Proteinanalytische Methoden

Nach ungefähr 5 min Inkubation erfolgte die Entfärbung des Gels mit der Entfärbelösung und 10 % (v/v) Essigsäure. Für die Geldokumentation wurde das Odyssey^® SA Infrared Imaging System verwendet.

Alternativ wurde zur Visualisierung von Proteinen die Silber-Färbung nach Tabelle 4 in Anlehung an Blum et al. (1987) durchgeführt [116]. Die Geldokumentation erfolgte an der E-BOX CX5 TS.

Tabelle 4: Silberfärbung

Färbeschritt Lösung Zeit

Fixieren (100 ml) Ethanol/ Essigsäure/ H2O 50:12:38 (v/v/v)

Mind. 1 h oder ü.N.

Waschen (3x 60 ml) Ethanol/ H2O 50:50 (v/v)

3x 20 min

Vorbehandeln (250 ml) 0,1 g Na2S2O3 in 250 ml H2O 1 min

Waschen H2O 3x

Imprägnieren (100 ml) 0,2 g AgNO3 mit 50 µl 37 % Formaldehyd in 100 ml H2O

20 min

Waschen H2O 3x

Entwickeln (100 ml) 6 g Na2CO3 mit 50 µl 37 % CH2 O-Lösung in 100 ml H2O

Bis zur gewünschten Farbintensität

Ansäuern (100 ml) Ethanol/ Essigsäure/ H2O 50:12:38 (v/v/v)

2 min

Aufbewahren des Gels H2O

2.5.3. Western Blot

Der Western Blot diente zur spezifischen Identifizierung von Proteinen mittels Antikörper. Nach Trennung der Proteine durch die SDS-PAGE wurden diese auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran transferiert. Dazu wurde die PVDF-(PVDF)-Membran für 10 s in Methanol aktiviert. Nach Äquilibrieren der Membran, zweier Filterpapiere und des Gels in Transferpuffer wurde der Semi-Dry Blot wie folgt, von unten nach oben, in einem Trans-Blot^® Turbo^TM Transfer System aufgebaut: Filterpapier, Membran, Gel, Filterpapier. Der Proteintransfer auf die Membran erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 12 V für 60 min. Anschließend wurden die Proteine immunchemisch gefärbt. Dazu wurde die Membran für 5 min in PBST gewaschen und für 60 min in Odyssey^® Blocking Buffer inkubiert, um freie Bindestellen abzusättigen. Nach dem zweimaligen Waschen mit PBST für jeweils 5 min wurde die Membran mit dem Erstantikörper Anti-His pAB Rabbit IgG (1:5000 in PBST) für 60 min bei RT inkubiert. Nach drei weiteren Waschritten mit PBST für jeweils 5 min erfolgte die Inkubation mit dem Farbstoff-gekoppelten Zweitantikörper IRDye^® 800CW Goat anti-rabbit IgG (1: 20 000 in PBST) für 60 min bei RT. Die Membran

wurde dreimal mit PBST und zweimal mit PBS für je 5 min gewaschen. Anschließend erfolgte die Detektion des Farbstoffs bei 800 nm (λexc = 785 nm) am Odyssey^® SA Infrared Imaging System.

2.5.4. Biotinylierung von Proteinen mittels Transglutaminase

Die Identifikation von Transglutaminase-Substraten erfolgte durch den Enzym-vermittelten Einbau von Monobiotinylcadaverin (MBC) in ein Protein über reaktive Glutaminreste. Dazu wurde 5-15 µM Zielprotein mit Transglutaminase in einem molaren Verhältnis von 50:1 bis 5000:1 und 0,2 M MBC für bis zu 20 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Denaturierung der Proben in auf 95 °C erhitztem SDS-Auftragspuffer für 10 min bei 95 °C abgebrochen. Für die Analyse der Reaktionsansätze wurde eine SDS-PAGE mit anschließendem Proteintransfer auf eine PVDF-Membran, wie in Abschnitt 2.5.3 beschrieben, durchgeführt. Die Färbung der biotinylierten Proben erfolgte durch Verwendung des Streptavidin-Farbstoffkonjugats IRDye^® 800CW Streptavidin (1:30 000 in PBST). Nach der Detektion bei 800 nm (λexc = 785 nm) am Odyssey^® SA Infrared Imaging System, wurde für die semi-quantitative Analyse des Biotinylierungsgrades die Fluoreszenzintensität der Proteinbanden über gleichgroße Flächen integriert und mit der Odyssey^® SA Software (Version 1.1.7) ausgewertet.

2.5.5. Biotinylierung von Sporen mittels Transglutaminase

Für die Herstellung von biotinylierten Streptomyces-Sporen wurden 200 µl einer Sporensuspension mit 0,1 M MBC bzw. Biotinyl-TVQQEL-OH und 0,2 µM MTG ü. N. bei 20 °C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS, wurden die Sporen in Odyssey Blocking Buffer für eine Stunde bei RT inkubiert, gefolgt von mehreren Waschschritten mit PBS. Um ein Enzym auf die biotinylierten Sporen zu immobilisieren, wurden diese mit einem Streptavidin--Galactosidase-Konjugat (1:500 in PBS) versetzt. Der Nachweis der Immobilisierung erfolgte nach wiederholten Waschschritten mit PBS durch die Durchführung eines

-Galactosidase-Aktivitätstests. Alternativ wurden die biotinylierten Sporen auf einer PVDF-Membran transferiert und, wie in Abschnitt 2.5.4 beschrieben, mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat (1:30 000 in PBS) detektiert.

2.5.6. Kontinuierlicher Aktivitätstest für Sortasen

Für die Messung der Sortase-Aktivität dienten FRET Pentapeptide der Struktur Dabcyl-LAXTG-Edans (dabLAXTGans, X=E, H, N, Q, R) als Substrat. Das Sortase-Erkennungsmotiv LAXTG wurde N-terminal mit dem Löschfarbstoff Dimethylaminoazobenzolcarboxyl (Dabcyl) und C-terminal mit dem Fluorophor Ethylendiaminonaphthalinsulfonsäure (Edans) konjugiert. Die Hydrolyse des Peptids zwischen Threonin und Glycin mittels Sortase führt zur Freisetzung des Fluorophors G-Edans und zu einer Fluoreszenzzunahme bei 520 nm (λ^exc= 340 nm). Für die Messung in Mikrotiterplatten wurden 1 µM Sm-SrtE2 mit 10-320 µM Substrat in 150 µl 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl und 10 % Glycerol

bei 30 °C inkubiert. Der Fluoreszenzanstieg wurde kontinuierlich bei 520 nm (λ^exc= 340 nm) mit dem POLARstar^® Optima detektiert und die Steigung ermittelt. Zur Bestimmung der kinetischen Parameter wurden die Messwerte mit GraphPad Prism ausgewertet. Die vom Fluoreszenzspektrometer ausgegebenen RFU (relative fluorescence units) wurden über eine Kalibriergerade mit synthetisiertem G-EDANS in µM umgerechnet. Alternativ erfolgte die Umrechnung von RFU in µM durch die vollständige Hydrolyse definierter Substratmengen.

Die Aktivitätsmessung mit dem Substrat abzLAHTGdnp erfolgte in einer Acryl-Küvette mit 1 cm Schichtdicke in einem Wellenlängenbereich von 350-500 nm (λ^exc= 320 nm) am F-7000.

2.5.7. Fluoreszenzmarkierung von Proteinen mittels Sortase

Die Identifikation von Sortase-Substraten erfolgte durch den Enzym-vermittelten Einbau von Gly3 -TAMRA in ein Protein über das Erkennungsmotiv LAXTG. Dazu wurden 10 µM Protein mit 50 µM Gly3 -TAMRA und 1 µM Sm-SrtE2 in 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl und 10 % Glycerol bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Denaturierung der Proben in auf 95 °C erhitztem SDS-Auftragspuffer für 10 min bei 95 °C abgebrochen. Die Analyse der Proben erfolgte mittels SDS-PAGE und anschließender Detektion bei 312 nm an der E-BOX CX5 TS.

2.5.8. Schmelzpunktbestimmung mittels intrinsischer Fluoreszenz

Um die Stabilität von Proteinen zu untersuchen, wurden die Schmelzpunkte über Differential Scanning Fluorimetry (DSF) am Prometheus NT.48 der AG Fessner bestimmt. Dazu wurden 0,2 mg/ml Protein von 20 °C auf 95 °C mit einer Heizrate von 1 °C/min erhitzt, und die Tryptophan-Fluoreszenzintensität wurde bei 330 nm und 350 nm aufgenommen. Das Verhältnis FI350 nm/FI330 nm als Maß für die Entfaltung des Proteins wurde gegen die Temperatur aufgetragen, und der Schmelzpunkt wurde durch die erste Ableitung der Funktion bestimmt.

2.5.9. Circulardichroismus-Spektroskopie

Die Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) diente zur Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen. Die gereinigten Proteine wurden durch PD-10 Entsalzungssäulen in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 überführt und auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml eingestellt.

Spektren wurden in einer Quartzküvette mit 0,1 cm Schichtdicke in einem Wellenlängenbereich von 190 nm bis 280 nm an einem JASCO J-1500 CD-Spektrometer aufgenommen. Jede Probe wurde fünfmal gemessen und mit dem CD-Spektrum des Puffers die Basislinie korrigiert.

2.5.10. Thioflavin T-Assay

Zur Detektion amyloider Fibrillen wurde der Thioflavin T (ThT)-Assay angewandt [117]. Bei Bindung an -Faltblatt-reiche, amyloide Fibrillen ändert der gelbe Farbstoff ThT sein Fluoreszenzemissionsmaximum von 438 nm (λexc = 350 nm) zu 482 nm (λexc = 450 nm) [118]. Dazu wurden 10 µM Protein mit 20 µM ThT bei 25 °C und 700 rpm im ThermoMixer^® inkubiert.

Fluoreszenzspektren wurden in einer Acryl-Küvette mit 1 cm Schichtdicke in einem Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm (λexc = 450 nm) am Fluoreszenzspektrometer F-7000 aufgenommen.

2.5.11. UV-Vis-Titration

Die Bindung von Metallionen an ein Protein wurde durch Änderungen im UV-Absorptionsspektrum mittels Titration untersucht. Dazu wurden 2,5-15 molare Äquivalente NiCl2 zu 34 µM Protein in 25 mM HEPES pH 7,5 und 100 mM NaCl bei RT titriert. Nach 30 min Äquilibrierung wurden die Absorptionsspektren in einer Quartzküvette mit 1 cm Schichtdicke in einem Wellenlängenbereich von 230 nm bis 600 nm an einem JASCO V-630 Spektrometer aufgenommen.

2.5.12. Trübungsmessung

Um die Metall-induzierte Proteinaggregation zu detektieren, wurde die Trübung der Proteinlösung bei einer Absorption von 340 nm gemessen [119]. Dazu wurden jeweils 10 µM Protein mit verschiedenen NiCl2-Konzentrationen in 25 mM HEPES pH 8,0, 100 mM NaCl inkubiert. Die kontinuierliche Absorptions-messung bei 340 nm wurde am Multiskan^TM FC bei 25 °C durchgeführt.

2.5.13. Isothermale Titrationskalorimetrie

Für die Untersuchung von Metall-Protein-Interaktionen und deren thermodynamischen Beschreibung wurde die isothermale Titrationskalorimetrie verwendet. Dabei wird die Wärmeaufnahme- oder abgabe gemessen, die durch Titration der Metalllösung zu dem Protein in der Probenzelle entsteht. Die Herstellung der 2 mM Metalllösungen erfolgte mit demselben Puffer in dem das Protein vorlag (25 mM HEPES pH 7,0 und 100 mM NaCl). Für die Messung am MicroCal PEAQ-ITC Kalorimeter wurden 200 µl einer 22 µM Proteinlösung in die Probenzelle vorgelegt und bei 25 °C und 750 rpm inkubiert. Nach einer initialen Injektion der Metalllösung von 0,4 µl folgten 18 Injektionen à 2 µl mit einer Injektionsdauer von 4 s. Der Abstand zwischen den Injektionen betrug 150 s. Als Kontrolle wurde die Titration von Metall in Puffer ohne Protein durchgeführt und von den Daten abgezogen. Die Auswertung erfolgte mit der MicroCal PEAQ-ITC Control Software 1.1.0.

2.5.14. Massenspektroskopie

Die Proteinsequenzanalyse von Sm-Chp1 und Sc-ChpC sowie die Peptidanalyse der Hydrolyse Produkte durch Sm-SrtE2 wurden am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) von M. Muth durchgeführt.

2.5.15. N-terminale Sequenzierung und MALDI-TOF

Für die Bestimmung des N-Terminus sowie des Molekulargewichtes von Sm-Chp1 und Sm-Rdl1 wurden die Proteine mittels SDS-PAGE gereinigt. Die Analytik wurde am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig von Dr. Scrima und Dr. Schmelz durchgeführt.