Die Funktionen der Homologen Rekombination und
die Bedeutung der S-Phase Schadensantwort in
humanen Zelllinien des Triple-negativen
Mammakarzinoms
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
des Fachbereichs Biologie,
der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der Universität Hamburg
vorgelegt von
Felix Meyer
aus Hamburg
1. Gutachterin: Prof. Dr. Kerstin Borgmann 2. Gutachter: Prof. Dr. Wilhelm Schäfer Tag der Disputation: 27.09.2019
Die Dissertation wurde zwischen März 2015 und März 2019 im Labor für Strahlenbiologie und Experimentelle Radioonkologie unter Anleitung von Prof. Dr. Kerstin Borgmann angefertigt.
Zusammenfassung
Das Mammakarzinom umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren, von denen 15-25 % dem Triple-negativen Subtyp zugerechnet werden. Patientinnen mit Triple-negativem Mammakarzinom (TNBC) haben eine schlechte Prognose und die starke Heterogenität sowie das Fehlen von Hormonrezeptoren lassen wenig Spielraum für gezielte Therapieansätze. TNBCs zeichnen sich durch einen Defekt im DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg Homologe Rekombination (HR) und einen erhöhten Anteil von Tumorstammzellen aus. Die HR ist der bedeutendste DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg der S-Phase und ein HR-Defekt kann sich auf mehrere Aufgaben der HR auswirken: die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) mit zwei offenen Enden (zwei-endig), die Reparatur von DSBs mit einem offenen Ende (ein-endig) und die Stabilisierung geöffneter Replikationsgabeln.
Das Ziel dieser Arbeit war zu klären I) wie sich der HR-Defekt im TNBC auf die einzelnen Funktionen der HR auswirkt, II) Welche Bedeutung die DNA-Schadensantwort der S-Phase (S-Phase Schadenantwort) in TNBCs hat und III) ob sich der Anteil von Tumorstammzellen auf die Therapieresistenz auswirkt. Diese Fragestellungen wurden in einem isogenen Zellsystem, bestehend aus drei TNBC-Zelllinien, überprüft. Als Vergleichszelllinie wurde eine HR-profiziente, luminale Zelllinie eingesetzt.
I) Die TNBC-Zelllinien zeigten im Vergleich zur luminalen Zelllinie eine deutlich höhere Expression des HR-Proteins RAD51 und des zentralen Proteins der S-Phase Schadensantwort, CHK1 (Checkpoint-Kinase 1). Bei der Analyse der Reparaturkapazität durch HR (HR-Kapazität), zeigten die TNBC-Zelllinien im Vergleich zur HR-profizienten Zelllinie eine ausgesprochen geringe HR-Kapazität, was die eingeschränkte Funktionalität der HR in den TNBC-Zelllinien bestätigte. Weder die eingeschränkte Funktionalität der HR noch die erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 hatten Auswirkungen auf die Stabilisierung von Replikationsgabeln, noch zeigten sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Camptothecin oder Olaparib, die ein-endige Doppelstrangbrüche (DSBs) induzieren. Auch auf die Empfindlichkeit gegen Mitomycin C (MMC) hatte dies keinen Einfluss. Zwei der TNBC-Zelllinien waren ausgesprochen resistent, eine TNBC-Zelllinie und die luminale Zelllinie waren empfindlich. Die MMC-Empfindlichkeit war nicht auf eine verringerte Akkumulation von RAD51-Foci zurückzuführen, sondern auf die Akkumulation replikationsassoziierter DNA-Schäden. Insgesamt zeigte sich, dass das zelluläre Überleben nach Induktion S-Phase assoziierter DNA-Schäden weniger von der HR, sondern von der S-Phase Schadensantwort abhing. Ihre Funktionalität wurde mittels Detektion einzelsträngiger DNA (ssDNA) der Formation von RPA (Replikationsprotein A)- Foci, Analyse der Signalkaskade der S-Phase Schadensantwort, Replikationsprozessen und Inhibition von CHK1 nach MMC-Schädigung im Folgenden überprüft.
II) Bei der Überprüfung der Funktionalität der S-Phase Schadensantwort zeigten die MMC-empfindlichen Zelllinien eine ausgeprägte Akkumulation von RPA-Foci im Nukleus. Dies konnte auf eine insuffiziente Phosphorylierung von CHK1 zurückgeführt werden. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die verringerte Phosphorylierung von CHK1 zu einem erhöhten Anhalten- und zu einer ausgeprägten Degradation von Replikationsgabeln unter Schädigung führte, wie durch Analyse im DNA-Fiber Assay beobachtet wurde. Die MMC-resistenten Zelllinien mit ausgeprägter Aktivierung von CHK1 zeigten, trotz MMC-Schädigung,
keine auffälligen Replikationsstrukturen oder eine verlangsamte Elongation. Die Abhängigkeit dieser Prozesse von CHK1 konnte durch Inhibition von CHK1 bestätigt werden und führte in den MMC-resistenten Zelllinien ebenfalls zu einer Degradation von Replikationsgabeln. Dies konnte darauf zurückgeführt werden, dass CHK1 an der Replikationsgabel die Aktivität der Nukleasen MRE11 und Mus81/Eme1 reguliert. Die unbeeinträchtigte Elongation der MMC-resistenten Zelllinien konnte auf die CHK1-abhängige Aktivierung die Transläsionssynthese (TLS) zurückgeführt werden. In Übereinstimmung dazu führte die Inhibition von CHK1 in den MMC-resistenten Zelllinien zu einem Anstieg von Zellen mit kernweitem γH2AX-Signal und einer signifikanten Sensibilisierung gegen MMC.
III) Die TNBC-Zelllinien zeigten, anders als die luminale Vergleichszelllinie, ein Expressionsmuster, wie es für stammzellartige Mammakarzinomzellen dokumentiert ist. In Übereinstimmung dazu konnte durch ALDH1-Aktivitätsmessung der hohe Anteil von Tumorstammzellen in den TNBC-Zelllinien bestätigt werden. Interessanterweise zeigte das eingesetzte Zellsystem eine klare Assoziation zwischen RAD51 und CHK1-Expression und Tumorstammzellanteil. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten korrelierte der hohe Anteil von Tumorstammzellen nicht mit der Strahlen- oder Chemoresistenz, obwohl in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten die Expression des Stammzellmarkers ZEB1 (Zinc finger E-box-binding
homeobox 1) signifikant mit der Expression von CHK1 korrelierte. Um den Zusammenhang
zwischen Strahlenresistenz und Stammzellphänotyp näher zu untersuchen wurden durch hypofraktionierte Bestrahlung radioresistente Klone hergestellt, die eine deutliche Zunahme der Strahlenresistenz zeigten, was auf eine Zunahme der Tumorstammzellpopulation hindeutete.
Zusammenfassend konnte in der Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass eine hohe Expression von RAD51 und CHK1 in einem isogenen- und nicht gentechnisch veränderten Zellsystem keinen Einfluss auf die Kapazität hatte. Zudem konnte bei der Analyse der HR-Funktionen gezeigt werden, dass die eingeschränkt funktionale HR in TNBC-Zelllinien von geringerer Bedeutung für die Resistenz gegen DNA-Schäden ist als die S-Phase-Schadensantwort. Es wurde erstmalig beobachtet, dass sie in besonderem Maße von CHK1 abhängig sind, um Replikationsstress zu vermeiden und HR-Prozesse nicht aktivieren zu müssen. Somit könnte die Inhibition von CHK1 in TNBCs ein geeigneter therapeutischer Angriffspunkt für eine gezielte Therapie sein. Der erhöhte Anteil von Tumorstammzellen in den TNBC-Zelllinien hatte hingegen keinen direkten Einfluss auf die Resistenz gegen DNA-Schäden.
Die Daten der Arbeit weisen zudem darauf hin, dass die schlechte Prognose von TNBC-Patientinnen mit erhöhter Expression von RAD51 und CHK1 mutmaßlich auf eine eingeschränkt funktionale HR und damit erhöhte genomische Instabilität zurückgeführt werden könnte. Die Daten der vorliegenden Arbeit deuten an, dass eine erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 mit einem erhöhten Anteil von Tumorstammzellen assoziiert sein könnte und sollte in zukünftigen klinischen Studien überprüft werden.
Summary
Breast cancer compromises a heterogeneous group of tumors, 15-25 % of which are classified as triple-negative. Patients with triple-negative breast cancer (TNBC) have a poor prognosis and the strong heterogeneity as well as the lack of hormone receptors leave little room for targeted therapeutic approaches. TNBCs are characterized by a defect in the DNA double-strand break repair pathway homologous recombination (HR) and an increased proportion of tumor stem cells. HR is the most important DNA double-strand break repair pathway of the S phase and an HR defect can affect several HR functions: the repair of double-strand breaks (DSBs) with two open ends (two-ended), the repair of DSBs with one open end (one-ended) and the stabilization of replication forks.
The aim of this work was to clarify I) how the HR defect in TNBC affects the individual functions of HR, II) the significance of the DNA damage response of the S phase (S-Phase damage response) in TNBCs and III) whether the proportion of tumor stem cells affects therapy resistance. These questions were examined in an isogenic cell system consisting of three TNBC cell lines. An HR-proficient, luminal cell line was used as a reference cell line.
I) Compared to the luminal cell line, the TNBC cell lines showed a significantly higher expression of the HR protein RAD51 and the central protein of the S phase damage response, CHK1 (Checkpoint kinase 1). When analyzing repair capacity by HR (HR capacity), the TNBC cell lines showed very low HR capacity compared to the luminal, HR-proficient cell line, confirming the limited functionality of HR in the TNBC cell lines. Neither the limited functionality of HR, nor the increased expression of RAD51 and CHK1 had an effect on the stabilization of replication forks, nor did they show increased sensitivity to camptothecin or olaparib, which induce one-ended double-strand breaks (DSBs). This also had no effect on the sensitivity to Mitomycin C (MMC). Two of the TNBC cell lines were distinctly MMC-resistant, one TNBC cell line and the luminal cell line were MMC-sensitive. MMC sensitivity was not due to reduced accumulation of RAD51 foci, but to accumulation of replication-associated DNA damage. Overall, cellular survival after induction of S-phase associated DNA damage was found to depend less on HR and more on the S-phase damage response. Their activation was subsequently tested by the formation of RPA (replication protein A) -foci, analysis of the signaling cascade of the S-phase DNA damage response, replication processes and inhibition of CHK1 after MMC damage.
II) When testing the functionality of the S-phase DNA damage response, the MMC-sensitive cell lines showed a pronounced accumulation of RPA in the nucleus. This could be attributed to an insufficient phosphorylation of CHK1. It could be shown for the first time that the reduced phosphorylation of CHK1 led to an increased stalling and a pronounced degradation of replication forks under MMC damage, as observed by DNA fiber assay analysis. The MMC-resistant cell lines with pronounced activation of CHK1 showed no conspicuous replication structures or slowed elongation despite MMC damage. The dependence of these processes on CHK1 was confirmed by inhibition of CHK1 and led to degradation of replication forks in MMC-resistant cell lines. This can be attributed to the fact that CHK1 at the replication fork regulates the activity of the nucleases MRE11 and Mus81/Eme1. The unimpaired elongation of the MMC-resistant cell lines could be attributed to the CHK1-dependent activation of translesion synthesis. In accordance with this, the inhibition of CHK1 in
MMC-resistant cell lines led to an increase in cells with a pan-nuclear γH2AX signal and a significant sensitization to MMC.
III) The TNBC cell lines, unlike the luminal reference cell line, showed an expression pattern as documented for stem cell-like breast cancer cells. In line with this, ALDH1 activity measurement confirmed the high proportion of tumor stem cells in TNBC cell lines. Interestingly, the cell system showed a clear association between RAD51 and CHK1 expression and tumor stem cell proportions. In contrast to other studies, the high proportion of tumor stem cells did not correlate with radiation or chemoresistance, although in accordance with other studies the expression of the stem cell marker ZEB1 (Zinc finger E-box-binding homeobox
1) correlated significantly with the expression of CHK1. In order to further investigate the
relationship between radiation resistance and stem cell phenotype, hypofractionated irradiation was used to produce radioresistant clones that showed a significant increase in radiation resistance, indicating an increase in the tumor stem cell population.
In summary, it could be shown for the first time that a high expression of RAD51 and CHK1 in an isogenic and non-genetically modified cell system had no significant influence on HR capacity. In addition, the analysis of HR functions showed that restricted functional HR in TNBC cell lines is less important for resistance to DNA damage than S-phase damage response. It was observed for the first time that they are particularly dependent on CHK1 in order to avoid replication stress and not have to activate HR processes. Thus, the inhibition of CHK1 in TNBCs could be a suitable therapeutic target for targeted therapy. The increased proportion of tumor stem cells in the TNBC cell lines, however, had no effect on resistance to DNA damage.
The data from the study also indicate that the poor prognosis of TNBC patients with increased expression of RAD51 and CHK1 can presumably be attributed to limited functional HR and thus increased genomic instability. The data of the present study also indicated that an increased expression of RAD51 and CHK1 may be associated with an increased proportion of tumor stem cells and should be investigated in future clinical studies.
Summary ... iii
1. Einleitung ... 1
1.1 Das Mammakarzinom ... 1
1.2 Das Triple-negative Mammakarzinom (TNBC) ... 2
1.2.1 Prognose beim TNBC ... 3
1.2.2 Therapie beim TNBC ... 3
1.3 Therapeutische Angriffspunkte des TNBC... 4
1.3.1 HR-Defekt ... 4
1.3.2 Tumorstammzellen ... 5
1.4 Die DNA-Schadensantwort ... 6
1.5 Der Intra-S-Phase Kontrollpunkt ... 8
1.6 Homologe Rekombination ... 10
1.6.1 Bedeutung der Homologen Rekombination in der DNA-Reparatur ... 10
1.6.2 Bedeutung der HR in der Reparatur von DSBs ... 10
1.6.3 Die Reparatur zwei-endiger DSBs mittels HR ... 11
1.6.4 Die Reparatur ein-endiger DSBs durch HR ... 12
1.6.5 Die Stabilisierung angehaltener Replikationsgabeln durch HR ... 13
1.7 Bedeutung der Expression von RAD51 und CHK1 im TNBC ... 14
1.8 Das MDA-231 Zellsystem... 15
1.9 Ziele der Arbeit ... 16
2. Material und Methoden ... 17
2.1. Material ... 17
2.1.1 Zelllinien ... 17
2.1.3 Antikörper ... 17
2.1.4 Chemikalien ... 20
2.1.5 Puffer und Lösungen ... 21
2.1.6 Kits ... 23
2.1.7 Verbrauchsmaterialien ... 24
2.1.8 Geräte ... 26
2.2 Methoden ... 27
2.2.1 Zellkultivierung ... 27
2.2.3 Koloniebildungstest ... 29
2.2.4 Western-Blot ... 30
2.2.5 Messung der Zellzyklusverteilung ... 32
2.2.6 Nachweis von Reparatur-Foci mittels Immunfluoreszenz ... 33
2.2.7 Der DNA Fiber Assay ... 34
2.2.8 Der Plasmid-Rekonstruktionsassay ... 36
2.2.9 Der ALDEFLUOR™-Assay ... 39
2.2.10 Bestimmung der Migrationskapazität ... 40
2.2.11 Herstellung radioresistenter Klone ... 40
2.2.12 Statistik ... 40
3. Ergebnisse... 41
3.1 Die Funktionen der Homologen Rekombination in TNBCs ... 41
3.1.1 Expression ausgewählter an DNA Reparatur und Zellzykluskontrolle beteiligter Proteine ... 41
3.1.2 Einfluss der Zellzyklusverteilung auf die Expression von RAD51 und CHK1 ... 43
3.1.3 Bestimmung der Reparatur zwei-endiger DSBs durch HR ... 44
3.1.4 Bestimmung der Stabilisierung angehaltener Replikationsgabeln ... 45
3.1.5 Bestimmung der Reparatur ein-endiger DSBs und Bestrahlungsschäden ... 47
3.1.6 Bestimmung des zellulären Überlebens nach MMC-Schädigung ... 49
3.1.7 RAD51- und γH2AX-Foci Bildung nach MMC-Schädigung ... 51
Zusammenfassung 1 ... 53
3.2 Die Bedeutung der S-Phase Schadensantwort für die zelluläre MMC-Empfindlichkeit 54 3.2.1 RPA-Foci Bildung nach MMC-Schädigung ... 54
3.2.2 Aktivierung der S-Phase-Schadensantwort nach MMC-Schädigung ... 55
3.2.3 Zellzyklusverteilung nach MMC-Schädigung ... 57
3.2.4 Einfluss von MMC auf Replikationsprozesse ... 58
3.2.5 Einfluss von CHK1 auf Replikationsprozesse bei MMC-Schädigung ... 61
3.2.6 Auswirkung der Inhibition von CHK1 auf den zellulären Replikationsstress ... 64
3.2.7 Auswirkungen der Inhibition von CHK1 auf die Zellzyklusverteilung ... 65
3.2.8 Auswirkung der Inhibition von CHK1 auf das Überleben nach MMC-Behandlung. 68 3.2.9 Zusammenfassung 2 ... 69
3.3 Charakterisierung des Tumorstammzell-Phänotyps ... 70
3.3.1 Expression von Stammzell- und mesenchymalen Markern ... 70
3.3.3 Aktivität von ALDH1 als Marker eines Stammzellphänotyps ... 73
3.3.4 Migrationskapazität als Merkmal von Tumorstammzellen ... 74
3.3.5 Erhöhung der Tumorstammzellpopulation durch wiederholte Bestrahlung ... 74
3.3.6 Zusammenfassung 3 ... 76
4. Diskussion ... 77
4.1 Die Bedeutung der Funktionen der Homologen Rekombination in TNBCs ... 77
4.1.1 Expression von Faktoren der HR und der S-Phase Schadensantwort ... 77
4.1.2 Die Reparatur zwei-endiger DSBs ... 79
4.1.3 Stabilisierung von Replikationsgabeln ... 83
4.1.4 Reparatur ein-endiger DSBs und Bestrahlungsschäden ... 84
4.1.5 Zelluläres Überleben nach MMC-Schädigung ... 88
4.1.6 RAD51- und γH2AX-Foci nach MMC-Schädigung ... 89
4.1.7 Konklusion ... 90
4.2 Die Bedeutung von CHK1 für die zelluläre MMC-Empfindlichkeit ... 91
4.2.1 Aktivierung der S-Phase Schadensantwort nach MMC-Schädigung ... 91
4.2.2 Bedeutung von CHK1 für Replikationsprozesse nach MMC-Schädigung... 93
4.2.3 Auswirkung der Inhibition von CHK1 auf zellulären Replikationsstress und das zelluläre Überleben nach MMC-Schädigung ... 95
4.2.4 Zusammenfassung und Konklusion ... 96
4.2.5 Modell ... 97
4.3 Die Bedeutung des Tumorstammanteils in TNBC-Zelllinien ... 98
4.3.1 Bestimmung des Tumorstammzell-Phänotyps ... 98
4.3.2 Die Bedeutung des Tumorstammzellanteils für die Therapieresistenz in vitro ... 99
4.3.3 Steigerung des Tumorstammzellanteils durch widerholte Bestrahlung ... 100
4.3.4 Konklusion ... 101 5. Literatur ... 103 6. Abkürzungen ... 112 Danksagung ... 115 Curriculum Vitae ... 117 Eidestattliche Erklärung ... 120
1. Einleitung
Krebs fasst eine Gruppe von Krankheiten zusammen, die durch unkontrolliertes Wachstum genetisch veränderter Zellen charakterisiert ist [1]. Diese können durch Fehler in der DNA-Replikation, exogene Schädigungen und fehlerhafte DNA-Reparatur hervorgerufen werden, die sich im Laufe des Lebens akkumulieren. Die mit Abstand häufigste Krebserkrankung bei der Frau ist das Mammakarzinom [2]. Das Mammakarzinom umfasst eine sehr heterogene Gruppe von Tumoren, die sich hinsichtlich des Erkrankungsalters und der Prognose deutlich unterscheiden. Während ein Großteil der Mammakarzinome dank spezifischer Therapien effektiv behandelt werden kann, zeigen Tumoren bestimmter Subtypen des Mammakarzinoms ein geringes therapeutisches Ansprechen und führen zu einer schlechten Prognose. Um die Therapie dieser Tumoren gezielt zu intensivieren, ist ein genaues Verständnis der Überlebensstrategien der Tumorzellen, ihrer DNA-Reparaturmechanismen und Signalkaskaden sowie die Etablierung prädiktiver Biomarker notwendig.
1.1 Das Mammakarzinom
Das Mammakarzinom ist mit 70000 Neuerkrankungen pro Jahr die häufigste Krebserkrankung bei der Frau [2]. Ein Großteil der Tumoren entsteht dabei sporadisch, bei 5-10% der Mammakarzinome liegt eine genetische Prädisposition vor [3]. Für die Entstehung von Mammakarzinomen ist eine Vielzahl von Risikogenen identifiziert worden, die direkt oder regulatorisch dem DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg Homologe Rekombination (HR) zugerechnet werden. So zählen insbesondere BRCA1 (Breast Cancer 1), BRCA2 (Breast Cancer 2) und PALB2 (Partner and localizer of BRCA2), aber auch TP53 und PTEN (Phosphatase and
Tensin homolog) zu den Hochrisikogenen. ATM (Ataxia talangiectasia-mutated), CHK2
(Checkpoint Kinase 2), RAD50, RAD51C, RAD51D, NBN (Nibrin) und BRIP1 (BRCA1-interacting
protein 1) werden den mittleren Risikogenen zugerechnet [1, 4, 5]. Trägerinnen von
Mutationen in einem der Risikogene, aber auch Patientinnen, die ersten Grades mit Trägern verwandt sind, haben ein deutlich erhöhtes Risiko frühzeitig am Mammakarzinom zu erkranken [6, 7]. Das Mammakarzinom ist eine heterogene Erkrankung mit fünf intrinsischen Subtypen, die in Microarray basierten Studien identifiziert wurden [8, 9]: Luminal A, Luminal B, HER2-positive, Triple-negative (bzw. Basal-artige) und Normal-artige. Die Subtypen werden hauptsächlich anhand der Expression von Hormonrezeptoren charakterisiert, dem so genannten molekularen Subtyp. Tumoren des Typs Luminal A und B, sowie Normal-artige exprimieren den Östrogen- (ER) und/oder den Progesteronrezeptor (PR) an ihrer Zelloberfläche. Luminal A und B werden dabei anhand der Expression des Proliferationsmarkers Ki67 unterschieden, der bei Luminal B-Tumoren höher ist. Zusätzlich können Tumoren des Luminal B Subtyps den Rezeptor exprimieren [1, 10, 11]. HER2-positive Tumoren exprimieren weder Östrogen- noch Progesteron Rezeptor, zeichnen sich jedoch durch eine hohe Expression des Humanen-Epithelialen-Wachstumsfaktor-2 (HER2) Rezeptors aus. Triple-negative Tumoren zeichnen sich hingegen durch die fehlende Expression von Östrogen-, Progesteron und HER2-Rezeptor aus [1, 12]. Die Prognose hängt beim Mammakarzinom stark vom Subtyp ab. Patientinnen mit Tumoren des der Subtypen Luminal A und B, Normal-artig und HER2-positiv profitieren von zielgerichteten, anti-hormonellen
Therapien. So konnte in einer Studie mit mehr als 3000 Patientinnen mit HER2-positivem Tumor durch den Einsatz des Antikörpers Trastuzumab, der an den HER2-Rezeptor bindet, das Rezidiv-Risiko im Vergleich zu alleiniger Chemotherapie um 52 % verringert werden [1, 13]. Für den Triple-negativen Subtyp existiert bis Dato keine zielgerichtete Therapie, obwohl die Prognose von allen Subtypen des Mammakarzinoms am schlechtesten ist (Vgl. Abb. 1.1) [1, 14, 15].
1.2 Das Triple-negative Mammakarzinom (TNBC)
Das Triple-Negative Mammakarzinom (TNBC) trägt seinen Namen durch die fehlende Expression von ER-, PR- und HER2-Rezeptoren [16]. Etwa 15-25% aller Mammakarzinome sind Triple-negativ [15, 17]. Die Tumorzellen des TNBCs haben zumeist einen basal-artigen Phänotyp und exprimieren Gene, die für basale Epithelzellen/ Myoepithelzellen charakteristisch sind, wie die Cytokeratine 5, 14 und 17 und den EGF-Rezeptor (Epidermal
Growth Factor Receptor) [15]. Obwohl „TNBC“ und „Basal-artig“ keine Synonyme sind, sind ca.
80% der TNBC intrinsisch basal-artig und mehr als 90% der intrinsisch Basal-artigen Tumoren sind hinsichtlich ihres molekularen Subtyps Triple-negativ [15, 18]. Klinisch werden TNBCs als einheitliche Entität erfasst, jedoch zeigten molekulare Analysen einen hohen Grad der Heterogenität [19]. In der Arbeit von Lehmann (2011) [20] konnten unter den TNBCs sechs Subgruppen identifizieren: zwei Basal-artige Subgruppen (BL1 und BL2), zwei Mesenchymal-artige Subgruppen (Mesenchymal (M) und Mesenchymal-Stammzellartig (MSL), eine immunmodulatorische Subgruppe (IM) und eine Luminal-Androgenrezeptor positive Subgruppe (LAR). Diese unterscheiden sich untereinander noch einmal deutlich. TNBCs der LAR Subgruppe sind Triple-negativ, ähneln histologisch und genetisch jedoch den luminalen Tumoren und exprimieren den Androgen-Rezeptor [15, 20]. TNBCs der Subgruppen M und MSL zeichnen sich hingegen durch eine hohe Expression von Faktoren der Zellbeweglichkeit- und der extrazellulären Matrix aus, sowie einer geringen Expression der Claudine 3, 4 und 7 [21]. TNBCs der Subgruppe IM zeigten eine Anreicherung von Genen, die an Immunprozessen beteiligt sind [21]. Die beiden Basal-artigen Subgruppen zeichnen sich hingegen durch ihren
Abbildung 1.1: Prognose beim Mammakarzinom nach Subtyp (modifiziert nach Dai et al., 2015 [21]).
Schematische Darstellung der molekularen Subtypen des Mammakarzinoms und ihrer Bedeutung für die Prognose. ER: Östrogen-Rezeptor; PR: Progesteron-Rezeptor; HER2: Humaner Epidermialer Wachstumsfaktor 2 Rezeptor; BRCA1: Breast Cancer 1.
intrinsischen Basal-artigen Phänotyp, eine ausgesprochen hohe Proliferationsrate und eine Anreicherung von Genen aus, die am Zellzyklus und der Zellteilung beteiligt sind [20].
Generell weisen TNBCs ein hohes Maß genomischer Instabilität und intratumorale Heterogenität auf [19]. Durchschnittlich trägt ein Triple-negativer Tumor etwa 60 Mutationen oder 1,7 somatische Mutationen pro Megabase (MB) in kodierenden Regionen, zudem Kopie-Anzahl-Variationen (Copy-Number-Variations, CNV) und strukturellen Umlagerungen [15, 19]. Unter den Genen, die am häufigsten mutiert sind, tritt nur eine Mutation von TP53 gehäuft auf (60 – 70 % aller TNBCs) [19]. Mutationen im Gen PIK3CA
(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) sind ebenfalls vergleichsweise häufig (~10% aller TNBCs) [19]. Andere Mutationen treten mit geringer (1-5 %) oder sehr geringer Häufigkeit (> 1 %) auf. Weitere Gene können deletiert- oder amplifiziert vorliegen wie PTEN,
KRAS (Kirsten rat sarcoma viral ongogene homolog), BRAF oder EGFR, dabei variiert die
Häufigkeit deutlich (1-40 % aller TNBCs) [15, 19]. Mutationen oder Deletionen in TP53, PIK3CA und PTEN scheinen dabei früh in der Tumorigenese zu erfolgen, während Mutationen, die die Migrationsfähigkeit und die Epitheliale zur Mesenchymalen Transition (EMT) beeinflussen, erst später einzutreten scheinen [19].
1.2.1 Prognose beim TNBC
TNBCs treten überproportional häufig bei jungen, prämenopausalen Frauen auf und bedeuten im Vergleich zu den anderen Subtypen des Mammakarzinoms eine schlechte Prognose und ein geringes Patientenüberleben (Vgl. Abb. 1.2) [15, 16, 22-24]. TNBCs haben eine hohe Proliferationsrate und die Größe des Tumors korreliert, mehr als bei allen anderen Subtypen des Mammakarzinoms, mit der Überlebenswahrscheinlichkeit. [8, 16]. Obwohl sie generell gut auf Chemotherapie ansprechen, treten Lokalrezidive und Fernmetastasen häufiger auf als bei allen anderen Subtypen des Mammakarzinoms, insbesondere in den ersten fünf Jahren nach der Diagnose [15, 25-27]. Dabei zeigen sie mit ihrem Metastasierungsmuster eine Präferenz für die Ausbildung von Viszeral-Metastasen in Hirn, Leber und Lunge in geringerem Ausmaß in den Knochen [25, 26]. In der metastasierten Situation leben trotz Chemotherapie weniger als 30% der TNBC-Patientinnen fünf Jahre nach der Diagnose und letztendlich versterben alle Patientinnen daran [28].
1.2.2 Therapie beim TNBC
Das Fehlen von Hormonrezeptoren und die starke Heterogenität des TNBC lässt wenig Spielraum für gezielte Therapieansätze. Deshalb erfolgt die Therapie hauptsächlich durch Chemotherapie, Chirurgie und Strahlentherapie [1, 23]. Bei der Tumor-Resektion wird die Brust weitgehend erhalten, eine Mastektomie erfolgt in der Regel nur in stark fortgeschrittenen Stadien, multiplem Tumorbefall einer Brust, Lokalisation nahe der Brustwand oder hohem Alter der Patientin [1]. Im Anschluss erfolgt fast immer eine fraktionierte Bestrahlung des Tumorbettes und benachbarter Lymphknoten, um das Risiko eines Rezidivs zu verringern [1]. Die systemische Chemotherapie stellt ein besonders wichtiges Standbein der Therapie des TNBCs dar, zahlreiche Studien der letzten Jahre zeigten einen signifikanten Nutzen für die Patientinnen durch die Chemotherapie in der neoadjuvanten, adjuvanten und metastasierten Situation [29]. Trotz der schlechten Prognose weisen TNBCs eine höhere Ansprechrate auf Chemotherapie auf als andere Subgruppen des
Mammakarzinoms [15]. Die zumeist eingesetzten Substanzen sind Taxane und Anthracycline, die aufgrund des hohen Anteils proliferierender Zellen im Tumor wirksam sind [15]. Bei einer vorliegenden Mutation der Gene BRCA1 oder BRCA2 können Patientinnen zusätzlich von einer Behandlung mit einem PARP1 (Poly (ADP-ribose)-Polymerase 1)-Inhibitor profitieren [15]. Das Protein PARP1 hat neben zahlreichen anderen Funktionen große Bedeutung in der Basenexzisionsreparatur (BER) [30]. Ist PARP1 inhibiert werden Einzelstrangbrüche (SSBs) nicht repariert und führen in der S-Phase zur Ausbildung replikationsassoziierter DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Bei diesen Schäden ist die Zelle auf die Reparatur durch HR angewiesen, die in Zellen mit Mutationen in BRCA1 oder BRCA2 nicht funktional ist. Dies wird als synthetische Letalität bezeichnet [15, 31].
1.3 Therapeutische Angriffspunkte des TNBC
1.3.1 HR-Defekt
Trotz der ausgeprägten Heterogenität weist ein signifikanter Anteil von TNBCs einen HR-Defekt auf [31-33]. Von den Patientinnen mit TNBC liegt der Anteil von Mutationsträgerinnen der Gene BRCA1 oder BRCA2, die im DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg HR von großer Bedeutung sind, bei etwa 10%. Dabei sind Mammakarzinome von BRCA1-Mutationsträgerinnen besonders häufig Triple-negativ und weisen zumeist eine p53-Mutation auf [15]. Mutationen in BRCA1 oder BRCA2, die zum Teil während der Tumorigenese entstehen, werden bei ca. 14-20 % aller TNBCs beobachtet, ein HR-Defekt wurde hingegen bei einem deutlich größeren Anteil von TNBCs dokumentiert [22, 32-34]. So wurden in TNBCs zahlreiche, weitere Mutationen in den Genen PALB2, BARD1 (BRCA1-associated RING domain
protein 1), RAD51D, BRIP1 und RAD51C dokumentiert, die die Funktionalität der HR negativ
beeinflussen [15]. Auch eine Überexpression von HORMAD1 (HORMA domain-containing
protein 1) führte in TNBCs zu einem HR-Defekt [15]. Es wurden bereits Verfahren entwickelt,
um HR-Defekte abseits einer BRCA-Mutation in TNBCs zu diagnostizieren [15]. So konnten Telli et al. (2016) [32] bei der Analyse von 1058 Tumorproben des TNBC mit- und ohne
BRCA-Abbildung 1.2: Überleben von Brustkrebspatientinnen nach Subtyp (modifiziert nach Weigelt et al., 2010 [14]).
Mutation durch Ermittlung des HRD-scores (Homologous Recombination Deficiency Score) zeigen, dass Tumoren mit hohem HRD-score deutlich besser auf eine platinbasierte Chemotherapie ansprachen als solche mit geringem HRD-score. Der HRD score setzte sich dabei aus drei unabhängigen Markern zusammen: Verlust der Heterozygotie (loss of
heterozygosity, LOH), große Transitionen (large scale transitions, LST) und ein Telomer-Allel
Ungleichgewicht (telomeric allelic imbalance, TAI). Die Marker wurden durch eine Next
Generation Sequencing basierte Ermittlung von Nukleotid Polymorphismen bestimmt [32]. Ein
HR-Defekt führt häufig zu einer gestörten Akkumulation von RAD51, dem zentralen Protein der HR. Naipal (2014) [35] konnten in 45 Tumorproben des Mammakarzinoms nach ex-vivo Bestrahlung einen HR Defekt durch das Ausbleiben von RAD51-Reparaturfoci diagnostizieren und so eine erhöhte Empfindlichkeit der HR-defizienten Tumoren gegen PARP1-Inhibition prognostizieren. Trotz vielversprechender Ansätze wird kein solches Verfahren in der Klinik angewendet, dabei ist ein HR-Defekt ein möglicher therapeutischer Angriffspunkt des TNBCs.
1.3.2 Tumorstammzellen
Im TNBC kommt es, trotz Strahlentherapie, häufig zur Ausbildung von Lokalrezidiven und zu einer frühzeitigen Bildung von Fernmetastasen [15, 27]. Dies wird auf einen erhöhten Anteil von Tumorstammzellen im TNBC zurückgeführt [23, 36-38]. Tumorstammzellen weisen Eigenschaften von Gewebestammzellen auf: sie haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und können eine heterogene Population von Tumorzellen hervorbringen [20, 39]. Tumorstammzellen exprimieren spezifische Marker, anhand derer sie identifiziert werden können. Im Mammakarzinoms zeichnen sich Tumorstammzellen durch eine spezifische Expression von Oberflächenmarkern (CD44high/CD24low) aus, darüber hinaus zeigten diese Zellen in weiteren Studien eine erhöhte Aktivität von ALDH1 (Aldehyde-Dehydrogenase 1) und eine hohe Proteinexpression des EMT (Epitheliale zu Mesenchymaler Transition)- und Stammzellmarkers ZEB1 (Zinc Finger E-Box Binding Homebox 1) [23, 39-42]. Im Mausmodell wurde bereits gezeigt, dass nur 100 dieser tumorinitiierenden Zellen zur Bildung eines Tumors notwendig waren [41]. Mehrere Studien konnten darüber hinaus eine erhöhte Therapieresistenz in Tumorstammzellen zeigen. So hing die lokale Tumorkontrolle nach Bestrahlung in murinen Modellen direkt von der Anzahl der Tumorstammzellen im Tumor ab [43]. Dabei korrelierte die Strahlenresistenz in weiteren Studien direkt mit einer signifikant verringerten Anzahl von DNA-Schäden in Tumorstammzellen des Mammakarzinoms und des Glioblastoms [44, 45]. Die erhöhte Therapieresistenz wird hauptsächlich auf geringen oxidativen Stress und eine veränderte DNA-Schadensantwort zurückgeführt. In Tumorstammzellen des Mammakarzinoms wurde in vitro ein im Vergleich zu nicht-Tumorstammzellen geringerer Anteil reaktiver Sauerstoffspezies gemessen (reactive oxygen
species, ROS), was nach Bestrahlung zu einer geringeren Anzahl von DNA-Schäden führte [46].
Des Weiteren wurde in Tumorstammzellen eine starke Aktivierung der beiden Serin-/ Threoninkinasen ATM und ATR, sowie ihrer beiden downstream-Kinasen CHK1 und CHK2 beobachtet [47]. Dabei scheint insbesondere CHK1 von Bedeutung zu sein, eine verstärkte Aktivierung wurde bereits nach Bestrahlung in Tumorstammzellen des Glioblastoms und nach Gemcitabine-Behandlung in Tumorstammzellen des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms beobachtet [48, 49]. Auch in Tumorstammzellen des Mammakarzinoms konnte eine herausgestellte Rolle von CHK1 für die Strahlenresistenz in Tumorstammzellen gezeigt
werden. In Brustepithelzellen führte wiederholte Bestrahlung zu einer verstärkten Expression des Stammzellmarkers ZEB1, der nach Bestrahlung durch ATM aktiviert wurde und CHK1 stabilisierte. Durch diese Interaktion wurde eine Resistenz gegen ionisierende Strahlung vermittelt [42]. Somit führte die Therapie zu einer Selektionierung der Tumorstammzellen oder gar zu einer Dedifferenzierung von nicht-Tumorstammzellen zu einem stammzellartigen Phänotyp, wie es nach Bestrahlung in Mammakarzinomzellen bereits beobachtet wurde [50]. Weitere Faktoren sind für die Therapieresistenz von Tumorstammzellen von Bedeutung. In stammzellartigen Zelllinien des Mammakarzinoms wurde eine Überexpression von RAD51, dem Schlüsselprotein der HR, als resistenzvermittelnder Faktor gegen PARP1-Inhibition identifiziert [51]. Auch in therapieresistenten Tumorstammzellen des Glioblastoms wurde nach Bestrahlung eine erhöhte Expression von RAD51 beobachtet [52]. Eine Überexpression des Proteins PARP1 führte in Tumorstammzellen des Mammakarzinoms zu einer Resistenz gegen PARP1 Inhibitoren [53].
Die Therapieresistenz von Tumorstammzellen stellt für die Therapie des TNBC ein großes Problem dar, insbesondere weil bereits beobachtet wurde, dass unter Chemotherapie die Anzahl von Tumorstammzellen deutlich zunahm und bereits eine einzelne Tumorstammzelle ausreicht, um ein Lokalrezidiv oder eine Fernmetastase zu bilden [37, 54]. Die verstärkte Aktivierung der DNA-Schadensantwort und eine verbesserte DNA-Reparatur durch verstärkte Expression daran beteiligter Faktoren sind für die Therapieresistenz von Tumorstammzellen von besonderer Bedeutung. Somit stellen diese Prozesse in Tumorstammzellen mögliche therapeutische Angriffspunkte dar.
1.4 Die DNA-Schadensantwort
Die Integrität der genetischen Information ist überlebenswichtig für Zelle. Die DNA ist durch zelluläre Prozesse und exogene Faktoren ständiger Beschädigung ausgesetzt und hat zahlreiche Mechanismen entwickelt, um diese zu reparieren und ihre genomische Integrität zu erhalten. Die DNA-Schadensantwort ist ein Signaltransduktionsweg, und die wichtigsten Signalproteine sind die Serin-/Threonin-Kinasen der Pi3K (Phosphoinsositid-3) -Familie: ATM, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3-related) und DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase,
catalytic subunit). Diese Kinasen teilen viele strukturelle und funktionelle Eigenschaften und
werden nach Induktion bestimmter DNA-Schäden durch interagierende Proteine an das Chromatin rekrutiert, wo sie zahlreiche weitere Faktoren aktivieren. So regulieren sie den Zellzyklusarrest und die DNA-Reparatur [55].
ATR ist die bedeutsamste Kinase in der S-Phase. Sie ist sowohl für die DNA-Reparatur als auch für die Regulation der DNA-Replikation von großer Bedeutung [55]. ATR wird durch viele verschiedene DNASchäden, wie unter anderem UVStrahlung, Topoisomerase I -Inhibitoren und DNA-alkylierende Agenzien aktiviert. Diese DNA-Schäden führen zum Anhalten oder zur Verlangsamung elongierender Replikationsgabeln [56]. ATR liegt in einem stabilen, heterodimeren Komplex mit ATRIP (ATR interacting protein) vor und wird durch einzelsträngige DNA (ssDNA), die durch RPA gebunden wurde, aktiviert. ssDNA wird automatisch während der DNA-Replikation bei der Entwindung der Replikationsursprünge generiert, dabei entstehen kurze Bereiche von ssDNA, die zu einer schwachen Aktivierung von
ATR führen [57]. Trifft eine Replikationsgabel auf einen DNA-Schaden, kann dies zu einer funktionellen Entkoppelung von DNA-Polymerase und Helikase führen, so dass die Helikase weiter die DNA entwindet, während die DNA-Polymerase den DNA-Schaden nicht überwinden kann. Dies führt zur Bildung größerer Bereiche von ssDNA [58]. Auch bei der nukleolytischen Prozessierung von DNA-Schäden, wie bei der End-Resektion am DNA-Doppelstrangbruch (DSB), wird RPA gebundene ssDNA generiert. Die Bindung von ATRIP an RPA ist dabei abhängig von der Länge der ssDNA. Ab einer Länge von 50-75 Nukleotiden wird die ssDNA durch ATR/ATRIP erkannt [57]. Die Aktivierung erfolgt über das Heterotrimer 9-1-1-Komplex (Rad9-Rad1-Hus1), der TOPBP1 (Topoisomerase II binding protein) rekrutiert, das über ATRIP ATR aktiviert. Der 9-1-1-Komplex und TOPBP1 werden über ein freies 3‘ oder 5‘ DNA-Ende an den DNA-Schaden oder die Replikationsgabel rekrutiert, somit ist für die Aktivierung von ATR ein freies 3‘ oder 5‘ DNA-Ende Voraussetzung [56]. An einem DSB wird ein freies 3‘-Ende durch die End-Resektion generiert, bei der Entkoppelung von Polymerase und Helikase wird auf dem letzten Okazaki-Fragment des lagging strands ein freies 5‘-Ende natürlich generiert [59]. Ab einer Länge von mindestens 800 bp ssDNA phosphoryliert ATR die Intra-S-Phase Kinase CHK1 an den Serin-Resten 317 und 345, woraufhin CHK1 in den Nukleus transloziert wird und sich selbst am Serin 296 phosphoryliert [60]. Bei Replikationsstress liegt CHK1 assoziiert mit phosphoryliertem Claspin vor, was die ATR-abhängige Phosphorylierung verstärkt und dabei hilft, CHK1 an die Replikationsgabel zu rekrutieren [56, 61]. Die ATR-vermittelte Phosphorylierung von CHK1 aktiviert die DNA-Reparatur und den Intra-S-Phase Kontrollpunkt (s. Abschnitt 1.5).
Während für die Aktivierung von ATR in der S-Phase RPA-gebundene ssDNA nötig ist, werden direkte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), wie sie durch ionisierende Bestrahlung induziert werden, in allen Zellzyklusphasen von der Pi3K-Kinase ATM erkannt. Durch Interaktion mit dem MRN-Komplex (MRE11-Rad50-NBS1) wird ATM an den DSB rekrutiert und seine volle Aktivierung stimuliert [62]. ATM liegt in der Zelle als Multimer oder Dimer vor und dissoziiert nach Bindung an den MRN-Komplex und Autophosphorylierung an Serin 1981 zu aktiven Monomeren [62]. ATM phosphoryliert neben Faktoren der DSB-Reparatur auch Faktoren der Zellzyklusregulation, wie p53 und CHK2 (Checkpoint Kinase 2) [62]. In der S-Phase stimuliert ATM die nukleolytische Funktion von MRE11 und CtIP und leitet die End-Resektion ein, die einzelsträngige 3‘-Überhänge für die HR generiert [63]. Diese werden durch RPA gebunden, was zur Aktivierung von ATR und somit einem Wechsel der Kinasen am DSB führt [63, 64].
Die Pi3K-Kinase DNA-PKcs wird ebenfalls bei Schädigung der DNA aktiviert. Sie unterscheidet sich in ihrer Funktion von ATR und ATM, da sie ein Bestandteil des DSB Reparaturwegs Nicht-homologes Endjoining (NHEJ) ist und kein klassisches Aktivatorprotein [62]. DNA-PKcs wird aktiviert, wenn es durch Ku70/Ku80 an den DSB rekrutiert wird, um die DSB-Reparatur mittels NHEJ einzuleiten.
Eine gemeinsame Zielstruktur der PIK3-Kinasen ist das Histon H2AX. H2AX ist über das Genom verteilt und kann in jeder Zellzyklusphase am Serin 139 phosphoryliert werden. Die ATM abhängige Phosphorylierung von H2AX erfolgt nach DSB-Induktion im Bereich von ein bis zwei Megabasen um den DSB. In der S-Phase wird H2AX ATR-abhängig an angehaltenen oder kollabierten Replikationsgabeln phosphoryliert [65, 66]. Die phosphorylierte Form des H2AX
(γH2AX) dient als Ausgangspunkt für die Aktivierung und Rekrutierung zahlreicher Reparaturproteine.
1.5 Der Intra-S-Phase Kontrollpunkt
Die Serin/Threonin Proteinkinase CHK1 ist die zentrale Kinase des Intra-S-Phase Kontrollpunkts und reguliert die S-Phase-Progression nicht nur bei Replikationsstress, sondern auch in der unbeeinträchtigten S-Phase. Die Funktionen von CHK1 sind zahlreich, es reguliert die Elongation, die späte Aktivierung von Replikationsursprüngen, stabilisiert Replikationsgabeln und verzögert den Fortschritt der S-Phase [60, 67, 68]. Darüber hinaus ist CHK1 essenziell für die Aktivierung der DNA-Reparatur durch HR [69].
Bereits in der ungestörten S-Phase sind ATR und CHK1 negative Regulatoren für die Aktivierung von Replikationsursprüngen, um die Versorgung der aktiven Replikationsgabeln mit Nukleosidtriphosphaten (dNTPs) zu gewährleisten [56]. Bei Replikationsstress wird vermehrt ssDNA an angehaltenen Replikationsgabeln generiert, die zur Phosphorylierung von ATR und CHK1 führt (Vgl. Abschnitt 1.4). Nachdem CHK1 durch ATR phosphoryliert wurde, phosphoryliert- und degradiert CHK1 die Phosphatasen CDC25A, CDC25B und CDC25C. Wenn die Phosphatasen aktiv sind, entfernen sie die inhibitorischen Phosphorylierungen von CDK2 (Cyclin-dependent kinase 2) und CDK1 und aktivieren die Cyclin-CDK Komplexe, die für die Zellzyklusprogression benötigt werden [56]. Durch die Inaktivierung der CDC25 Phosphatasen kommt es zum Zellzyklusarrest. Dieser dient dazu, der Zelle ein Zeitfenster zu verschaffen, um bestehende DNA-Schäden zu reparieren. Durch die Inaktivierung der CDK2-Aktivität kann CDC45 nicht mehr auf Replikationsursprünge geladen werden, wodurch die Aktivierung von Replikationsursprüngen inhibiert wird [60]. Auch die ATM-abhängige Phosphorylierung von CHK2 führt zur Degradation von CDC25A und zur Inaktivierung von CDK2.
Eine CHK1-abhängige Reduktion der aktiven Replikationsursprünge wurde nach Behandlung mit dem Topoisomerase I-Inhibitor Camptothecin in Kolon-Karzinomzellen bereits beobachtet [68]. Durch Limitierung der aktiven Replikationsgabeln wird eine Erschöpfung des dNTP- und RPA-Vorrats verhindert, sowie dass weitere Replikationsgabeln in Schäden hineinlaufen können [60, 70]. In ATR inhibierten, humanen Osteosarkomzellen führte die Behandlung mit dem Replikationsinhibitor Hydroxyharnstoff (Hydroxyurea, HU) durch unkontrollierte Aktivität von Replikationsursprüngen und daraus resultierender Erschöpfung des RPA-Vorrats zu einem kernweiten Kollaps von Replikationsgabeln [71]. Die Elongationsgeschwindigkeit ist ebenfalls CHK1-abhängig. In CHK1-depletierten Hühnerzellen wurde eine Reduktion der Elongationsgeschwindigkeit um 50 % beobachtet [72]. Die reduzierte Elongationsgeschwindigkeit wurde hierbei teilweise durch die verstärkte Aktivierung von Replikationsursprüngen beeinflusst [60].
Neben der Regulation der Elongation, S-Phase Progression und Aktivierung von Replikationsursprüngen hat CHK1 weitere Funktionen, die zur Stabilisierung von Replikationsgabeln beitragen. So konnte in Osteosarkomzellen gezeigt werden, dass CHK1 die Aktivität der Nuklease MRE11 reguliert. Durch Regulierung ihrer Aktivität wird die unkontrollierte nukleolytische Degradation an angehaltenen, regressierten Replikationsgabeln verhindert [73]. Neben MRE11 wird die Aktivität der strukturspezifischen
Endonuklease Mus81/Eme1, die angehaltene Replikationsgabeln zu DSBs konvertiert, durch CHK1 reguliert [74]. Das Anhalten von Replikationsgabeln kann durch CHK1 vermittelte Aktivierung der Transläsionssynthese (TLS) sogar gänzlich vermieden werden. Bei der TLS werden alternative Polymerasen eingesetzt, die über Basenschäden hinwegreplizieren können. Nach Cisplatin- oder HU - Behandlung wurde in Osteosarkom- und Ovarialkarzinomzellen eine CHK1- anhängige Rekrutierung von Polymerase η und RAD18, beides Faktoren der TLS, ans Chromatin beobachtet [75].
Neben der Stabilisierung von Replikationsgabeln ist CHK1 essenziell für die Aktivierung der DNA-Reparatur durch HR. CHK1 stimuliert die Reparatur von DSBs durch HR, indem es die zentralen Faktoren der HR, RAD51 und BRCA2, phosphoryliert und die Rekrutierung von RAD51 an den DSB stimuliert [69].
Zusammengefasst führt die Aktivierung von CHK1 zu einem Arrest des Zellzyklus und einer Inhibition von Replikationsursprüngen. Des Weiteren verhindert CHK1 durch Mechanismen der Stabilisierung von Replikationsgabeln die Formierung von DSBs [60, 73, 74]. Wenn die Ausbildung eines DSBs nicht vermieden werden kann, stimuliert CHK1 die DNA-Reparatur durch HR.
Abbildung 1.3: Kaskade der S-Phase Schadensantwort.
ATR/ATRIP wird am resiszierten DSB durch RPA, 9-1-1 Komplex und TOPBP1 phosphoryliert. ATR/ATRIP phosphoryliert CHK1, das mit CLASPIN assoziiert ist. CHK1 degradiert CDC25A, so dass die Bildung des Cyclin/CDK-Komplexes verhindert wird. Eine detaillierte Beschreibung befindet sich im Text. RPA: Replikationsprotein A, ATRIP: ATR interacting protein, ATR: Ataxia talangiectasia and rad3 related, TOPBP1: Topoisomerase 2 binding protein, CHK1: Checkpoint Kinase 1, CDC25A: M-phase inducer phosphatase, CDK2: Cyclin dependent kinase 2, Cyclin: Cyclin E oder A.
1.6 Homologe Rekombination
1.6.1 Bedeutung der Homologen Rekombination in der DNA-Reparatur
Die Homologe Rekombination (HR) ist ein aus vielen Faktoren bestehender Komplex, der insbesondere in der S- Phase von größter Bedeutung für die genomische Integrität der Zelle ist [76, 77]. Die HR hat mehrere, wichtige Funktionen (Vgl. Abb. 1.4): die Reparatur von Doppelstrangbrüchen mit zwei offenen Enden (zwei-endige DSBs), die Reparatur replikationsassoziierter DSBs mit einem offenen Ende (ein-endige DSBs) und die Stabilisierung angehaltener, geöffneter Replikationsgabeln [65, 77, 78]. Die Reparatur von DSBs durch HR führt zu fehlerfreien Ergebnissen, da das Schwesterchromatid als fehlerfreie Matrize verwendet wird [79], allerdings konkurriert die HR hierbei mit dem fehlerhaften Nicht-homologen Endjoining (NHEJ) und dem Single-Strand annealing (SSA) [80]. Die Reparatur ein-endiger, replikationsassoziierter DSBs ist notwendig, wenn Replikationsgabel in unreparierte SSBs hineinläuft oder durch unzureichende Stabilisierung kollabiert und nicht neu gestartet werden kann. Ein-endige DSBs werden ausschließlich durch HR repariert [81]. Angehaltene Replikationsgabeln werden von zahlreichen Faktoren der HR, insbesondere RAD51, vor nukleolytischer Degradation geschützt [77, 78].
1.6.2 Bedeutung der HR in der Reparatur von DSBs
DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind für die Zelle potenziell letale Läsionen, die endogen während des Zellmetabolismus entstehen können oder exogen durch bei Behandlung mit ionisierender Strahlung oder DNA-schädigenden Agenzien induziert werden. Zudem können sie bei der Kollision von Replikationsgabeln mit SSB oder anderen Läsionen entstehen [78]. DSBs können zwei-endig oder ein-endig sein, wobei ein-endige replikationsassoziiert sind [65]. Der Zelle stehen, abhängig von der Zellzyklusphase und der Struktur des DSB zwei Hauptreparaturwege zur Verfügung: das NHEJ (nicht homologe End-joining) und die HR. Das NHEJ stellt den Hauptreparaturweg für zwei-endige DSBs dar, während HR bei zwei-endigen und replikationsassoziierten, ein-endigen DSBs eingesetzt wird. Das NHEJ ist in allen Zellzyklusphasen aktiv, stellt aber insbesondere in der G1- und frühen S-Phase den
A
B
C
Abbildung 1.4: Substrate der Homologen Rekombination in der S-Phase.
Die HR repariert zwei-endige DSBs (A), ein-endige DSBs (B) und stabilisiert angehaltene Replikationsgabeln (C). Zwei-endige DSBs können durch ionisierende Strahlung entstehen, ein-endige DSBs entstehen replikationsassoziiert bei Kollision der Replikationsgabel mit DNA-Schäden oder bei unzureichender Stabilisierung. Durch HR werden angehaltene Replikationsgabeln vor Nukleasen geschützt.
Hauptreparaturweg dar, da es keine Sequenzhomologien benötigt [82]. Beim NHEJ werden die zwei Enden des DSBs miteinander verknüpft, dies kann mit hoher Genauigkeit passieren oder mit dem Erwerb oder Verlust von Nukleotiden an der Bruchstelle [83]. Ob ein DSB durch das NHEJ oder HR repariert wird, bestimmen die Proteine 53BP1 (p53 binding protein 1) und BRCA1, die zellzyklusabhängig von RNAF (RING finger nuclear factor 168) an den DSB rekrutiert werden. 53BP1 stimuliert das NHEJ, während BRCA1 das Einleiten der HR stimuliert. BRCA1 bildet einen Komplex mit MRE11 und CtIP, so dass die End-Resektion eingeleitet wird. CtiP wird ebenfalls zellzyklusabhängig von der Aktivität von CDKs reguliert [84] Die 5‘-3‘-Resektion stellt hierbei das initiale Ereignis für die HR dar, weil dadurch ein 3‘-Überhang entsteht, der Voraussetzung für die HR ist [84].
Die HR findet hauptsächlich in der S- und G2-Phase des Zellzyklus statt und stellt in der S-Phase den Hauptreparaturweg dar [85]. Sie benötigt für die Reparatur ein Schwesterchromatid, dafür ist die Reparatur fehlerfrei [76]. Durch HR können sowohl zwei-endige, als auch ein-zwei-endige, replikationsassoziierte DSB repariert werden [79, 81]. Da die DSB-Reparatur der HR zwei verschiedene Arten von DSB repariert, sind in der Literatur verschiedene Unterwege beschrieben: Das Synthesis-dependent strand annealing (SDSA), das
double-Holliday Junction-Modell und die Breakage-induced replication (BIR) [79, 81]. Der
wichtigste Mechanismus der HR zur Reparatur zwei-endiger DSB ist das SDSA [79]. Ein-endige DSBs werden durch BIR repariert [81]. Die Unterwege der HR haben als initialen Schritt die durch den MRN-Komplex katalysierte 5‘-3‘ Resektion des DSB zu einem 3‘-Überhang, an den RAD51, das Schlüsselprotein aller HR-Prozesse, binden kann.
1.6.3 Die Reparatur zwei-endiger DSBs mittels HR
Das SDSA ist der dominante Mechanismus bei der Reparatur zwei-endiger DSB durch HR [79]. Die Resektion der DNA-Enden ist das initiale Ereignis der HR und wird als Präsynaptische Phase bezeichnet. Zunächst wird über die Nukleasen CtIP und MRE11 ein einzelsträngiger 3‘-Überhang bis zu 100 bp induziert [59]. Die weitere Resektion erfolgt mittels DNA2 und EXO1 unter der Beteilung der BLM (Bloom syndrome protein)- Helikase [59]. Die resizierten, einzelsträngigen DNA-Abschnitte werden durch RPA gebunden, um die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Durch die Bindung von RPA wird über die Aktivierung von ATR/ATRIP, Claspin und CHK1 schließlich die HR eingeleitet [79, 86]. Dabei wird RPA von der ssDNA durch das zentrale Protein der HR, RAD51, verdrängt und ein Nukleofilament gebildet. Dies geschieht unter der Beteiligung von BRCA2, RAD52, RAD54, PALB2 und den RAD51-Paralogen RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 und XRCC3 [79]. Die Bildung des Nukleofilaments in der synaptischen Phase ermöglicht die Stranginvasion- und Homologiesuche im Schwesterchromatid. Hierbei wird eine Heteroduplex gebildet, bei der der invadierende Strang einen Strang des Schwesterchromatids verdrängt und ein so genannter D-Loop (Displacement-Loop) gebildet wird. An der Grenze zwischen Homo- und Heteroduplex wird eine X-förmige Struktur, die so genannte Holliday-Junction ausgebildet, die sich auf dem Strang des Schwesterchromatids hin- und herbewegen kann, was als Branch Migration bezeichnet wird [79]. Wenn sich die Holliday Junction in Richtung der Replikation bewegt, wird der neu synthetisierte Strang freigegeben. Ist der neu synthetisierte Strang über die Sequenz des DSB hinaus synthetisiert worden, bildet er mit dem zweiten Ende des DSB in der
postsynaptischen Phase eine Homoduplex aus. An diesem Prozess sind zahlreiche Faktoren beteiligt: Pol η (DNA-Polymerase eta), WRN (Werner syndrome ATP-dependent helicase), BLM, p53, RAD54, BLAP75 (Bloom-associated protein of 75 kD), und hMSH2-hMSH6 (human Mut S
homolog 2-6) [79]. Die Homoduplex wird ligiert und die fehlende Sequenz des
gegenüberliegenden Strangs synthetisiert unter Beteiligung von Pol δ (DNA-Polymerase
delta), Pol ε (Polymerase epsilon), PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) und
DNA-Ligase 1 [87]. Durch das SDSA werden Crossover verhindert, was das Potential für genomische Umlagerungen reduziert.
1.6.4 Die Reparatur ein-endiger DSBs durch HR
Ein-endige DSBs entstehen replikationsassoziiert, wenn eine Replikationsgabel mit einen SSB kollidiert oder durch Konvertierung einer kollabierten Replikationsgabel zu einem DSB (fork
breakage) [65, 78]. Ein-endige DSBs können direkt durch den Topoisomerase I Inhibitor
Camptothecin (CPT) hervorgerufen werden, weil CPT in der S-Phase SSBs erzeugt [88]. Anders als zwei-endige DSBs können ein-endige DSB nur mittels HR repariert werden, dieser Prozess wird als Breakage-induced replication (BIR) oder recombination-dependent replication bezeichnet [81]. Im Unterschied zum SDSA steht hier nur ein DNA-Ende zur Verfügung.
Zwei-endiger DSB End-Resektion Stranginvasion Holliday Junction, Strangsynthese Ligation, Strangsynthese Keine Crossover Kollision von Replikationsgabel und SSB Ein-endiger DSB End-Resektion Stranginvasion. Strangsynthese, Spaltung der Holliday Junction Nicht-wechselseitige Crossover
(a) Zwei-endiger DSB (b) Ein-endiger DSB
Abbildung 1.5: Reparatur zwei-endiger DSBs und ein-endiger DSBs durch HR (modifiziert nach Heyer et al., 2010
[79]).
Sowohl zwei-endige DSBs (a), als auch ein-endige DSBs (b) werden mittels HR repariert. Dargestellt ist das SDSA (a) für die Reparatur zwei-endiger DSBs und die die BIR (b) für die Reparatur ein-endiger DSB. Die Reparaturwege werden im Text detailliert erläutert.
Ähnlich wie beim SDSA kommt es bei der bei der Reparatur durch BIR durch Resektion zur Ausbildung eines 3‘-Überhangs, RAD51-vermittelte Stranginvasion und Ausbildung einer
Holliday Junction. Die Holliday-Junction wird hierbei allerdings gespalten. Im Anschluss kann
die Replikation fortgesetzt werden [81]. BIR ist hochgradig mutagen, weshalb der Kollaps von Replikationsgabeln in der Zelle normalerweise vermieden wird [89].
1.6.5 Die Stabilisierung angehaltener Replikationsgabeln durch HR
Die Stabilisierung angehaltener Replikationsgabeln ist von großer Bedeutung für die genomische Stabilität der Zelle. Eine unzureichende Stabilisierung führt zum Kollaps oder Bruch der Replikationsgabel. Eine kollabierte Replikationsgabel liegt vor, wenn das Replisom von der Replikationsgabel dissoziiert, so dass sie unfähig ist, die Replikation fortzusetzen [90]. Ein Bruch an der Replikationsgabel wird an kollabierten Replikationsgabeln passiv oder aktiv durch struktur-spezifische Nukleasen wie Mus81/Eme1 induziert und führt zu einem ein-endigen DSB, der über den mutagenen BIR Reparaturweg der HR repariert wird [74, 89, 90]. Bei zellulärem Replikationsstress, Erschöpfung des dNTP Vorrats oder Kollision von Replikationsgabeln mit DNA- Läsionen wird die Replikationsgabel von ihrer typischen drei- gliedrigen Struktur in eine vier- gliedrige Struktur konvertiert. Dieser Prozess wird als fork
reversal oder fork regression bezeichnet und die umgebaute, vier- gliedrige Struktur als chicken foot [78, 90].
Der Umbau wird durch die DNA-Translokasen SMARCAL1 (SWI/SNF-related
matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A-like protein 1) und ZRANB3
(zinc finger, RAN-binding domain containing 3) katalysiert. SMARCAL1 wird durch RPA-gebundene ssDNA an die Replikationsgabel rekrutiert, ZRANB3 durch polyubiquitiniertes PCNA (Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen) [78, 90]. Auch PARP1 ist am Umbau der Replikationsgabel beteiligt [78]. Die RPA gebundene ssDNA- Abschnitte an der angehaltenen Replikationsgabel führen zudem zur Aktivierung von ATR, das CHK1 phosphoryliert und die Aktivität von SMARCAL1 reguliert (Vgl. Abb. 1.6) [78, 90]. RPA wird durch BRCA2 und PALB2 zügig durch RAD51 ausgetauscht und der Umbau eingeleitet [78]. Unter Beteiligung von RAD51, SMARCAL1, BLM, WRN und RAD54 wird die Replikationsgabel schließlich regressiert, dabei werden die neu synthetisierten Tochter-Stränge aneinander angelagert, verlängert und formen einen neuen Arm, der in die Gegenrichtung der Orientierung der Replikationsgabel verläuft (Vgl. Abb. 1.6) [78]. Durch diesen Prozess wird der Kollaps der Replikationsgabel verhindert [78].
Der Umbau der Replikationsgabel bietet einerseits Schutz vor einem Kollaps, andererseits kann sie in dieser Form durch die offenen Enden von Nukleasen degradiert werden. Deshalb werden die offenen Enden der viergliedrigen Replikationsgabel unter Beteiligung von BRCA2 und PALB 2 von RAD51 gebunden [91, 92]. Die RAD51- Nukleofilamente werden von Faktoren der HR wie BRCA1, BRCA2 und RAD51C sowie den Faktoren des Fanconi Anämie (FA) Reparaturwegs FANCD2 (Fanconi Anemia Complementation Group D2), FANCB (Fanconi anemia group B) und BOD1L (Biorientation Of Chromosomes In Cell Division 1 Like 1) stabilisiert. Auch PARP1 ist daran beteiligt [78]. Durch die Stabilisierung der RAD51 Nukleofilamente ist die Replikationsgabel vor nukleolytischer Degradation durch MRE11 und DNA2 geschützt [77, 78, 93].
Nach der Reparatur der Läsion kann durch limitierte, kontrollierte Resektion der regressierten Replikationsgabel unter Beteiligung der Helikase WRN der HR-vermittelte Neustart der Replikationsgabel eingeleitet werden. Dies kann auch durch Branch Migration passieren (Vgl. Abb. 1.6) [78].
In Zellen mit Defekt in BRCA1, BRCA2 und FANCD2 wurde bereits beobachtet, dass Replikationsgabeln nach Behandlung mit dem Replikationsinhibitor HU durch unkontrollierte Aktivität von MRE11 degradiert wurden, was zu genomischer Instabilität führte. Bei einem Defekt von BRCA2 konnte eine Überexpression von RAD51 diesen Defekt kompensieren [77]. Degradierte Replikationsgabeln können von Mus81/Eme1 zu einer broken fork konvertiert werden, was eine Reparatur über den mutagenen BIR Reparaturweg der HR notwendig macht [78]. Es konnte auch gezeigt werden, dass kollabierte Replikationsgabeln unabhängig von der HR durch RAD51 neu gestartet werden können [94].
1.7 Bedeutung der Expression von RAD51 und CHK1 im TNBC
In mehreren Studien wurde die Bedeutung der Expression RAD51 und CHK1 im TNBC untersucht. Dabei wurde zumeist die Erhöhung einer dieser beiden Faktoren untersucht, seltener die simultane Überexpression beider Faktoren. In der Arbeit von Rodriguez (2010) [95] wurde bei der Analyse der mRNA-Expression von 174 TNBC-Tumorproben gezeigt, dass sowohl RAD51 als auch CHK1 in TNBCs mit HR-Defekt signifikant stärker exprimiert wurden, als in TNBCs ohne HR-Defekt (p< 0,001). Die Patientinnen zeigten interessanterweise ein besseres Ansprechen auf eine Therapie mit Anthracyclinen und ein schlechteres Ansprechen auf Taxane. In der Arbeit von Verlinden (2007) [96] zeigte die Analyse der mRNA-Expression von 103 Tumorproben des Mammakarzinoms, dass CHK1 in Tumoren mit Grad 3 in TNBCs signifikant stärker exprimiert werden, als den Grad 3 Tumoren der anderen Subtypen (p< 0,0001). In der Arbeit wurden keine Angaben zur Prognose gemacht, es konnte aber schon
Stabilisierung der Replikationsgabel „Chicken foot“ Neustart der Replikationsgabel Angehaltene
Replikationsgabel
Abbildung 1.6: Stabilisierung- und Neustart angehaltener Replikationsgabeln (modifiziert nach Liao et al., 2018
[78]).
Die Replikationsgabel wird zunächst durch RPA stabilisiert und über ATR/ATRIP CHK1 aktiviert, was den Intra-S-Phase Kontrollpunkt auslöst. RPA wird gegen RAD51 ausgetauscht, die Nukleofilamente durch „Fork Protectors“ stabilisiert und vor Nukleasen geschützt. Mittels HR oder Branch-Migration wird die Replikationsgabel neu gestartet und der Schaden („STOP“) entfernt. Der Prozess ist im Text detailliert erläutert. ATRIP: ATR interacting protein; ATR: Ataxia talangiectasia and rad3 related; BRCA1: Breast Cancer 1; BRCA2: Breast Cancer 2; CHK1: Checkpoint Kinase 1; RPA: Replikationsprotein A
HR
Branch- Migration
von anderen gezeigt werden, dass beim TNBC die Größe des Tumors mehr als bei allen anderen Subtypen mit einer negativen Prognose korrelierte [16]. In der Arbeit von Albiges (2014) [97] wurde beim Vergleich der mRNA-Expression von 522 Mammakarzinomen ebenfalls eine erhöhte Expression von CHK1 in basal-artigen Tumoren gemessen.
Hinsichtlich der Expression von RAD51 zeigen die Studien eine Assoziation zwischen RAD51-Expression und Metastasierung. In der Studie von Alshareeda (2016) [98] konnte bei der immunhistochemischen Analyse der RAD51-Expression in 1184 Mammakarzinomen gezeigt werden, dass die Expression von RAD51 im Cytoplasma mit der Größe des Tumors, Tumorgrad, Metastasierung und dem Triple-negativen Subtyp assoziiert war. Die Expression von RAD51 im Cytoplasma, die mit dem Triple-negativen Subtyp assoziiert war, führte zu einer negativen Prognose für das Patientenüberleben. Auch in der Arbeit von Woditschka (2014) [99] konnte eine Assoziation zwischen RAD51-Expression und Metastasierung im TNBC gezeigt werden. Bei Vergleich der mRNA-Expression mehrerer DNA-Reparaturgene von Primärtumor mit dazugehöriger Hirnmetastase wurde eine deutlich stärkere Expression von RAD51, CHK1 und weiterer an der HR beteiligter Gene in den Hirnmetastasen gefunden. In der Arbeit von Wiegmans (2014) [100] wurde bei der immunhistochemischen Analyse von 235 sporadischen Mammakarzinomen ebenfalls eine Assoziation zwischen RAD51-Expression und Metastasierung festgestellt. Leider wurde in dieser Studie nicht zwischen den Subtypen des Mammakarzinoms unterschieden.
Insgesamt zeigen die Studien, dass eine gesteigerte Expression von RAD51 und CHK1 in TNBCs für die Prognose von Bedeutung ist und mehrheitlich mit erhöhter Metastasierung assoziiert wird. Somit benötigen TNBC-Patientinnen mit einer Überexpression einer dieser beiden Faktoren möglicherweise eine spezifische Therapie.
1.8 Das MDA-231 Zellsystem
Die MDA-MB-231 (MDA-231) Zelllinie wurde von Cailleau (1974) [101] etabliert. Sie stammt aus einem Pleuraerguss einer 51-jährigen Patientin mit metastasiertem Mammakarzinom. Die MDA-231 ist eine hoch aggressive, sehr invasive und gering ausdifferenzierte Triple-negative Zelllinie [102]. Sie exprimiert Marker der EMT und zeigt einen stammzellartigen Phänotyp mit einem hohen Anteil von Zellen mit der für Tumorstammzellen des Mammakarzinoms typischen Expression von Oberflächenmarkern (CD44highCD24low) [103]. Sie ist ein gut etabliertes Modellsystem zur Untersuchung von Metastasen, da sie im Mausmodell systemisch in Knochen, Gehirn und Lunge metastasiert [104]. Eine einzigartige Besonderheit dieser Zelllinie ist, dass von ihr isogene Subklone hervorgebracht wurden, die im Mausmodell nicht systemisch, sondern nach Formierung des Primarius ausschließlich gewebespezifisch in Knochen oder Gehirn metastasieren [104, 105]. Die MDA-231 BR, die ausschließlich ins Gehirn metastasiert, wurde von Yoneda (2001) [104] etabliert, indem die MDA-231 ins Herz von Mäusen injiziert- und Zellen der Hirnmetastasen entnommen- und wieder in Kultur gebracht wurden. Dies wurde mehrfach wiederholt, bis die Inokulation des selektierten Klons ausschließlich einen Primarius- und eine Hirnmetastase im Mausmodell hervorbrachte. Die MDA-231 SA, die im Mausmodell einen Primarius- und ausschließlich Knochenmetastasen hervorbringt, wurde von Pollari (2011) [105] etabliert. Hierbei ist beschrieben, dass dieser
Subklon der MDA-231 spontan aus einer in vitro Kultur hervorgegangen ist ohne weitere Selektion. Die Gewebespezifität wurde im Mausmodell demonstriert.
1.9 Ziele der Arbeit
Triple-negative Mammakarzinome zeichnen sich durch einen Defekt im DNA-DSB-Reparaturweg Homologe Rekombination und einen erhöhten Anteil von Tumorstammzellen aus [16, 32, 38]. Ein Defekt in der HR kann sich auf ihre wichtigsten Funktionen auswirken: die Reparatur zwei-endiger DSBs, die Reparatur ein-endiger DSBs und die Stabilisierung von Replikationsgabeln. Bis dato ist unklar, wie sich ein HR-Defekt auf die wichtigsten Funktionen der HR auswirkt und welche Rolle die DNA-Schadensantwort der S-Phase (S-Phase Schadensantwort) dabei spielt. Auch die Bedeutung eines Tumorstammzellphänotyps für die Therapie des TNBCs ist nicht endgültig geklärt. In dieser Arbeit sollen folgende Fragestellungen beantwortet werden:
• Wie wirkt sich ein HR-Defekt auf die einzelnen Funktionen der HR aus? • Welche Rolle spielt dabei die S-Phase Schadensantwort?
• Welche Bedeutung hat der Anteil von Tumorstammzellen im TNBC für die Therapieresistenz?
Diese Fragestellungen wurden in einem isogenen Zellsystem, bestehend aus drei Triple-negativen Zelllinien, untersucht. Zum Vergleich diente eine Zelllinie des luminalen Subtyps.
2. Material und Methoden
In diesem Abschnitt werden die verwendeten Materialen und Methoden beschrieben. Im Materialteil werden die verwendeten Zelllinien beschrieben und es folgt eine Auflistung aller verwendeten Plasmide, Chemikalien, Antikörper, Verbrauchsmaterialien, Geräte, Kits und eine Zusammenstellung der verwendeten Puffer und Lösungen. Im Methodenteil werden die Versuchsprotokolle und -prinzipien erklärt.
2.1. Material
2.1.1 Zelllinien
Es wurde mit vier Brustkrebszelllinien gearbeitet, drei davon Triple-negativ und isogen sowie eine luminale Zelllinie, die als Vergleichszelllinie diente.
Tabelle 2.1 Übersicht über die verwendeten Tumorzelllinien
Zelllinie Ursprung Subtyp Etabliert von
MDA-MB-231 Pleuraerguss TNBC Cailleau et al., 1974 [101] MDA-MB-231 BR Hirnmetastase (Xenograft), TNBC Yoneda et al., 2012 [104]
induziert von MDA-MB 231
MDA-MB-231 SA Abgeleitet von TNBC Pollari et al., 2011 [105] MDA-MB-231 (Zellkultur)
MCF7 Pleuraerguss Lum A Soule et al., 1973 [106]
2.1.2 Plasmide
Zur Bestimmung der der HR-Kapazität wurde der Plasmid-Rekonstruktionsassay verwendet, bei dem die in der Tabelle aufgelisteten Plasmide verwendet wurden.
Tabelle 2.2: Eingesetzte Plasmide
Plasmid Erhalten von Größe Resistenz
pEGFP-N1 Addgene #6085-1 4733 bp Kanamycin, Ampicillin MSCV-N EBNA1 Addgene #37954 8585 bp Ampicillin
pDRGFP Addgene #26475 8646 bp Ampicillin DR-oriP-GFP M. Jasin Lab 10346 bp Ampicillin
Nakanishi et al.,
2011 [107]
2.1.3 Antikörper
Die verwendeten Antikörper, inklusive Hersteller, Verdünnung und Verwendung sind in der folgenden Tabelle 2.3 aufgelistet. Alle Antikörper, die im Western-Blot eingesetzt wurden,
wurden in Odyssey Blocking Buffer (Li-Cor, Nebraska, USA) angesetzt. Für die Immunfluoreszenz wurden die Antikörper in Waschlösung 1 angesetzt (siehe Tabelle 2.12, „Angesetzte Lösungen“). Im DNA-Fiber-Assay wurde wurden die Antikörper in Blockierlösung angesetzt (siehe Tabelle 2.14, „Angesetzte Lösungen“)
Tabelle 2.3: Verwendete Erstantikörper für die Detektion im Western-Blot
Antikörper Hersteller Nummer Verwendung
Anti-ß-Actin, Maus, Sigma-Aldrich,
# A-2228 1:20000, 4°C über Nacht
monoklonal Steinheim
Anti-ALDH1A1 (A-6), Maus, Santa Cruz Biotechn., #
sc398578
1:1000, 4°C über Nacht
monoklonal Heidelberg
Anti-ATR (N-19), Ziege, Santa Cruz Biotechn.,
# sc1887 1:1000, 4°C über Nacht
polyklonal Heidelberg
Anti-BRCA2 (2-A9), Maus, Steven Smith,
1:500, 4°C über Nacht
monoklonal H. Pospiech Lab, Jena
Anti-CHK1 (2G1D5), Maus, Cell Signaling
Techn.®, # 2360 1:750, 4°C über Nacht
monoklonal Denver, USA
Anti-E-Cadherin (H-108), Maus, Santa Cruz Biotechn.,
# sc8426 1:1000, 4°C über Nacht
monoclonal Heidelberg
Anti-FANCD2 (FI17), Maus, Santa Cruz Biotechn.,
# sc20022 1:2000, 4°C über Nacht
monoklonal Heidelberg
GAPDH (FL335), Kaninchen, Santa Cruz Biotechn.,
# sc25778 1:4000, 4°C über Nacht
polyklonal Heidelberg
HSC70, Maus, Santa Cruz Biotechn.,
# sc7298 1:1000, 4°C über Nacht
monoklonal Heidelberg
Anti-PARP1 (C2-10), Maus, BD Biosciences,
# 556362 1:2000, 4°C über Nacht
monoklonal Heidelberg
Anti-pATR (Ser428), Kaninchen, Cell Signaling
Techn.®, # 2853S 1:1000, 4°C über Nacht
monoklonal Denver, USA
Anti-pCHK1 (Ser296), Kaninchen, Cell Signaling
Techn.®, # 2349S 1:1000, 4°C über Nacht
polyklonal Denver, USA
Anti-pRPA (S4/S8), Kaninchen, Bethyl, Montgomery, # A300-245A
1:1000, 4°C über Nacht
polyklonal Texas, USA
Anti-RAD51 (14B4), Maus, Genetex, Hsinchu
City, #
GTXX0230
1:1000, 4°C über Nacht
monoklonal Taiwan
Anti-RPA32, mouse, Steven Smith,
1:3, 4°C über Nacht
monoklonal H. Pospiech Lab, Jena
Anti-Vimentin (D21H3), Kaninchen, Cell Signaling
Techn.®, # 5741 1:1000, 4°C über Nacht
