Zusätzliche Abbildungen

Abbildung 43: Massenspektrometrische Sequenzanalyse von Sc-ChpC nach tryptischem In-Gel-Verdau.Coomassie-gefärbtes Protein (markiert mit *, links Gelausschnitt von TAMRA-markiertem ChpC durch ∆^1-50Sm-SrtE2) wurde aus einem 12,5 % Polyacrylamid-Gel geschnitten, mit Trypsin behandelt und über HPLC getrennt (links). Analyse von 39 Peptiden (A, obere Bande) bzw. 33 Peptiden (B, untere Bande) mit einer Konfidenz von ≥ 95 % ergab eine Sequenzabdeckung von 68 % bzw. 66 %.

Aminosäuren mit einer Konf. von ≥ 95 %, 95 %> bis ≥ 50 %, < 50 % sind in grün, gelb und rot dargestellt. MS/MS-Spektren (rechts) der Peptide mit Sortase-Erkennungsmotiv. De novo-Sequenzierung bestätigt die Existenz des LAETG-Motivs. Publiziert in Anderl et al. (2019) [123]. C) Auszug der Liste von identifizierten Peptiden nach Trypsin-Verdau. Die Datenanalyse erfolgte mit ProteinPilot 5.0.1. Die Messung und Analyse wurde von M. Muth am KIT durchgeführt.

Abbildung 44: N-terminale Sequenzierung von Sm-Rdl1 Links ist die Proteinsequenz von Sm-Rdl1 dargestellt. Die Aminosäuren SD am N-terminus resultieren aus der tag-Abspaltung durch die TEV-Protease. Die Messung wurde am HZI Braunschweig von S.

Schmelz durchgeführt.

Abbildung 45: MALDI-TOF von Sm-Rdl1. Die theoretische Molekülmasse von Sm-Rdl1 beträgt 11,597 kDa. Die Messung wurde am HZI Braunschweig von S. Schmelz durchgeführt.

Abbildung 46: Einfluss von Ni²⁺ auf die Aggregation von Sc-ChpC.Die Absorption von bei 10 µM Sc-ChpC wurde nach Zugabe von NiCl2 in den angegebenen Konzentrationen bei 340 nm verfolgt.

Abbildung 47: Isothermale Titrationskalorimetrie von Sm-Chp1 mit MgCl2.Die Titration erfolgte mit 2 µl-Injektionen von 2 mM MgCl2 zu 22 µM Sm-Chp1 in 25 mM HEPES pH 7,0 und 100 mM NaCl bei 25 °C.Publiziert in Anderl et al. (2019) [122].

Abbildung 48: Massenspektren von dabLAETGans (A) und den Hydrolyseprodukten dabLAET (B) und Gans (C) nach Inkubation mit Δ^1-50Sm-SrtE2. Publiziert in Anderl et al. (2019) [123].

Abbildung 49: Fluoreszenz von gespaltenen Pentapeptiden dabLAXTGans (A)im Vergleich zu Gly-Edans (B).Die Inkubation der Pentapeptide in den angegebenen Konzentrationen erfolgte mit 1 µM Δ^1-50Sm-SrtE2 in 50 mM Tris-HCl pH 7, 100 mM NaCl, 10 % Glycerol, 5 mM Gly3 ü. N. bei RT. Adaptiert nach Anderl et al. (2019) [123].

Abbildung 50: Einfluss von Acylakzeptoren auf die Aktivität von ∆^1-50Sm-SrtE2 mit abzLAHTGdnp. Die Inkubation von 2,5 µM

∆^1-50Sm-SrtE2, 50 µM abzLAHTGdnp und 5 mM Acylakzeptor erfolgte in 0,1 M Natriumphosphat pH 7 und 10 % Glycerol ü. N.

bei RT. Die Aktivität in Anwesenheit von Gly3 wurde als 100 % definiert.

6.2. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Lebenszyklus von Streptomyceten. ... 2

Abbildung 2: Die Funktion der Chapline und Rodline bei der Lufthyphenbildung in Streptomyces coelicolor. .... 4

Abbildung 3: Struktur und Mechanismus der Sortase A von Staphylococcus aureus. ... 7

Abbildung 4: Reaktionen katalysiert durch Transglutaminase. ... 9

Abbildung 5: Struktur und Mechanismus der Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis. ... 11

Abbildung 6: Struktur der Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis im Komplex mit IP2. ... 13

Abbildung 7: Langmuir Monolayer von Stearinsäure. ... 36

Abbildung 8: Expressionsvektor für die rekombinante Produktion des Sm-Chp1 in E. coli. ... 38

Abbildung 9: Expressionsvektor für die rekombinante Produktion des Sm-Rdl1 in E. coli. ... 39

Abbildung 10: Reinigung von Sm-Chp1. ... 41

Abbildung 11: Reinigung von Sc-ChpC. ... 42

Abbildung 12: Reinigung von Sm-Rdl1. ... 43

Abbildung 13: Reinigung von Sm-Chp3. ... 44

Abbildung 14: SDS-PAGE und ThT-Fluoreszenz von einem TFA-Extrakt von S. mobaraensis Lufthyphen und Sporen. ... 45

Abbildung 15: Proteinsequenz von Sm-Chp1 und agitationsinduzierte Konformationsänderung. ... 46

Abbildung 16: Proteinsequenz von Sm-Rdl1 und agitationsinduzierte Konformationsänderung. ... 47

Abbildung 17: Oberflächendruck/Trogflächen-Isothermen für Proteine von S. mobaraensis... 48

Abbildung 18: Kompressionsmodul/Oberflächendruck-Kurven für Sm-Rdl1, Sm-Chp1 und SSTI. ... 49

Abbildung 19: Änderung der Oberflächenspannung von Wasser durch Zugabe von Sm-Rdl1 und Sm-Chp1. .... 50

Abbildung 20: Stabilität des Proteinfilms von Sm-Rdl1. ... 51

Abbildung 21: Stabilität des Proteinfilms von Sm-Chp1. ... 52

Abbildung 22: MTG-vermittelte Biotinylierung von Sm-Rdl1 im Vergleich mit bekannten MTG-Substraten. ... 53

Abbildung 23: MTG-vermittelte Biotinylierung von Sm-Chp1 im Vergleich mit bekannten MTG-Substraten. .... 54

Abbildung 24: Hydrophobizitäts-Diagramm mit Glutamin-, Cystein- und LAHTG-Positionen von Sm-Chp1. ... 55

Abbildung 25: MTG-vermittelte Biotinylierung der langen Chapline. ... 56

Abbildung 26: Methode zur MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1. ... 57

Abbildung 27: MTG-vermittelte Biotinylierung von LS-Filmen von Sm-Chp1. ... 57

Abbildung 28: MTG-vermittelte Biotinylierung von S. mobaraensis-Sporen. ... 58

Abbildung 29: Domänenstruktur von Sm-Chp1. ... 60

Abbildung 30: Paarweiser Sequenzvergleich von Sm-Chp1 mit Histidin-reichen Segmenten charakterisierter Metallbinde-Proteine. ... 61

Abbildung 31: Affinität von Sm-Chp1 für immobilisierte Metalle und Einfluss von Ni²⁺ auf die Proteinaggregation. ... 63

Abbildung 32: Isothermale Titrationskalorimetrie von Sm-Chp1 mit Metallen. ... 64

Abbildung 33: Organisation der Genregion um Sortasen der Klasse E bei Streptomyceten... 65

Abbildung 34: Expressionsvektor für die rekombinante Produktion der ∆^1-50Sm-SrtE2 in E. coli. ... 67

Abbildung 35: Reinigung der ∆^1-50Sm-SrtE2. ... 68

Abbildung 36: Modellierte Tertiärstruktur der ∆^1-50Sm-SrtE2 und SDS-PAGE gereinigter Varianten. ... 69

Abbildung 37: Aktivität und Spezifität der ∆^1-50Sm-SrtE2. ... 70

Abbildung 38: Einfluss von pH und Metallionen auf die Aktivität von ∆^1-50Sm-SrtE2. ... 71

Abbildung 39: Δ^1-50Sm-SrtE2-vermittelte Markierung der langen Chapline mit fluoreszierendem Gly3-TAMRA. 72 Abbildung 40: MTG-vermittelte Biotinylierung von Sm-SrtE2-Varianten. ... 74

Abbildung 41: Hypothetisches Modell der Organisation von Sm-Chp1 als Metallbindeprotein an der Zellwandoberfläche. ... 76

Abbildung 42: Massenspektrometrische Sequenzanalyse von Sm-Chp1 nach tryptischem In-Gel-Verdau. ... 91

Abbildung 43: Massenspektrometrische Sequenzanalyse von Sc-ChpC nach tryptischem In-Gel-Verdau. ... 92

Abbildung 44: N-terminale Sequenzierung von Sm-Rdl1 ... 93

Abbildung 45: MALDI-TOF von Sm-Rdl1. ... 93

Abbildung 46: Einfluss von Ni²⁺ auf die Aggregation von Sc-ChpC. ... 93

Abbildung 47: Isothermale Titrationskalorimetrie von Sm-Chp1 mit MgCl2. ... 94

Abbildung 48: Massenspektren von dabLAETGans (A) und den Hydrolyseprodukten dabLAET (B) und Gans (C) nach Inkubation mit Δ^1-50Sm-SrtE2. ... 94

Abbildung 49: Fluoreszenz von gespaltenen Pentapeptiden dabLAXTGans (A)im Vergleich zu Gly-Edans (B). 94 Abbildung 50: Einfluss von Acylakzeptoren auf die Aktivität von ∆^1-50Sm-SrtE2 mit abzLAHTGdnp. ... 95

6.3. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Zusammensetzung einer PCR ... 24

Tabelle 2: Thermocycler-Programm ... 25

Tabelle 3: Zusammensetzung eines Polyacrylamidgels ... 30

Tabelle 4: Silberfärbung ... 31

Tabelle 5: Auszug der Liste der putativen Substrate der Klasse E-Sortasen von Streptomyces mobaraensis. .... 66

Tabelle 6: Kinetische Parameter der ∆^1-50Sm-SrtE2 bestimmt durch den Fluoreszenzaktivitätstest mit dabLAXTGans^a). ... 71

6.4. Abkürzungsverzeichnis

Abz 2-Aminobenzoyl

Ans Edans (Ethylendiaminonaphthalinsulfonsäure) APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Aminosäure

AU absorbance units BCA Bicinchoninsäure Boc tert-Butyloxycarbonyl

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin Bspw. Beispielsweise

Chp Chaplin

d Tag

Da Dalton

Dab Dabcyl (Dimethylaminoazobenzolcarboxyl) DAIP Dispaseautolyse-induzierendes Protein DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure Dnp 2,4-Dinitrophenol

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FRET Försterresonanz-Energietransfer g relative Zentrifugalbeschleunigung

Gl. Gleichung

GPC Gel-Permeations-Chromatographie GST Glutathion-S-Transferase

h Stunde

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure His-tag Polyhistidin-tag

HPLC high performance liquid chromatography

IMAC Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ITC Isothermale Titrationskalorimetrie Kd Dissoziationskonstante

Kb Kilobase

kDa Kilodalton

KIC Kationenaustauschchromatographie LS Langmuir-Schäfer

mAU Milliabsorptionseinheiten MBC Monobiotinylcadaverin MTG Mikrobielle Transglutaminase MWCO molecular weight cut off

ns Nanosekunde

OD Optische Dichte OE overlap extension

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PDB ID Proteindatenbank-Identifikationscode PVDF Polyvinylidenfluorid

Rdl Rodlin

RFU relative fluorescence unit rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese SPI Streptomyces-Papain-Inhibitor

SSI Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor

SSTI Streptomyces-Subtilisin- und TAMP-Inhibitor SUMO Small Ubiquitin-related Modifier

TAMP Transglutaminase-aktivierende Metalloprotease TFA Trifluoressigsäure

TEV Tobacco Etch Virus

TEMED Tetramethylethylendiamin

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Units

Ü. N. über Nacht UV Ultraviolett

v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen

WT Wildtyp

z Ladung

λ Wellenlänge

Im Dokument Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten Streptomyces mobaraensis (Seite 99-108)