transglutaminasen sind prokaryotische Transglutaminasen Cofaktor-unabhängig, weisen eine breitere Substratspezifität und geringere Deamidierungsaktivität auf [85, 86]. Die biologischen Funktionen sind jedoch bisher kaum untersucht. In Bacillus subtilis sind sie während der Sporulation an der Assemblierung von
Proteinen der äußeren Sporenhülle, in Streptomyces hygroscopicus an der Lufthyphenbildung beteiligt [87, 88]. Das Enzym aus Streptomyces mobaraensis ist der wichtigste Vertreter der mikrobiellen Transglutaminasen (MTG) und wird in der Lebensmittelindustrie z.B. zur Texturverbesserung von Milchprodukten oder zur Restrukturierung von Fleisch sowie in der pharmazeutischen Industrie z.B. zur Funktionalisierung von Antikörpern eingesetzt [89-91]. Die physiologische Funktion ist jedoch noch weitgehend unbekannt.
Bei S. mobaraensis wird die MTG als inaktives Proenzym von 376 AS sekretiert, um den Wirt vor unkontrollierter Vernetzung zu schützen [92]. Das 45 AS lange Propeptid, bestehend aus einer langen α-Helix, bedeckt dabei den Spalt des aktiven Zentrums und verhindert so den Zugang von Substraten [93]. Extrazellulär erfolgt die Prozessierung des Proenzyms durch die endogene Transglutaminase-aktivierende Metalloprotease (TAMP) und einer Prolyltri/tetrapeptidyl-Aminopeptidase (PTP) [94, 95]. Das reife Enzym besteht aus 331 AS mit einer Molekülmasse von 37,9 kDa [92]. Die MTG besitzt eine scheibenartige Struktur mit einem zentralen acht-strängigen β-Faltblatt, elf umgebenden α-Helices und einem 16 Å tiefen Spalt, der durch zwei hervorstehende Loop-Regionen gebildet wird (Abbildung 5A). In dem Spalt ist die katalytische Triade, bestehend aus Cystein, Histidin und Aspartat, lokalisiert [79, 93]. Durch die scheibenartige Struktur ist das aktive Zentrum im Spalt von zwei Seiten zugänglich. Während das vordere Vestibül, in dessen Nähe das katalytische Cystein positioniert ist, überwiegend hydrophobe und schwach positiv geladene AS besitzt, befinden sich am hinteren Vestibül des aktiven Zentrums stark negativ geladene AS (Abbildung 5B). Dies führte nach Kashiwagi et al. (2002) zu der Annahme, dass die Position des katalytischen Cysteins sowie die Ladungsverteilung am vorderen Vestibül die Bindung des Acyl-Donors und die stark negativ geladenen AS des hinteren Vestibüls den Zugang eines positiv geladenen Acyl-Akzeptors begünstigen [79].
Die MTG-vermittelte Proteinmodifizierung beginnt wie bei Sortasen mit dem nucleophilen Angriff des Thiolations von Cys64 auf die γ-Carboxyamidgruppe der Glutaminseitenkette des Acyl-Donors (Abbildung 5C). Asp255 dient dabei als Protonendonor für das resultierende Oxyanion-Intermediat und die Freisetzung von Ammoniak unter Ausbildung eines Thioesters im Enzymkomplex. Der Acyl-Akzeptor, hier die Seitenkette eines Lysinrestes, bindet im aktiven Zentrum und greift den Thioester des Acyl-Enzymkomplexes nukleophil an, wobei das negativ geladene Asp255 als Protonenakzeptor dient. Das Thiolat von Cys64 wird aus dem Oxyanion-Intermediat verdrängt und die katalytische Reaktion abgeschlossen [79]. His274 wird eine stabilisierende Funktion zugeordnet, in dem es Asp255 unter Ausbildung einer Wasserstoffbrückenbindung positioniert und die bevorzugte Konformation des Acyl-Akzeptors im aktiven Zentrum erleichtert [79, 93]. Die katalytische Aktivität der MTG ist dabei, im Gegensatz zu eukaryotischen Transglutaminasen, Ca2+-unabhängig [55].
Abbildung 5: Struktur und Mechanismus der Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis. A) Kristallstruktur der MTG mit der katalytischen Triade und -Faltblattstruktur in orange, Helices in grün, Propeptid in blau dargstellt (PDB 3IU0,1IU4). B) Elektrostatische Oberflächenpräsentation der MTG (PDB 1IU4). C) Vorgeschlagener Mechanismus der MTG nach Kashiwagi et al. (2002) [79].
Die Substratspezifität der MTG ist noch nicht vollständig verstanden. Die Exposition von Glutamin- und Lysin-Resten an der Oberfläche eines Proteins ist essentiell, aber nicht hinreichend für eine effektive MTG-vermittelte Modifizierung. Während die MTG nahezu jedes primäre Amin, also auch unverbrückte Lysinreste, als Acyl-Akzeptor toleriert, ist die Bindung von Acyl-Donor-Substraten, also Glutaminresten, hochspezifisch [96]. Die umgebenden AS als auch Sekundär- und Tertiärstruktur beeinflussen die Reaktivität des Glutamins, was die Vorhersage von Acyl-Donor-Substraten erschwert [85, 97]. Der Einfluss der flankierenden AS eines Glutamin-Donors wurde u.a. mit Hilfe von Peptid-Bibliotheken untersucht [96, 98]. Hierbei wurde eine Präferenz für hydrophobe AS in der Umgebung des Glutamins, Arginin an den Positionen Gln+1 und Gln-1 sowie für das Motiv LQR aufgezeigt. Des Weiteren wurde Prolin an der Position Gln-1, aber nicht an Gln+1, akzeptiert. Bei der Verwendung einer mRNA-Display-Bibliothek wurden jedoch Peptide mit Prolin an der Position Gln-1 als Substrat identifiziert [99]. Ein weiterer Widerspruch wurde für Arginin in der Nähe des Glutamins aufgezeigt. In einem Peptid GXXQXXG führte das Einbringen von Argininen an den Positionen X zu einem schlechten Substrat [100]. Mit Ausnahme der Präferenz für hydrophobe AS wurde somit kein eindeutiges Motiv identifiziert, nach
der sich die Selektivität der MTG richtet. Die Erkenntnisse, die aus Peptid-basierten Screening gewonnen werden, geben einen Einblick bezüglich der umgebenden Primärsequenz eines MTG-Substrates und ermöglichen die Entwicklung neuer tags für die MTG-vermittelte Biokonjugation. Jedoch unterscheidet sich die Substratspezifität auf Proteinebene, da Sekundär- und Tertiärstruktur die Zugänglichkeit des Glutamins beeinflussen. So werden flexible und ungeordnete Bereiche sowie entfaltete Proteine von der MTG im Vergleich mit Proteinen in ihrer gefalteten Form bevorzugt modifiziert [101, 102].
Für ein besseres Verständnis der Substratspezifität sowie der physiologischen Funktion der MTG erfolgte die Untersuchung intrinsischer Substratproteine in der Arbeitsgruppe Fuchsbauer.
Dazu zählt der Streptomyces-Subtilisin- und TAMP-Inhibitor (SSTI). Dieser fungiert als doppelköpfiger Inhibitor gegen die Serinprotease Subtilisin und die Metalloprotease TAMP, wodurch er eine regulierende Funktion gegenüber der MTG besitzt [103]. Das 2x12 kDa große Homodimer weist sechs Glutamine und acht Lysine auf und wurde als Glutamin- sowie Lysin-Donorsubstrat identifiziert. Während der Kultivierung reduzierte sich jedoch die Reaktivität der Glutamine des aus der Kulturbrühe isolierten SSTI, vermutlich durch post-translationale Modifizierungen [103].
Die -Lactamase Sml-1, die den Wirt vor Lactam-Antibiotika schützt, wird ebenfalls von der MTG als Glutamin- und Lysinsubstrat akzeptiert [104]. Das 39 kDa große Protein besitzt 15 Glutamine und 19 Lysine. Ein Teil der Glutamine befindet sich in der N-terminalen Helix, wie durch eine modellierte Tertiärstruktur bestimmt wurde. Bisher wurde die Sml-1 jedoch nicht weiter untersucht.
Ein weiteres gut charakterisiertes intrinsisches Substratprotein ist das Dispaseautolyse-induzierende Protein (DAIP), welches M4-Metalloproteasen wie Dispase oder Thermolysin entfaltet und zur Autolyse führt [105, 106]. Das 37 kDa große sieben-blättrige -Faltblatt-Propeller-Protein besitzt fünf Glutamine und zehn Lysine. Durch den Austausch der Glutamine durch Asparagin in Kombination mit strukturellen Daten der gelösten Kristallstruktur wurden die Glutamine über den Einbau von Monobiotinylcadaverin bezüglich ihrer Reaktivität untersucht [107]. Dabei wurden die drei Glutamine, Gln39, Gln298 und Gln345, welche in Loop-Regionen positioniert sind, bevorzugt, wobei die Modifizierung des Gln39, umgeben von kleinen, hydrophoben und polaren AS, am effizientesten war. Die Glutamine Gln65 und Gln144, die in -Faltblättern lokalisiert und von geladenen oder sperrigen AS flankiert sind, dienten ebenfalls als Substrat, jedoch deutlich weniger effizient. Die Sequenzmotive der reaktiven Glutamine von DAIP stimmten dabei mit keinem vorhergesagten Motiv aus Peptid-Bibliotheken überein, was den Unterschied zwischen physiologischen Protein- und Peptidsubstraten unterstreicht [107].
Ein weiteres intrinsisches Substrat der MTG aus S. mobaraensis ist der Streptomyces-Papain-Inhibitor (SPIP) [108]. Das 12 kDa Protein besitzt drei Glutamine und sechs Lysine. Von den drei Glutaminen ist jedoch nur eines reaktiv. Dieses Gln6 am N-Terminus von SPIP wird von kleinen und hydrophoben AS, an Position Gln+1 von Lysin umgeben. Im Vergleich zu DAIP ist es jedoch ein weniger effizientes Glutamin-Substrat der MTG. Der Austausch von Lysin durch Glycin führte allerdings zu einer deutlichen
Verbesserung der Reaktivität, was vorherige Ergebnisse bezüglich bevorzugter Glutamin-flankierender AS bestätigte [109]. Abgeleitet von Gln6 wurde ein zehn AS langes Inhibitorpeptid IP2 (DIPIGS-(COCH2Cl)-KMTG) synthetisiert und im Komplex mit der MTG kristallisiert, was zu der ersten Kristallstruktur des Enzyms mit einem Pseudosubstrat führte (Abbildung 6) [110].
Abbildung 6: Struktur der Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis im Komplex mit IP2. Kristallstruktur der MTG im Komplex mit dem Peptid IP2 DIPIGS-(COCH2Cl)-KMTG (grün, stick-Darstellung) (PDB 6GMG). Das Peptid ist über das Cystein
(gelb) kovalent gebunden und interagiert mit den hydrophoben AS (orange) lokalisiert an den Spaltwänden der MTG. Nach Jüttner et al. (2018) [110].
In der Komplexstruktur besetzt IP2 vollständig den Spalt des aktiven Zentrums der MTG, dabei sind die AS des kovalent gebundenen warheads Oas6 sowie Ile4 und Gly5am Boden des Spaltes lokalisiert. Die
termini des IP2 sind in Richtung des Front-Vestibüls orientiert und ragen aus dem Spalt nach oben. Die hydrophobe Wechselwirkung zwischen MTG und IP2 beschränkt sich dabei auf AS, die sich an den Spaltwänden befinden. Eine Wechselwirkung zwischen IP2 und AS am Front-Vestibül der MTG, der Glutamin-Donorseite, ist nicht zu erkennen [110]. Dies deutet, zusammen mit der Ausrichtung des Peptids im Spalt, auf einen Reißverschluss-ähnlichen Vernetzungsmechanismus von selbst-assemblierten Substratproteinen durch die MTG hin [110].
Die gewonnenen Erkenntnisse sowie die Beteiligung der MTG bei der Lufthyphenbildung in
S. hygroscopicus führten zu der Hypothese, dass die MTG als physiologische Funktion Proteine in der Lufthyphen- und Sporenhülle vernetzt, nachdem diese an der Selbst-Assemblierung der äußeren Chaplin- und Rodlinschicht teilgenommen haben. In S. mobaraensis würde durch den Einbau der hier vorgestellten intrinsischen Substrate eine Schutzschicht gegen exogene Proteasen gebildet werden [108].
1.4. Zielsetzung
Die Motivation zu dieser Arbeit beruht auf vorangegangenen Studien und der Hypothese, dass ein Zusammenhang zwischen der Transglutaminase und dem Aufbau der äußeren Proteinschicht der Lufthyphen bei bestimmten Streptomyceten wie Streptomyces mobaraensis besteht [5, 57, 88, 108]. Wesentliche Bestandteile der äußeren Lufthyphen- und Sporenhülle sind die hydrophoben Proteine Chapline und Rodline. Sollten Chapline und/oder Rodline Substrate von Transglutaminase sein, dürfte ein vergleichsweise stabiler Lufthyphenmantel aus den beiden Basisbausteinen entstehen, der zudem durch den Einbau von Proteaseinhibitoren gegen Abbau geschützt ist. Die Frage nach Interaktion und Vernetzung durch Transglutaminase erforderte die eingehende Untersuchung der Chapline und Rodline aus S. mobaraensis. Weiterführend war mit dieser Frage ein BMBF-Projekt verbunden, das die Herstellung von Enzymimmobilisaten durch enzymatische Kopplung von Enzymen an Lufthyphen und Sporen von Streptomyceten zum Ziel hatte. In diesem Zusammenhang war zu prüfen, ob nicht die reifen Sporen von S. mobaraensis bereits zugängliche Lysin- und Glutaminreste besitzen, die Transglutaminase die kovalente Bindung von Enzymen an die Oberfläche ermöglichen.
Zunächst sollte ein Verfahren zur rekombinanten Produktion der Lufthyphenproteine in E. coli etabliert werden. Von sechs Chaplinen und drei Rodlinen, die S. mobaraensis exprimieren kann, wurden dafür das lange Chp1, das kurze Chp3 sowie Rdl1 ausgewählt, die mit den physiologisch relevanten Proteinen ChpC, ChpH and RdlB von S. coelicolor A3(2) am nächsten verwandt sind. Außerdem wurde als Vergleichsprotein erstmals auch Sc-ChpC rekombinant produziert und gereinigt. Nach erfolgreicher Produktion waren die Eigenschaften der Proteine zu untersuchen, insbesondere ihre Interaktion mit dem Enzym Transglutaminase. Chapline sind in der Literatur als intrinsically disordered proteins (IDP) beschrieben, die vermutlich erst bei der Selbst-Assemblierung unter Turgordruck die funktionale Struktur einnehmen. In dieser Arbeit sollte erstmals der Versuch unternommen werden, die Grenzflächeneigenschaften der Chapline und Rodline aus S. mobaraensis in einem Langmuir-Trog zu bestimmen und dabei auch ihre Selbst-Assemblierung und Faltung zu simulieren, was sich auch auf die Bindung von Transglutaminase auswirken sollte.
Zusätzlich sollte für die Sortase E2 (SrtE2) aus S. mobaraensis ein Reinigungsprotokoll zur rekombinanten Produktion in E. coli etabliert werden, für die Sm-Chp1 und Sc-ChpC die Peptidoglycanvernetzungsstelle LAXTG besitzen. Sm-SrtE2 kann möglicherweise mit Transglutaminase um den kovalenten Einbau von Sm-Chp1 konkurrieren oder, wahrscheinlicher, am Einbau kooperativ mitwirken.
Insgesamt sollte diese Arbeit einen Beitrag zum besseren Verständnis der physiologischen Funktion der MTG sowie des langen Chaplins in S. mobaraensis leisten. Ein langes Chaplin war zu Beginn dieser Arbeit von keiner anderen Arbeitsgruppe produziert und charakterisiert worden.
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien
Standardchemikalien wurden von den Herstellern AppliChem (Darmstadt), Carl Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Steinheim), Thermo Fisher Scientific (Dreiech) und VWR (Darmstadt) bezogen. Besondere Chemikalien sind im Folgenden aufgelistet:
Chemikalie Hersteller
Abz-Leu-Ala-His-Thr-Gly-Dnp GenScript, Piscataway, NJ, USA Biotinyl-Thr-Val-Gln-Gln-Glu-Leu-OH Zedira, Darmstadt
Dabcyl-Leu-Ala-X-Thr-Gly-EDANS GenScript, Leiden, NL (X=Glu, His, Asn, Gln, Arg)
Midori Green Nippon Genetics, Düren
N-(Biotinyl)cadaverin Zedira, Darmstadt
Biotinyl-Thr-Val-Gln-Gln-Glu-Leu-OH Zedira, Darmstadt
Odyssey® Blocking Buffer (PBS) LI-COR Biosciences, Bad Homburg
2.1.2. Kits
Name Hersteller
FastGene® Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics, Düren peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I VWR, Darmstadt
PierceTM BCATM Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Dreieich
2.1.3. Mikroorganismen
Stamm Hersteller
E. coli BL21-(DE3) plysS Novagen, Merck, Darmstadt
E. coli XL1-Blue Stratagene, La Jolla, USA
S. mobaraensis (DSM:40487) DSMZ, Braunschweig
2.1.4. Plasmide
Name Eigenschaften Hersteller
pET14b AmpR, T7-Promotor, His6-tag (N-terminal), 4671 bp
pET22b(+) AmpR, T7-Promotor, pelB Sequenz, His6-tag (C-terminal), 5493 bp
Novagen, Merck, Darmstadt
pET28a(+) KanR, T7-Promotor, His6-tag (N-/C-terminal), 5369 bp
Novagen, Merck, Darmstadt
pGEX-3T AmpR, tac-Promotor, GST-tag (N-terminal), 4979 bp
GE Healthcare, Solingen
pUC57-chp1 AmpR, pUC57 mit für E. coli codonoptimierten Gen für Sm-Chp1 (N1NTQ8, AS 29-301)
GenScript, Piscataway, NJ, USA pUC57-chp3 AmpR, pUC57 mit für E. coli codonoptimierten Gen
für Sm-Chp3 (N1NTQ8, AS 26-77)
GenScript, Piscataway, NJ, USA pUC57-rdl1 AmpR, pUC57 mit für E. coli codonoptimierten Gen
für Sm-Rdl1 (N1NV62, AS 28-136)
GenScript, Piscataway, NJ, USA pUC57-srtE2 AmpR, pUC57 mit für E. coli codonoptimierten Gen
für Sm-SrtE2 (M3CCT9, AS 51-250)
GenScript, Piscataway, NJ, USA pUC57-chpC AmpR, pUC57 mit für E. coli codonoptimierten Gen
für Sc-ChpC (Q9AD93, AS 29-259) BioCat, Heidelberg
2.1.5. Oligonukleotide (Primer)
Name Sequenz (5'-3') Sm-Chp1 Chp1_for AAATTTCATATGGATAGCGGCGCGCAG Chp1_rev AAATTTCTCGAGTCAGCCCTGTTGACCCGCAC Δ299-301Chp1_rev AAATTTCTCGAGTTAACCCGCACGGCTACG Δ299-301Chp1-Q255N_for CGTCCGGCGAATCAAGCGGCGGTTGAG Δ299-301Chp1-Q255N_rev CGCCGCTTGATTCGCCGGACGGT Δ299-301Chp1-Q256N_for TCCGGCGCAGAATGCGGCGGTTGAG Δ299-301Chp1-Q256N_rev TCAACCGCCGCATTCTGCGCCGGAC Δ299-301Chp1-Q255/256N_for CGTCCGGCGAATAATGCGGCGGTTGAG Δ299-301Chp1-Q255/256N_rev CTCAACCGCCGCATTATTCGCCGGACG Δ299-301Chp1-Q96N-Q255/256N _for GAGCCACGGTAATGGCCACGGTCAC Δ299-301Chp1-Q96N-Q255/256N_rev GTGACCGTGGCCATTACCGTGGCTC- Sm-Chp3 Chp3_for AAATTTAAGCTTCACATCATCATCATCATCATGATTATGAT ATTCCTACTACTGAGGACCTGTACTTCCAGAGCG Chp3_rev AAATTTCTCGAGTCACTTATTAACGCAGATGTTGCCGSm-Rdl1 Rdl1_for AAATTTAAGCTTCACATCATCATCATCATCATGATTATGAT ATTCCTACTACTGAGGACCTGTACTTCCAGAGCG Rdl1_rev_ AAATTTCTCGAGTCACCACAGACGACCGTTCGC Sm-SrtE2 SrtE2_for AAATTTCATATGACCAACGTGATTGCGGAC SrtE2_rev AAATTTCTCGAGTCAGCCACGCAGTTCCTTCGG SrtE2-Q62N_for GAGGCGAAGCGTAATGGCGCGCAAGTG SrtE2-Q62N_rev CACTTGCGCGCCATTACGCTTCGCCTC SrtE2-Q65N_for GCGTCAAGGCGCGAATGTGCGTGAGAAC SrtE2-Q65N_rev GTTCTCACGCACATTCGCGCCTTGACGC SrtE2-Q62/65N_for GCGTAATGGCGCGAATGTGCGTGAGAAC SrtE2-Q62/65N_rev GTTCTCACGCACATTCGCGCCATTACGC- SrtE2-Q129N_for CTGCCGTGGGAAGGTAATGGTAACCTGAC SrtE2-Q129N_rev GTCAGGTTACCATTACCTTCCCACGGCAG SrtE2-Q176N_for CAAGGAACTGAAAAATACCAGCCGTTTTAACG SrtE2-Q176N_rev CGTTAAAACGGCTGGTATTTTTCAGTTCCTTG Δ1-55SrtE2_for AAATTTCATATGGACCGTGAGGCGAAGCG Δ1-78SrtE2_for AAATTTCATATGGACACCAAAGATGGTGTGGG Sc-ChpC ChpC_for AAATTTCATATGGATAGTGGCGCACATGG ChpC_rev AAATTTCTCGAGTCAAACGCTGGCACGTGC ChpC-Q214N_for GTCCGGGTGCAAATACCGTTGATCAGC ChpC-Q214N_rev GCTGATCAACGGTATTTGCACCCGGAC ChpC-Q80N-Q214N_for CCTGTGCAAATAATGGTGGTGGTGCCAGTG ChpC-Q80N-Q214N_rev CTGGCACCACCACCATTATTTGCACAG Sequenzierungsprimer T7 Promotor_for TAATACGACTCACTATAGGG T7 Terminator_rev GCTAGTTATTGCTCAGCGG pGEX_for CATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCC pGEX_rev GCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGC
2.1.6. Enzyme, Proteine und Molekulargewichtsstandards
Enzym/Protein Hersteller
BSA (Rinderserumalbumin) Serva Electrophoresis, Heidelberg
DAIP D. Fiebig, AG Fuchsbauer, Hochschule Darmstadt
DNaseI AppliChem, Darmstadt
DreamTaqTM DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific, Dreieich
MTG N. Jüttner, AG Fuchsbauer, Hochschule Darmstadt
Phusion® High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs, Frankfurt Q5® High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs, Frankfurt Restriktionsenzyme New England Biolabs, Frankfurt
SPI N. Jüttner, AG Fuchsbauer, Hochschule Darmstadt
Streptavidin--Galactosidase Merck, Darmstadt
T4 DNA-Ligase Thermo Fisher Scientific, Dreieich
Taq-DNA-Polymerase AG Fuchsbauer, Hochschule Darmstadt
wtSSTI N. Jüttner, AG Fuchsbauer, Hochschule Darmstadt
Molekulargewichtsstandards Hersteller
ChameleonTM Duo, prestained LI-COR Biosciences, Bad Homburg GeneRulerTM 1 kb DNA-Leiter Thermo Fisher Scientific, Dreieich PageRulerTM Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Dreieich PageRulerTM Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Dreieich PageRulerTM Unstained Low Range Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Dreieich
2.1.7. Antikörper und Farbstoffkonjugate
Name Hersteller
Anti-His pAB Rabbit polyclonal IgG Carl Roth, Karlsruhe
Gly3-TAMRA A. Ebenig, AG Kolmar, TU Darmstadt
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences, Bad Homburg IRDye® 800CW Streptavidin LI-COR Biosciences, Bad Homburg
2.1.8. Puffer und Lösungen
DNA-Auftragspuffer (6×) 0,03 % (w/v) Bromphenolblau
60 % (v/v) Glycerol 60 mM Na2-EDTA 10 mM Tris-HCl pH 8,5
TAE-Puffer 20 mM Essigsäure 1 mM Na2-EDTA 40 mM Tris-HCl pH 8,5 SDS-Elektrophoresepuffer (10×) 1,92 M Glycin 250 mM Tris-HCl pH 8,9 1 % (w/v) SDS SDS-Auftragspuffer (5×) 0,1 % (w/v) Bromphenolblau 50 % (v/v) Glycerol 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol 10 % (w/v) SDS 250 mM Tris-HCl pH 6,8
Coomassie-Färbelösung 0,25 % (w/v) Coomassie blue R-250 in H20 0,25 % (w/v) Coomassie blue G-250 in EtOH 10 % (v/v) Essigsäure Coomassie-Entfärbelösung 40 % Ethanol 10 % Essigsäure Transferpuffer 48 mM Tris-HCl pH 9,1 39 mM Glycin 1,3 mM SDS 20 % (v/v) Methanol PBS 10 mM Na2HPO4 pH 7,4 1,8 mM KH2PO4 137 mM NaCl 2,7 mM KCl PBST PBS 0,1 % (v/v) Tween 20
2.1.9. Kultivierungsmedien
LB-Medium 10 g/l Pepton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl (1,5 % (w/v) Agar-Agar)Autoinduktionsmedium 4,5 g/l Glycerol 10 g/l Pepton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl 22 mM K2HPO4 17,3 mM Na2HPO4 1,8 mM MgSO4 0,45 g/l D-Glucose 1,2 g/l Lactose SOC-Medium 5 g/l Hefeextrakt 20 g/l Pepton 20 mM D-Glucose 2,5 mM KCl 10 mM NaCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 TYM-Medium 5 g/l Hefeextrakt 20 g/l Pepton 100 mM NaCl 10 mM MgSO4 TfB1-Puffer 30 mM Kaliumacetat 100 mM KCl 10 mM CaCl2 15 % (w/v) Glycerol 50 mM MnCl2 pH 5,8 TfB2-Puffer 10 mM MOPS 10 mM KCl 75 mM CaCl2 15 % (w/v) Glycerol pH 7,0
GYM-Medium 4 g/l D-Glucose 4 g/l Hefeextrakt 10 g/l Malzextrakt 2 g/l CaCO3 (1,5 % (w/v) Agar-Agar) pH 7,2 Antiobiotika
Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration
Ampicillin 100 mg/ml in 50 % EtOH 100 µg/ml Chloramphenicol 34 mg/ml in EtOH 34 µg/ml
Kanamycin 50 mg/ml in H2O 50 µg/ml
2.1.10. Säulen und Säulenmaterialien
Säule/Material Hersteller
Chelating SepharoseTM Fast Flow GE Healthcare, Solingen
Fractogel® EMD SO3‾ Merck, Darmstadt
GSTrapTM HP GE Healthcare, Solingen
HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 75 pg GE Healthcare, Solingen
HisTrapTM HP GE Healthcare, Solingen
HiTrapTM CaptoTM S GE Healthcare, Solingen
Kieselgel-60 Macherey-Nagel, Düren
Leersäulen Carl Roth, Karlsruhe
Mini Bio-Spin® Säulen Bio-Rad, München
2.1.11. Geräte
Gerät Typ Hersteller
Autoklav Varioklav 75S HP Medizintechnik, Oberschleißheim
Brutschrank TH 30 Edmund Bühler, Hechingen
SM-30 Edmund Bühler, Hechingen
Chromatographieanlage ÄKTAprime plus GE Healthcare, Solingen ÄKTA Pure GE Healthcare, Solingen
BioLogic LP Bio-Rad, München
Elektrophoresekammer Compact M System Biometra, Göttingen Mini-Protean 3 Cell Bio-Rad, München
Fluoreszenzspektrometer F-7000 Hitachi, Krefeld
Gefriertrocknungseinheit ALPHA 1-4 LSC Martin Christ Gefriertrocknungsanl. GmbH, Osterode
Geldokumentation Odyssey® SA Infrared LI-COR Biosciences, Bad Homburg Imaging System
E-BOX CX5 TS VWR, Darmstadt Kalorimeter MicroCal PEAQ-ITC Malvern, Herrenberg
Kultivierungskolben Ultra Yield, 2500 ml Thomson Instrument Company, Oceanside, CA, USA
Küvette μCuvette G 1.0 Eppendorf, Hamburg
Langmuir-Trog KSV NIMA KN 2001 Biolin Scientific, Göteborg, SWE MTP-Reader MultiskanTM FC Thermo Fisher Scientific, Dreieich
POLARstar® Optima BMG Labtech, Ortenberg
Multipette Stream Eppendorf, Hamburg
nanoDSF-Gerät Prometheus NT.48 Nanotemper Technologies, München pH-Elektrode BlueLine 28 pH SI Analytics, Mainz
Photospektrometer BioSpectrometer® basic Eppendorf, Hamburg
Pipetten Research Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe Pipetus®-Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Reinstwasseraufbereitung PURELAB flex ELGA LabWater, Celle
Schikanekolben 50 ml, 100 ml, 2000 ml Glasgerätebau Ochs, Bovenden
Spektropolarimeter J-1500 JASCO, Pfungstadt
Sterilwerkbank Safe 2020 Thermo Fisher Scientific, Langenselbold Thermoblock ThermoMixer® comfort Eppendorf, Hamburg
Thermocycler T Gradient Biometra, Göttingen
Ultraschallstab Digital Sonifier 25C Branson Ultrasonics Corp., Danbury
Vortex Schüttler D-6012 neoLab, Heidelberg
Waagen Adventurer Feinwaage Ohaus, Nänikon, CH
Explorer Analysenwaage Ohaus, Nänikon, CH Western-Blot-Apparatur Trans-Blot® TurboTM Bio-Rad, München
Transfer System
Zentrifugen 3K30C Sigma, Taufkirchen
6-16K Sigma, Taufkirchen
1-15K Sigma, Taufkirchen
2.1.12. Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung Hersteller
Blottingfilterpapier Bio-Rad, München
Dialyseschlauch (3500 MWCO) Serva, Heidelberg
Flaschenaufsatzfilter 0,2 µm Thermo Fisher Scientific, Dreieich Konzentrator Vivaspin® (10.000 MWCO) Sartorius, Göttingen
Amicon® (3000 MWCO) Merck, Darmstadt
Küvetten Sarstedt, Nümbrecht
Mikrotiterplatte 96-Well Flat-Bottom Half Area Greiner Bio-One, Frickenhausen
Nitrocellulose-Membran GE Healthcare, Solingen
Nunc-ImmunoTM Module MaxiSorp TM Thermo Fisher Scientific, Dreieich
PD-10 Entsalzungssäule GE Healthcare, Solingen
Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen 10 µl, 200 µl, 1000 µl, 5000 µl Sarstedt, Nümbrecht
PVDF-Membran Merck, Darmstadt
Reaktionsgefäße 0,3 ml, 1,5 ml, 2 ml Sarstedt, Nümbrecht
Röhrchen, 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen
Serologische Pipetten 5 ml, 25 ml Sarstedt, Nümbrecht
Spritzen 5ml ,10 ml, 20 ml B. Braun, Melsungen
2.2. Molekularbiologische Methoden
2.2.1. Plasmidisolierung
Einzelne Klone transformierter E. coli XL1-Blue-Zellen wurden gepickt und in Kulturröhrchen mit 5 ml LB-Medium und passendem Antibiotikum ü. N. bei 37 °C und 180 rpm inkubiert. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit dem peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I nach Angaben des Herstellers.
2.2.2. Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentration der DNA wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Dazu wurden 2,5 µl Probe in eine Mikrolitermesszelle pipettiert, und die Absorption wurde bei 260 nm und 280 nm am BioSpectrometer® basic gemessen. Der Quotient A260/A280 ist ein Maß für die Reinheit der DNA-Probe und sollte einen Wert von 1,8-2,0 aufweisen. Niedrigere Werte deuten auf Verunreinigungen durch Proteine hin.
2.2.3. Polymerasekettenreaktion
Die Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente erfolgte mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Primer mit Erkennungssequenzen für die erforderlichen Restriktionsenzyme und Plasmid-DNA als Matrize wurden verwendet. Die PCR wurde mit dem folgenden Pipettierschema und Thermocycler-Programm durchgeführt (Tabelle 1,Tabelle 2).
Tabelle 1: Zusammensetzung einer PCR
Bestandteil Volumen Endkonzentration
Nuklease-freies Wasser 33 µl 5x Phusion HF / Q5-Puffer 10 µl 1x 10 mM dNTPs 1 µl 200 µM 10 µM forward primer 2,5 µl 0,5 µM 10 µM reverse primer 2,5 µl 0,5 µM Template DNA 0,5 µl < 250 ng
Tabelle 2: Thermocycler-Programm
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
I Initiale Denaturierung 98 °C 30 s 1 II Denaturierung Annealing Elongation 98 °C 54-72 °C 72 °C 10 s 30 s 30 s 35
III Finale Elongation 72 °C 2-5 min 1
IV Aufbewahrung 4 °C ∞
Zur Identifizierung positiver E. coli-Transformanten nach der Klonierung wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Hierfür wurde eine Einzelkolonie als Matrize für die Reaktion und die Taq-DNA-Polymerase verwendet.
Ortsgerichtete Mutagenese durch overlap extension PCR
Die Einführung von Punktmutationen in ein Gen erfolgte mittels overlap extension PCR [111]. Dazu wurde das Zielgen in zwei Fragmenten durch separate PCR amplifiziert. Jede Reaktion enthielt einen äußeren, an einem Ende des Zielgens hybridisierenden Primer und einen inneren Primer, der an der zu mutierenden Sequenz hybridisierte und die Mutation trug. Durch die Verwendung von inneren, sich überlappenden Primern konnten die zwei Fragmente in einer dritten PCR zusammengeführt werden. Durch Zugabe der äußeren Primer wurde das mutierte Gen amplifiziert.
2.2.4. Agarose-Gelelektrophorese
Für die Analyse und Reinigung der PCR-Produkte oder nach Behandlung von DNA mit Restriktionsenzymen wurden die DNA-Fragmente anhand ihrer Größe durch Gelelektrophorese getrennt. Zur Detektion der DNA wurde den 1,5 %-Agarose-Gelen der Farbstoff Midori Green hinzugefügt. Die DNA-Proben wurden mit 6x-Auftragspuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Zur Größenbestimmung der Fragmente wurden zusätzlich 5 µl 1kb GeneRulerTM DNA-Leiter als Größenstandard aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte in TAE-Puffer für 30 min bei 120 V. Anschließend wurden die Gelbanden unter UV-Licht analysiert oder ausgeschnitten und mit dem
FastGene® Gel/PCR Extraction Kit nach Angaben des Herstellers gereinigt.
2.2.5. Enzymatische Restriktionshydrolyse
Restriktionsenzyme hydrolysieren DNA an bestimmten Erkennungssequenzen, wodurch spezifische DNA-Enden erzeugt werden. Dadurch entstehen für die Ligation kompatible Enden am PCR-Produkt und linearisierten Plasmid. In jeweils 50 µl Reaktionsansätzen wurden ungefähr 3 µg Plasmid-DNA bzw. das gereinigte PCR-Produkt mit den entsprechenden Restriktionsenzymen nach Herstellerangaben für 3 h
bei 37 °C inkubiert. Die Reinigung der Fragmente erfolgte über eine präparative Agarose-Gelelektrophorese.
2.2.6. Ligation
Nach dem enzymatischen Restriktionsverdau wurden für die Ligation in einem 10 µl Ansatz 50 ng Plasmid-DNA mit dem 6-fachen molaren Überschuss an PCR-Produkt und 1 µl T4 DNA-Ligase nach Herstellerangaben ü. N. bei 16 °C inkubiert.
2.2.7. Herstellung chemisch kompetenter
E. coli
-Zellen
Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgte mit der CaCl2-Methode [112]. Die Vorbehandlung der Zellen mit CaCl2 führt zu einer erhöhten Permeabilität der Zellmembran, wodurch die Aufnahme von Fremd-DNA gesteigert wird. Dazu wurden 250 ml TYM-Medium mit einer 5 ml E. coli-Vorkultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5-0,6 bei 37 °C und 100 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 15 min bei 4 °C und 2.000xg zentrifugiert und das Zellsediment in 50 ml kaltem TfB1-Puffer resuspendiert. Nach dem erneuten Zentrifugieren wurden die Zellen in 15 ml kaltem TfB2-Puffer resuspendiert, zu je 50 µl aliquotiert und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Zellen erfolgte bei -80 °C.
2.2.8. Hitzeschock-Transformation
Chemisch kompetente E. coli-Zellen wurden mit 1 µl Plasmid-DNA bzw. 5 µl Ligationsansatz versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock für 30 s bei 42 °C im Wasserbad. Nach 5 min Abkühlen auf Eis wurden 250 µl SOC-Medium zugegeben und die Zellen zur Regeneration für 1 h bei 37 °C und 1100 rpm kultiviert. Von diesem Ansatz wurden 50 µl auf LB-Agar-Platten mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und ü. N. bei 37 °C inkubiert.
2.2.9. DNA-Sequenzierung
Um die geklonten Plasmide auf ihre Korrektheit zu überprüfen, erfolgte deren Sequenzierung durch den
Sequencing Service der LMU München nach dem Protokoll „Cycle, Clean & Run (BigDye v3.1)“. Dazu wurden 7 µl mit ungefähr 150 ng Plasmid-DNA und 3,2 pmol Sequenzierungsprimer in 10 mM Tris-HCl pH 8,5 vorbereitet.
2.3. Mikrobiologische Methoden
2.3.1. Herstellung einer
Streptomyces
-Sporensuspension
Die Sporensuspension wurde mit einer dicht bewachsenen Streptomyces-Plattenkultur nach dem Protokoll von Kieser et al. (2000) hergestellt [113]. Dazu wurden ungefähr 9 ml steriles Wasser auf die
