Diskussion

4.1. Das lange Chaplin 1 als Metallbindeprotein

Die hydrophobe Oberfläche der Lufthyphen und Sporen von Streptomyceten wird durch die amphiphilen Proteine Chapline und Rodline gebildet [33]. Chapline werden anhand ihrer Größe in kurze und lange Chapline eingeteilt. Letztere besitzen ein C-terminales cell wall sorting signal, wodurch sie mittels Sortasen im Peptidoglycan verankert werden [45]. Aufgrund dessen werden lange Chapline, im Gegensatz zu den kurzen Chaplinen und Rodlinen, nicht mittels SDS und TFA aus den Zellwänden extrahiert [30]. Bisherige Untersuchungen zur Proteincharakterisierung beziehen sich daher nur auf die kurzen Chapline, welche sich zusätzlich aufgrund ihrer Größe von ungefähr 50 Aminosäuren für die Peptidsynthese eignen [31, 44, 126]. Um die erstmalige Charakterisierung eines langen Chaplins zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit das lange Chaplin von S. mobaraensis, Sm-Chp1, rekombinant in E. coli produziert. Im Vergleich mit anderen Streptomyceten besitzt S. mobaraensis nur ein langes Chaplin, welches als Besonderheit neben den charakteristischen Chaplin-Domänen Histidin-reiche Segmente beinhaltet. Bereits bei der Reinigung zeigten sich Unterschiede zwischen Sm-Chp1 und dem langen Chaplin C aus S. coelicolor (Sc-ChpC), welches als Vergleichsprotein ebenfalls rekombinant in E.

coli hergestellt wurde. Im Gegensatz zu Sc-ChpC besitzt Sm-Chp1 eine hohe Affinität zu Schwermetallen.

Dies wurde auf die Histidin-reichen Domänen (HRD) zurückgeführt, welche nicht bei Sc-ChpC vorkommen. Die bioinformatische Analyse der HRD von Sm-Chp1 zeigte eine geringe Sequenzhomologie mit den Histidin-reichen Regionen charakterisierter Metallbindeproteine, jedoch diente der Vergleich mit bisher uncharakterisierten Proteinen, welche putative Metallbindungseigenschaften besitzen, als Hinweis auf eine Funktion von Sm-Chp1 als Metallakquisitions- und -translokationsprotein. In vitro bindet Sm-Chp1 Metalle wie Ni²⁺, Cu²⁺ und Zn²⁺, aber kein Mg²⁺ und Ca²⁺. Durch UV-Vis- und ITC-Messungen wurden sieben bis acht Bindestellen von Sm-Chp1 für Ni²⁺ und Zn²⁺ mit Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich ermittelt. Multiple Bindestellen und ähnlich geringe Affinitäten wurden für andere Histidin-reiche, Ni^2+-bindende Proteine bestimmt, die als Metallspeicher oder akzessorische Proteine fungieren [141]. Für Sm-Chp1 muss jedoch beachtet werden, dass es in Lösung eine ungeordnete Struktur aufweist, welche sich an der Luft/Wasser-Grenzfläche ändert. Sm-Chp1 besitzt die Fähigkeit über die Chaplin-Domänen eine Amyloid-ähnliche -Faltblatt-reiche Struktur einzunehmen, wie es bereits für kurze Chapline aus S. coelicolor gezeigt wurde [44]. Die amyloide Fibrillenbildung kann dabei durch die Bindung von Metallionen sowohl negativ als auch positiv beeinflusst werden [139]. Für Sm-Chp1 war in Gegenwart eines Überschusses an Ni²⁺ keine Konformationsänderung zu einer ThT-bindenden -Faltblatt-Struktur zu erkennen; vielmehr führte der Überschuss zur Präzipitation des Proteins. Wie für das Amyloid- (A) gezeigt wurde, ist jedoch die Konzentration und Art des Metallions von Bedeutung [147]. Während bei substöchiometrischen

Konzentrationen an Cu²⁺ die Fibrillenbildung von A beschleunigt wird, führen hohe Konzentrationen zur Ausbildung amorpher Aggregate. Des Weiteren inhibiert Zn²⁺ im Gegensatz zu Cu²⁺ die Fibrillenbildung von A [147]. Das Experiment sowie die Analyse der Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie sollte daher mit geringeren Metallkonzentrationen wiederholt werden, zumal die ITC-Messungen eine geordnete Struktur von Sm-Chp1 in Anwesenheit von Ni²⁺ implizieren.

Potentielle Empfänger der Sm-Chp1-erworbenen Metalle könnten neben extrazellulären Metalloenzymen, wie bspw. die Zn²⁺-abhängige Transglutaminase aktivierende Metalloprotease, die konservierte Nickel-Superoxid-Dismutase (UniProt-ID: M3CVF6) als auch [Fe/Ni]-Hydrogenasen (UniProt-ID: M3A274) oder Ureasen (UniProt-ID: M3B0F7, M3A2S3, M3BIL8) sein, für die Gene im Genom von S. mobaraensis zu finden sind [56, 94, 148]. Weiterhin sind Gene für Metalltransporter wie bspw. den ABC-Transporter für Nickel-Ionen (UniProt-ID: M3ATS9, M2ZWA2, M3BBS3, M3BZ06, M3BZ83) enthalten, der ebenfalls bei S. coelicolor identifiziert wurde [56, 149]. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Sm-Chp1 Metallbindungseigenschaften mit einer Affinität für Übergangsmetalle besitzt und möglicherweise als Translokase fungiert, um Metalle aus der Umgebung in die Zellwand zu transportieren (Abbildung 41).

Abbildung 41: Hypothetisches Modell der Organisation von Sm-Chp1 als Metallbindeprotein an der Zellwandoberfläche.

Assemblierte kurze Chapline sind als Chp, die Chaplin-Domänen sind als CHD und die Histidin-reichen Domänen von Sm-Chp1 als HRD abgekürzt. Der N- und C-Terminus sind durch blaue und rote Kreise gekennzeichnet. Publiziert in Anderl et al. (2019) [122].

4.2. Chaplin 1 als Transglutaminase-Substrat

Transglutaminase vernetzt Proteine unter der Ausbildung einer Isopeptidbindung zwischen Glutamin- und Lysinresten [81]. Anhand der Kristallstruktur des Enzyms im Komplex mit einem inhibitorischen Pseudosubstrat wurde für die Transglutaminase aus S. mobaraensis (MTG) ein Modell für den Vernetzungsmechanismus abgeleitet, welches eine Selbst-Assemblierung der Substratproteine und eine Reißverschluss-artige Vernetzung nahe legt [110]. Ähnliches wurde kürzlich für die intrazelluläre Transglutaminase aus Bacillus subtilis beschrieben, welche vorassemblierte Proteinkomplexe der Sporenhülle durch Vernetzung verstärkt [150]. Weiterhin wurde für die bisher untersuchten, intrinsischen MTG-Substrate von S. mobaraensis gezeigt, dass sich die ermittelten Glutaminbindestellen gruppiert in einer flexiblen Region oder am N-Terminus befinden, was auf eine ortsgerichtete Vernetzungsweise durch die MTG hindeutet [107, 109, 151]. Dies führte zu der Hypothese, dass die Substratproteine zusammen mit den Chaplinen und Rodlinen während der Lufthyphenbildung assemblieren und anschließend durch die MTG zu einer stabilen Hülle vernetzt werden [108]. Für S.

hygroscopicus wurde eine Beteiligung der MTG an der Lufthyphenbildung durch Deletionsmutanten gezeigt [88].

Im Zuge dessen wurde in dieser Arbeit die Interaktion der MTG mit dem langen Chaplin Sm-Chp1 und dem Rodlin Rdl1 untersucht. Beide Proteine besitzen Glutaminbindestellen für die MTG, wobei Sm-Chp1 ein vielfach besseres Glutaminsubstrat ist als alle bisher untersuchten intrinsischen Substrate von S. mobaraensis, wie z. B. das Dispaseautolyse-induzierende Protein (DAIP) [107]. Unter den in der Literatur beschriebenen Bedingungen wurde Sm-Chp1 unmittelbar nach Zugabe des Enzyms modifiziert.

Erst bei Erniedrigung des Enzym-Substrat-Verhältnis um zwei Größenordnungen konnte der Einbau von Biotinylcadaverin zeitlich verfolgt werden. DAIP wird jedoch unter diesen Bedingungen kaum noch markiert. Ähnliches gilt für Rdl1, das, bei halbierter Molmasse, ähnliche viele Glutamine wie Sm-Chp1 und keine geordnete Struktur besitzt. Wie für die kurzen Chapline von S. coelicolor beschrieben, befindet sich Sm-Chp1 in Lösung in einem überwiegend ungeordneten Zustand, was mittels CD-Spektroskopie nachgewiesen wurde [30, 44]. Flexible und ungeordnete Bereiche werden von der MTG bevorzugt modifiziert, auch wenn die besonderen Glutamindonoreigenschaften des langen Chaplins von S. mobaraensis nicht nur darauf zurückzuführen sein dürfte [102]. Dennoch ist bei einem flexiblen Molekül die Zugänglichkeit weitgehend von den benachbarten Aminosäuren des Glutamins abhängig.

Der Austausch einzelner Glutamine gegen Asparagin mittels ortsgerichteter Mutagenese zeigte, dass Glutamine innerhalb der Chaplin-Domänen modifiziert wurden, welche in gefalteter Form von Sm-Chp1 nicht zugänglich sein sollten. In vivo nimmt Sm-Chp1 vermutlich seine funktionale, amyloide Struktur während der Selbstassemblierung der Rodlet-Schicht ein. Nichtsdestotrotz sollte das Sortase-verankerte Sm-Chp1 potentiell für die MTG zugänglich sein, da sich zwischen den zwei Chaplin-Domänen und zwischen der zweiten Chaplin-Domäne und dem Sortaseerkennungsmotiv noch flexible Segmente mit

Glutaminresten befinden. Innerhalb dieser zwei Regionen ist mindestens ein Glutamin, welches als

„Andockstation“ für andere Proteine oder primäre Amine fungieren könnte. Durch die Biotinylierungsexperimente mit Sm-Chp1 in Lösung konnte das Glutamin Gln96 in der flexiblen Region zwischen den Chaplin-Domänen bereits ausgeschlossen werden, während das Glutaminpaar Gln255/Gln256 in dem zweiten Segment aber außerhalb der Histidin-reichen Region als eine bevorzugte Glutaminbindestelle identifiziert werden konnte. Vermutlich können beide mutmaßlichen MTG-Bindestellen auch nicht durch Metallionen, die durch Komplexierung die Histidin-reichen Domäne strukturieren, inaktiviert werden.

Um Sm-Chp1 in seiner gefalteten Form zu untersuchen, wurden erste Versuch unternommen, über druckinduzierte Selbst-Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche im Langmuir-Trog die natürliche Faltung zu simulieren. Nach dem Transfer der Sm-Chp1-Filme auf eine hydrophobe Membran erfolgte die MTG-vermittelte Biotinylierung. Der Vergleich mit Glutamin-defizienten Varianten von Sm-Chp1 zeigte jedoch keinen eindeutigen Unterschied in der Markierung und ließ keine Rückschlüsse auf die bevorzugten Bindestellen von MTG zu. Ursachen dafür könnten bspw. ein ineffektiver Filmtransfer oder Unterschiede in der Proteinkonformation sein. Hier sind weitere Experimente notwendig, die die Filmübertragung auf stabile Unterlagen wie die verwendete PVDF-Membran ohne Änderung der komprimierten Proteinschicht erlauben.

An der Luft/Wasser-Grenzfläche bildet Sm-Chp1 stabile Proteinfilme, wie durch die geringe Hysterese nach vier Kompressions-Expansions-Zyklen gezeigt wurde. Ähnlich Hysterese-Effekte wurden für die Hydrophobine HFBI und HFBII von Trichoderma reesei und für das Biofilm-Protein BslA von Bacillus subtilis beobachtet, welche ebenfalls elastische und robuste Schichten ausbilden [129, 152]. Um zu bestätigen, dass Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche gefaltet vorliegt, könnte mittels Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie die Untersuchung der Konformationsänderungen im Proteinfilm auf dem Langmuir-Trog untersucht werden [153]. Für das Hydrophobin HGFI von Grifola frondosa wurde bereits gezeigt, dass eine Strukturänderung mittels Kompression auf einem Langmuir-Trog induziert werden kann [130]. Während nach einer Kompression jedoch noch keine ausgeprägte Struktur von HGFI zu beobachten war, führten erst mehrere Kompressions-Zyklen zu einer dichtgepackten Rodlet-Schicht, wie durch Rasterkraft-Mikroskopie von Langmuir-Schäfer- und Langmuir-Blodgett-Filmen nachgewiesen wurde. Möglicherweise ist auch dies der Fall für Sm-Chp1 und muss in zukünftigen Experimenten überprüft werden.

Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und etablierten Methoden bilden eine Grundlage für weitere Experimente. Somit können mit den hier produzierten Proteinen Sm-Chp1 und Sm-Rdl1 die Interaktion zwischen den beiden Proteinklassen untersucht werden. Des Weiteren erlauben die

Grenzflächeneigenschaften von Sm-Chp1 die Beschichtung von Oberflächen, welche zudem aufgrund der Sm-Chp1-Bindestellen durch Sortasen oder MTG modifiziert werden können.

Weiterhin könnten die komprimierten Protein-Filme dazu genutzt werden, um als sogenannte nanotemplates die Kristallisation von Sm-Chp1 zu unterstützen [154, 155]. Die Langmuir-Blodgett nanotemplate Methode basiert auf der Idee einer ab-initio geordneten Proteinschicht, die eine Kristallisation auslösen und erhöhen kann, wodurch die Strukuraufklärung einiger Proteine gelang, die nicht mittels klassischer Methoden wie hanging drop kristallisierbar waren [154].

4.3. Der N-Terminus verleiht der Sortase E2 Stabilität

Die meisten Gram-positiven Bakterien nutzen Sortase-Enzyme zur Modifizierung ihrer Zelloberfläche [60]. Diese werden basierend auf ihrer Sequenz in die Klassen A-F eingeteilt. Streptomyceten besitzen housekeeping-Sortasen der Klasse E, welche Proteine mit dem nicht-kanonischen Erkennungsmotiv LAXTG in der Zellwand verankern und bisher noch wenig untersucht sind [67]. Im Modellorganismus S. coelicolor sind die zwei Klasse E Enzyme, Sc-SrtE1 und Sc-SrtE2, an der Sporenentwicklung beteiligt, wie durch Deletionsmutanten gezeigt wurde [45]. Sie verankern die langen Chapline Sc-ChpA-C, welche den Übergang von Substrat- zu Luftmycel fördern. In vitro hydrolysieren sie Peptide mit den Motiven LAETG, LAHTG und weniger effizient LPETG [45, 74]. Über Produktion, Reinheit und Stabilität der Enzyme sind nur wenige Informationen verfügbar. Die Kristallisation der Sc-SrtE1 wurde jedoch als herausfordernd beschrieben, da das Protein bei geringen Konzentrationen von ungefähr 7 mg/ml nach wenigen Tagen bei 4 °C präzipitierte [74]. In dieser Arbeit wurde die SrtE2 aus S. mobaraensis rekombinant in E. coli produziert und biochemisch charakterisiert. Wie bereits für andere Sortasen beschrieben, wurde der N-terminale Membrananker für die Löslichkeit des Enzyms entfernt. Die Δ^1-50 Sm-SrtE2 wies eine geringe Stabilität auf und entfaltete bereits bei niedrigen Temperaturen von ungefähr 37 °C. Wie für Sc-SrtE1 gezeigt, präzipitierte das Enzym, besonders leicht bei einer Proteinkonzentration von 6 mg/ml. Der Schmelzpunkt der Sa-SrtA ist mit 57 °C deutlich höher als der Schmelzpunkt der Δ^1-50Sm-SrtE2, wobei dieser zusätzlich durch Calcium-Ionen sogar noch auf ungefähr 61 °C erhöht wird [156]. Die N-terminale Einkürzung um weitere Aminosäuren bis zu der katalytischen Domäne der Sm-SrtE2 resultierte in noch weniger stabilen Varianten. Der N-terminale Membrananker scheint somit die strukturelle Integrität der Sm-SrtE2 stark zu beeinflussen. Sekretierte Proteine aus S. mobaraensis, wie z. B. MTG und MTG-Substrate, tolerieren normalerweise Temperaturen von 50-80 °C und Ethanolzusätze von bis zu 80 Vol% [92, 103, 108]. Trotz der beschriebenen Probleme war die Proteinausbeute für eine initiale Charakterisierung der Δ^1-50Sm-SrtE2 ausreichend. Die Aktivität sowie kinetische Parameter wurden mittels FRET-Pentapeptiden der Struktur dabLAXTGans bestimmt. Bei Verwendung dieser Peptide ist jedoch zu beachten, dass bei hohen Konzentrationen innere Filter- bzw.

quenching-Effekte auftreten, was zu einer Unterschätzung der kinetischen Parameter führt [157]. Für

Sa-SrtA und abzLPETGdnp bspw. variieren die Werte für Km von 8,2 µM zu 5,5 mM und für kcat von 0,54 h^-1 zu 972 h^-1, abhängig davon, ob der Fluoreszenzanstieg oder HPLC-Peakflächen ausgewertet wurden [144, 157, 158]. In dieser Arbeit wurden ebenfalls quenching-Effekte bei vollständiger Spaltung von 10-40 µM dabLAXTGans beobachtet. Die hier ermittelten kinetischen Parameter ermöglichen somit keinen Vergleich mit anderen Sortase-Klassen. Nichtsdestotrotz war 1 µM Enzym ausreichend, um innerhalb von 10 min einen deutlichen Fluoreszenzanstieg zu messen. Im Vergleich dazu wurde die SrtB aus Clostridium difficile in der 10-fachen Menge verwendet und bis zu 13 h inkubiert, um die Enzymaktivität zu bestimmen [159]. Analog zu Sc-SrtE1 und Sc-SrtE2 diente LAXTG als Erkennungsmotiv für Δ^1-50Sm-SrtE2, wobei Glutamat in der variablen Position drei auf Peptidebene bevorzugt wurde. Das intrinsische Substratprotein Sm-Chp1, welches das Motiv LAHTG beinhaltet, wurde jedoch deutlich schneller mit Gly3-TAMRA konjugiert als das Protein Sc-ChpC mit dem Motiv LAETG und zeigt, dass umliegende Aminosäuren der Sortase-Bindestelle sowie Proteinkonformation die Transpeptidierungsrate beeinflussen. Für die Sav-SrtE3 wurde ebenfalls gezeigt, dass der Austausch von Alanin gegen Lysin oder Glutamat die Transpeptidierungsreaktion negativ beeinflusst, wohingegen die Sa-SrtA an dieser Position Alanin und Lysin gleichermaßen akzeptiert [73, 160]. Bei der Pilus-Assemblierung von Lactobacillus rhamnosus bestimmen die nachfolgenden Aminosäuren des LPXTG-Motivs die Substratspezifität für Pilin- und housekeeping Sortasen und scheinen somit eine regulatorische Funktion in vivo einzunehmen [161]. Allgemein weisen die bisher untersuchten Sortasen eine geringe Enzymaktivität in vitro auf. In vivo erhöht möglicherweise der Membrananker und die Einbettung von Sortase und Substrat in die Membran die katalytische Aktivität. Andere unbekannte Faktoren können hinzukommen, die das aktive Zentrum in einen mehr geeigneten ionisierten Zustand überführen [66].

Die enzymatische Biotinylierung der verkürzten Δ^1-50Sm-SrtE2 zeigte, dass diese Glutaminbindestellen für die MTG besitzt. Zunächst wurde das Gln129 als reaktives Glutamin aufgrund der Positionierung in einer flexiblen loop-Region und der flankierenden Aminosäuren vermutet. Im Gegensatz dazu sind Gln62, Gln65 und Gln176 von geladenen Aminosäuren umgeben, die den Zugang der MTG behindern sollten. Der Austausch von Gln129 durch Asparagin führte jedoch zu keiner Reduzierung, sondern zu einer Erhöhung der Biotinylierungsrate. Tatsächlich wurden Gln62 und Gln65 am artifiziellen Terminus als Bindestellen für die MTG identifiziert. Dies deutet auf einen flexiblen, unstrukturierten N-Terminus hin, wie er auch für die Sc-SrtE1 beschrieben wurde, der keine Strukturanalyse zuließ [74].

Der Zugang der MTG zu diesen Glutaminen ist vermutlich ein Resultat der Proteineinkürzung und somit physiologisch ohne Bedeutung. Durch die N-terminale Verankerung der Sm-SrtE2 in der Membran sollte es der MTG in vivo nicht möglich sein, diese zu modifizieren.