Interaktion von Chaplin 1 und Rodlin 1 mit Transglutaminase

Abbildung 21: Stabilität des Proteinfilms von Sm-Chp1. A) Π/A-Isothermen von 4,9 mg/m² Sm-Chp1 mit unterschiedlichen Kompressionsraten. B) Relaxation nach Kompression zu unterschiedlichen Π (10 mN/m, 20 mN/m, 35 mN/m). C, D) Kompression-Expansion des Proteinfilms bei niedrigem Π (10 mN/m) (C) und hohem Π (35 mN/m) mit vier Zyklen und einer Rate von 5 mm/min.

(Sm-ebenfalls nach 5 min durch die MTG markiert, höhere Oligomere waren jedoch erst nach 60 min sichtbar.

Als ein deutlich schlechteres Glutaminsubstrat erwies sich SPI, welcher erst ü. N. biotinyliert wurde.

Abbildung 22: MTG-vermittelte Biotinylierung von Sm-Rdl1 im Vergleich mit bekannten MTG-Substraten. A) Die Inkubation von 15 µM Protein erfolgte mit 0,3 µM MTG, 200 µM MBC in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl bei 37 °C. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen, mittels 12,5 % SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membran übertragen.

Die Visualisierung und Analyse erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat. Als Kontrolle C1 diente der Reaktionsansatz ü. N. ohne MTG. Für die Größenzuordnung wurde eine Molekulargewichtsmarkermischung (M) mitgeführt.

B) Für die Berechnung der relativen Biotinylierung wurden die Fluoreszenzintensitäten auf die Kontrolle C2 (DAIP nach 60 min) normiert.

Im Gegensatz dazu erfolgte die enzymatische Biotinylierung von Sm-Chp1 unmittelbar nach Zugabe der MTG, sodass die 0 min Probe bereits eine stark markierte Bande aufwies (nicht gezeigt). Nachdem das E/S-Verhältnis um den Faktor 100 auf 1:5000 reduziert wurde, konnte die Biotinylierung über die Zeit verfolgt werden (Abbildung 23A). Nach 5 min erfolgte die Modifizierung des Sm-Chp1 durch die MTG und nach 30 min wurde eine Sm-Chp1-Dimer Bande um die 70 kDa sichtbar. Nach Reaktion ü. N. sind die Polymerisation zu höheren Molekülmassen und die intramolekulare Vernetzung durch schneller wandernde Sm-Chp1-Banden deutlich zu erkennen. Als Vergleich wurden Sm-Rdl1, DAIP und SPI mitgeführt, welche allerdings bei diesem E/S-Verhältnis nicht mehr ausreichend biotinyliert wurden (Abbildung 23B). Die sehr gute Markierbarkeit von Sm-Chp1 in Lösung wurde auf die in Abschnitt 3.1.3 gezeigte ungeordnete Proteinstruktur und die damit verbundene uneingeschränkte Zugänglichkeit der Glutamine für die MTG zurückgeführt. In diesem Fall sind nur die flankierenden Aminosäuren am jeweiligen Glutamin von Bedeutung, was auch die erheblich langsamere Biotinylierung von Sm-Rdl1, das ebenfalls eine ungeordnete Struktur und ungefähr die gleiche Menge an Glutaminresten besitzt, nachdrücklich belegt.

Abbildung 23: MTG-vermittelte Biotinylierung von Sm-Chp1 im Vergleich mit bekannten MTG-Substraten. A) Die Inkubation von 15 µM Protein erfolgte mit 3 nM MTG, 200 µM MBC in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl bei 37 °C. SDS-PAGE, Blot und Analyse erfolgte wie in Abbildung 20 beschrieben. Als Kontrolle C1 diente der Reaktionsansatz ü. N. ohne MTG. Für die Größenzuordnung wurde eine Molekulargewichtsmarkermischung (M) mitgeführt. B) Für die Berechnung der relativen Biotinylierung wurden die Fluoreszenzintensitäten auf die Kontrolle C2 (DAIP nach 60 min) normiert.

Um die Zugänglichkeit von MTG im geordneten Zustand von Sm-Chp1 zu untersuchen, wurde eine Strukturänderung des Oberflächenproteins mit dem Langmuir-Trog simuliert. Da Chapline an der Luft/Wasser-Grenzfläche ihre Struktur ändern und in Abschnitt 3.1.4 über Π/A-Isothermen die Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche bereits nachgewiesen wurde, sollte mit Hilfe des Langmuir-Troges und seiner beweglichen, druckerzeugenden Barrieren die Proteinfaltung induziert werden.

Um für die Identifizierung einzelner MTG-Bindestellen geeignete Glutamin-Austauschvarianten von Sm-Chp1 zu generieren, wurde zunächst die Primärstruktur analysiert (Abbildung 24). Wie einleitend beschrieben, besitzt Sm-Chp1 ohne Signalpeptid neun Glutamine. Zwei davon, Gln299 und Gln300, befinden sich mutmaßlich durch ihre Lage hinter drei Argininresten in vivo mit dem C-Terminus im Cytosol und werden nach der Prozessierung durch die Sortase entfernt, wodurch sie nicht als MTG-Bindestelle zur Verfügung stehen können. Zwei weitere in Streptomyceten konservierte Glutamine, Gln49 und Gln128, sind in den starren Chaplin-Domänen positioniert, welche nach Selbst- oder druckinduzierte Assemblierung des Proteins nicht mehr für die MTG zugänglich sein sollten (Abbildung 15). Ein weiteres Glutamin, Gln33, befindet sich in der Nähe der ersten Chaplin-Domäne und ist ebenfalls in kurzen Chaplinen von S. coelicolor konserviert. Das Glutamin Gln96 liegt, umgeben von Histidinen, in der flexiblen Region zwischen den beiden Chaplin-Domänen. Die restlichen Glutamine befinden sich in der Nähe des Sortaseerkennungsmotivs in einer kleinen hydrophilen Region, die für eine Orientierung zum Peptidoglycan spricht (Abbildung 24). Das Gln265 befindet sich dabei in unmittelbarer Nähe des LAHTG-Motivs neben einem Pentapeptid geladener Aminosäuren und fungiert daher sehr wahrscheinlich nicht als Bindestelle für die MTG.

Abbildung 24: Hydrophobizitäts-Diagramm mit Glutamin-, Cystein- und LAHTG-Positionen von Sm-Chp1. Das Hydrophobizitäts-Diagramm wurde nach der Methode von Kyte und Doolittle (1982) erstellt [134].

Aufgrund dessen wurde Sm-Chp1 zunächst C-seitig um die Aminosäuren QQG eingekürzt (^Δ299-301 Sm-Chp1) und Punktmutationen mittels OE-PCR eingeführt, wobei die Glutamine Gln96, Gln255/256 als wahrscheinlichste MTG-Bindestellen gegen Asparagin ausgetauscht wurden. Als Vergleichsprotein wurde das lange Chaplin aus S. coelicolor mitgeführt, welches in Lösung ebenfalls eine ungeordnete Struktur einnimmt. Sc-ChpC besitzt vier Glutamine, wovon das Gln49 in der ersten Chaplin-Domäne und Gln80 in unmittelbarer Nähe davon positioniert ist. Die zwei weiteren Glutamine Gln214 und Gln218 befinden sich in der Nähe des Sortaseerkennungsmotivs, wobei letzteres von geladenen Aminosäuren flankiert wird. Folglich wurden Gln80 und Gln214 gegen Asparagin ausgetauscht.

Die MTG-vermittelte Biotinylierung der langen Chapline und deren Varianten erfolgte zunächst mit den Proteinen in Lösung. Die C-terminale Einkürzung hatte keinen Einfluss auf die Biotinylierungsrate, da für ^Δ299-301Sm-Chp1 nach 5 min eine ähnlich intensive Bande zu erkennen war wie für Sm-Chp1/Wildtypprotein (Abbildung 25A). Der zusätzliche Austausch von Gln255 (^Δ299-301Q255N), Gln256 (^Δ299-301Q256N) bzw. beider Glutamine (^Δ299-301Q255N/Q256N) resultierte in einer deutlich verzögerten Biotinylierungsrate, was auf eine Bevorzugung beider Reste durch MTG auch im ungeordneten Zustand hindeutete. Im Vergleich zu der Variante ^Δ299-301Q255N/Q256N hatte der weitere Austausch von Gln96 (^Δ299-301Q255N/Q256N/Q96N) keinen Einfluss auf die Biotinylierungsrate, wodurch Gln96 als MTG-Bindestelle ausgeschlossen werden konnte.

Im Vergleich zu Sm-Chp1 war Sc-ChpC ein deutlich schlechteres Glutaminsubstrat für die MTG (Abbildung 25B). Erst nach Reaktion ü. N. wurde eine deutlich markierte Bande sichtbar. Der Austausch von Gln214 (Q214N) führte zu einer reduzierten Biotinylierung, während Gln80 als MTG-Bindestelle

ausgeschlossen werden konnte, da kein weiterer Einfluss auf die Markierung für Q80N/Q214N beobachtet wurde.

Abbildung 25: MTG-vermittelte Biotinylierung der langen Chapline. Die Inkubation von 5 µM Sm-Chp1-Varianten (A) bzw. Sc -ChpC-Varianten (B) erfolgte mit 0,1 nM MTG, 200 µM MBC in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl bei 37 °C. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen, mittels 12,5 % SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membran geblottet.

Die Visualisierung und Analyse erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat. Für die Berechnung der relativen Biotinylierung wurden die Fluoreszenzintensitäten auf die Kontrolle C1 (Sm-Chp1 nach 1 h) normiert. Als Kontrolle C2 diente der Reaktionsansatz ü. N. ohne MTG. Die Messungen erfolgten in Doppel- und Dreifachbestimmung.

Nichtsdestotrotz erfolgte für alle Varianten eine Modifizierung durch die MTG, was auf die verbliebenen Glutamine in den Chaplin-Domänen zurückgeführt wurde. In weiteren Versuchen sollten nun durch die Verwendung des Langmuir-Trogs eine Konformationsänderung von Sm-Chp1 induziert werden. Dazu wurde Sm-Chp1 auf die Wasser-Subphase im Langmuir-Trog appliziert und auf einen Oberflächendruck von 25 mN/m komprimiert, welcher anschließend konstant gehalten wurde (Abbildung 26). Wie in Abschnitt 3.1.4 (Abbildung 18B) gezeigt wurde, befand sich Sm-Chp1 bei diesem Oberflächendruck in einem geordneten Zustand. Anschließend wurde der Proteinfilm mittels der Langmuir-Schäfer-Methode von der Oberfläche auf eine hydrophobe PVDF-Membran transferiert, sodass die hydrophile Seite des Films exponiert sein sollte. Anschließend erfolgte die MTG-vermittelte Markierung der Proteinfilme mit

MBC. In einem Vorversuch wurde die Methode mit Sm-Chp1 und dessen Variante

Δ299-301Q255N/Q256N/Q96N getestet.

Der jeweilige Proteinfilm wurde mit 5 mg/m² Protein hergestellt. Nach dem Filmtransfer erfolgte die Inkubation der Membranen in einer 48-Well-Platte mit 0,5 µM MTG und 200 µM MBC bei RT. Nach einer Stunde wurde die MTG-Lösung entfernt und die Membranen dreimal mit PBST gewaschen. Die Detektion erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat. Als Vergleich wurde ein Dot Blot mit den jeweiligen Proteinen durchgeführt. In beiden Fällen zeigte Sm-Chp1 eine Markierung im Gegensatz zu der Variante ^Δ299-301Q255N/Q256N/Q96N, was auf eine mögliche Strukturänderung des Proteins und der damit reduzierten Zugänglichkeit der Glutamine in den Chaplin-Domänen hindeutete.

Abbildung 26: Methode zur MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1. A) Für die Herstellung von Proteinfilmen erfolgte die Kompression zu einem Oberflächendruck von 25 mN/m von Sm-Chp1 in einem Langmuir-Trog. Nach Filmtransfer über die Langmuir-Schäfer (LS)-Methode auf eine PVDF-Membran erfolgte die Biotinylierung durch Inkubation mit 0,5 µM MTG und 200 µM MBC in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl (PDB 1IU4).B) MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1-Varianten. Als Vergleich wurde ein Proteintropfen auf die PVDF-Membran pipettiert und anschließend biotinyliert (Dot Blot). Die Visualisierung erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat.

Des Weiteren wurde die Konzentration an MTG und MBC variiert. Geringe Konzentrationen waren ausreichend, um eine Markierung zu erzielen, weshalb für weitere Versuche 10 nM MTG und 50 µM MBC verwendet wurden (Abbildung 27A). Um die Reproduzierbarkeit der oben gezeigten Ergebnisse zu überprüfen, wurde die Methode für Sm-Chp1, ^Δ299-301Q255N/Q256N und ^Δ299-301Q255N/Q256N/Q96N wiederholt. Hier zeigte sich jedoch für alle Varianten eine Markierung (Abbildung 27B).

Abbildung 27: MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1.Die Herstellung komprimierter Proteinfilme von Sm-Chp1 erfolgte mit einem Langmuir-Trog. Nach Filmtransfer über die Langmuir-Schäfer (LS)-Methode erfolgte die MTG vermittelte Biotinylierung in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl. A) Variation von Enzym- und Monobiotinylcadaverin-Konzentration (MBC). B) MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1 Varianten durch Inkubation mit 10 nM MTG und 50 µM MBC. Die Visualisierung erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat.

Ursachen dafür könnten Änderungen in der Proteinkonformation sein, die auf dem Trog oder durch bzw.

nach dem Filmtransfer auf der Membran entstehen. Um Artefakte auszuschließen, sollte für weitere Versuche die transferierten Proteinfilme zunächst mittels spezifischer Antikörper gefärbt werden. Im Rahmen dieser Arbeit war es jedoch nicht mehr möglich, dies zu überprüfen oder die Methode zu optimieren.

Neben der Untersuchung der Transglutaminase-Substrateigenschaften einzelner Oberflächenproteine von S. mobaraensis wie Sm-Chp1 und Sm-Rdl1, wurden des Weiteren Sporen auf zugängliche Glutamin- und Lysinreste überprüft, um mögliche Enzym-Sporenimmobilisate durch Kopplung von Enzymen herzustellen. Dazu wurden unterschiedliche Sporensuspensionen mit 10³-10⁶ Sporen mit 0,1 µM MBC bzw. Biotinyl-TVQQEL-OH und 0,2 µM MTG ü.N. bei RT inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die auf einer PVDF-Membran immobilisierten Sporen mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat detektiert (Abbildung 28A). Interessanterweise zeigte sich, dass die Sporen für die MTG zugängliche Glutamine, jedoch keine Lysine besitzen, was eine selektive Kopplung mit Lysindonorenzymen erlaubt. Über die Biotinylierung war es zudem möglich durch die Verwendung von Streptavidin-Enzym-Konjugaten, Enzyme an die Oberfläche von Sporen zu koppeln. Dies konnte für ein Streptavidin--Galactosidase-Konjugat gezeigt werden, wobei hier ebenfalls eine Biotinylierung von Lysinen an der Oberfläche der Sporen erkennbar wurde (Abbildung 28B).

Abbildung 28: MTG-vermittelte Biotinylierung von S. mobaraensis-Sporen. A) Drei verschiedene Sporensuspensionen wurden mit 0,2 µM MTG und 200 µM MBC bzw. Biotinyl-TVQQEL ü. N. bei RT inkubiert und anschließend auf einer PVDF-Membran immobilisiert. Die Detekion erfolgte mit dem IRDye^® 800CW Streptavidin-Konjugat. B) Nach der Biotinylierung erfolgte die Inkubation mit einem Streptavidin--Galactosidase-Konjugat. Die Aktivität wurde mittels dem o-Nitrophenyl--D-galactopyranosid-Test über Messung der Absorption bei 420 nm nachgewiesen. Die Messungen erfolgten Dreifachbestimmung.