Die Bedeutung des Tumorstammanteils in TNBC-Zelllinien

zur mesenchymalen Transition (EMT) beruht dabei auf der Funktion von ZEB1 als Transkriptionsfaktor, der unter anderem an den Promotor des E-Cadherin-codierenden Gens bindet und dessen Expression unterdrückt [185]. In der vorliegenden Arbeit zeigten die TNBC-Zelllinien mit hoher Expression von ZEB1 eine im Vergleich zur MCF7 deutlich höhere Migrationskapazität. Dies ist im Einklang mit einer anderen Arbeit, in der eine deutliche Assoziation zwischen der ZEB1-Proteinexpression und Migration gezeigt werden konnte.

Dabei führte ein knockdown von ZEB1 in der MDA-MB-231 zu einer starken Expression von E-Cadherin und einer deutlichen Reduktion der Migrationsfähigkeit [186].

Die hohe Expression von Stammzellmarkern in den TNBC-Zelllinien konnte auf einen hohen Anteil von Tumorstammzellen zurückgeführt werden, der durch Bestimmung der ALDH1-Aktivität erfasst wurde. Dies wird von den Ergebnissen einer anderen Arbeit bestätigt, in der ebenfalls gezeigt werden konnte, dass Mammakarzinomzellinien mit erhöhter ALDH1-Aktivität einen erhöhten Tumorstammzellanteil aufwiesen [40]. Der große Unterschied bei der ALDH1-Aktivität der MCF7 und der MDA-MB-231 wurde ebenfalls bereits beobachtet und unterstützte die Beobachtungen dieser Arbeit [187]. Es konnte in der MDA-MB-231 bereits gezeigt werden, dass jene Zellen mit hoher ALDH1-Aktivität auch die Oberflächenmarker exprimierten, die für Tumorstammzellen des Mammakarzinoms charakteristisch sind (CD44^high/CD24^low). Nach Selektionierung dieser Zellen zeigten sie im Vergleich zu den Zellen mit geringer ALDH1-Aktivität in vitro eine deutlich gesteigerte Proliferation, Klonogenität und Migration, was die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weiter unterstützt [187].

Interessanterweise zeigten die TNBC-Zelllinien mit hoher ALDH1-Aktivität auch eine deutlich höhere Klonogenität als die luminale Zelllinie. Dies wird von den Beobachtungen einer anderen Arbeit unterstützt, in der beim Vergleich von Mammakarzinomzelllinien gezeigt werden konnte, dass die ALDH1-Aktivität mit der Klonogenität korrelierte [122]. Daraus wurde gefolgert, dass die Klonogenität die Anzahl von Tumorstammzellen im 2D-Modell abbildete.

Zusammenfassend konnte mit den eingesetzten Methoden gezeigt werden, dass die eingesetzten, isogenen TNBC-Zelllinien einen höheren Tumorstammzellanteil aufwiesen als die luminale MCF7. Dabei ging die gesteigerte Proteinexpression von Stammzellmarkern, bzw.

deren gesteigerte Aktivität mit einer erhöhten Migration und Klonogenität einher. Eine hohe Tumorstammzellpopulation somit auch in dem untersuchten, Triple-negativen Zellsystem von Bedeutung, wie es auch für TNBCs in vivo beschrieben wurde [23, 38]. In Patientenstudien konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Mammakarzinome mit einer hohen Expression von ZEB1 oder ALDH1, somit einem hohen Anteil von Tumorstammzellen, mit einer schlechten Prognose für die Patientinnen assoziiert ist [40, 42].

4.3.2 Die Bedeutung des Tumorstammzellanteils für die Therapieresistenz in vitro

Tumorstammzellen wird generell eine erhöhte Resistenz gegen Radio- und Chemotherapie in vivo und in vitro zugesprochen [42, 46, 48, 120]. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein erhöhter Anteil von Tumorstammzellen zu einer erhöhten Therapieresistenz in TNBC-Zelllinien führte.

In der vorliegenden Arbeit zeigte sich kein klarer Zusammenhang zwischen Tumorstammzell-Anteil und Resistenz gegen Chemotherapeutika oder Bestrahlung. Dies steht anderen Arbeiten entgegen, in denen mehrheitlich eine erhöhte Resistenz gegen Agenzien und Bestrahlung in Zellpopulationen mit hohem Tumorstammzellanteil zeigen konnten.

So konnte Zhang (2014) [42] für den Stammzellmarker ZEB1 einen EMT-unabhängigen Mechanismus zeigen, der zur Strahlenresistenz in einer TNBC-Zelllinie führte. Dabei wurde beobachtet, dass wiederholt bestrahlte TNBC-Zelllinien eine gesteigerte Proteinexpression von ZEB1 aufwiesen. Es wurde gezeigt, dass ZEB1 nach Bestrahlung durch ATM phosphoryliert wurde und über USP7 (Ubiquitin-specific-processing protease 7) zur Deubiquitinierung und somit zur Stabilisierung von CHK1 führte. Diese Interaktion führte zu einer geringeren Anzahl von DSBs nach Bestrahlung. In der vorliegenden Arbeit korrelierte die ZEB1-Proteinexpression hochsignifikant mit der CHK1-Proteinexpression (p< 0,0001, Vgl. Abb. 3.21 B) und zeigte somit eine mögliche Verbindung zwischen Stammzellanteil und S-Phase-Schadensantwort. Die Expression von ZEB1 bzw. CHK1 korrelierte in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht mit der Strahlenempfindlichkeit (Vgl. Abb. 3.6 B). Die MDA-MB-231 SA mit der höchsten Proteinexpression dieser beiden Faktoren war deutlich strahlenempfindlicher als die MDA-MB-231. Somit stehen die Ergebnisse dieser Arbeit der Arbeit von Zhang (2014) [42] entgegen.

Möglicherweise ist dieser Mechanismus erst nach mehrfacher Bestrahlung von Bedeutung. In einer weiteren Arbeit wurde gezeigt, dass Mammakarzinomzelllinien mit erhöhtem Anteil von Tumorstammzellen, wie die MDA-MB-231, ausgesprochen resistent gegen Olaparib-Behandlung waren und diese Resistenz durch die erhöhte Expression von RAD51 in den Tumorstammzellen vermittelt wurde [51]. In der vorliegenden Arbeit korrelierte die Olaparib-Empfindlichkeit (Vgl. Abb. 3.6 A) weder mit der Expression von RAD51 (Vgl. Abb. 3.1) noch mit dem Anteil von Tumorstammzellen. Die MDA-MB-231 war in dieser Arbeit ausgesprochen resistent gegen Olaparib, die MDA-MB-231 BR und -SA trotz höherer RAD51-Expression und vergleichbarem Tumorstammzellanteil jedoch deutlich empfindlicher. Auch die zelluläre Empfindlichkeit gegen Cpt und MMC korrelierte in der vorliegenden Arbeit nicht mit dem Anteil von Tumorstammzellen (Vgl. Abb. 3.5 & 3.7). Die besondere Bedeutung von CHK1 für die Therapieresistenz in der vorliegenden Arbeit nur teilweise bestätigt werden. In zwei der drei TNBC-Zelllinien führte eine ausgeprägte Phosphorylierung von CHK1 zur Resistenz gegen MMC (Vgl. Abschnitt 4.2).

Insgesamt sind diese Beobachtungen möglicherweise auf das eingesetzte Zellsystem zurückzuführen. Die MDA-MB-231 BR und –SA wurden hinsichtlich ihres Metastasierungsmusters aus der MDA-MB-231, die im Mausmodell systemisch metastasiert, selektioniert [104, 105]. Das bedeutet, dass bestimmte Subklone der MDA-MB-231 selektioniert wurden, die eine intrinsisch erhöhte Empfindlichkeit gegen bestimmte DNA-Schäden aufweisen. So zeigte die MDA-MB-231 BR trotz hohem Anteil von Tumorstammzellen eine insuffiziente Aktivierung von CHK1 nach MMC-Schädigung, einem Faktor, der für Tumorstammzellen so bedeutend ist. In Tumoren kann die Stammzellpopulation ebenfalls heterogen sein und sich in ihren Empfindlichkeiten gegen bestimmte DNA-Schädigungen unterscheiden [188].

4.3.3 Steigerung des Tumorstammzellanteils durch widerholte Bestrahlung

Durch wiederholte Bestrahlung sollte der Anteil von Tumorstammzellen in den Zellpopulationen erhöht werden (Vgl. Abb. 3.25). Es wurde davon ausgegangen, dass durch Bestrahlung die nicht-Tumorstammzellen abgetötet werden, während Tumorstammzellen durch erhöhte Therapieresistenz die Behandlung überlebten und teilungsfähig blieben.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die durch hypofraktionierte Bestrahlung generierten RR-Klone eine deutlich höhere Strahlenresistenz aufwiesen als ihre isogenen, parentalen Zelllinien. Eine Steigerung der Strahlenresistenz nach fraktionierter Bestrahlung wurde in den Zelllinien MDA-MB-231 und der MCF7 bereits beobachtet. In der Arbeit ging die Zunahme der Strahlenresistenz mit einer Steigerung des Tumorstammzellanteils und einer Steigerung der Invasions- und Migrationskapazität sowie einer erhöhten Expression mesenchymaler Faktoren einher [189]. Dies wies sehr deutlich darauf hin, dass die Zunahme der Strahlenresistenz in der vorliegenden Arbeit ebenfalls auf eine Erhöhung des Anteils von Tummorstammzellen zurückzuführen war. In einer weiteren Arbeit wurde nach wiederholter Bestrahlung eine Steigerung der Strahlenresistenz und der Stammzellpopulation in TNBC-Zelllinien mit einer deutlichen Steigerung der ZEB1-Expression beobachtet [42]. Daraus wurde gefolgert, dass Bestrahlung nicht nur Tumorstammzellen selektioniert, sondern zu einer Reprogrammierung von nicht Tumorstammzellen zu Tumorstammzellen durch Induktion der EMT führte. Eine weitere Arbeit konnte dies in Tumorproben des Mammakarzinoms ebenfalls zeigen, dabei wurde eine Dedifferenzierung bereits ausdifferenzierter Tumorzellen nach Bestrahlung zu stammzellartigen Tumorzellen mit gesteigerter ALDH1-Aktivität und Expression von Stammzellfaktoren wie OCT4 und SOX2 beobachtet [50].

In einigen Arbeiten wurden bereits Resistenzmechanismen von Tumorstammzellen beschrieben, die auch in den radioresistenten Klonen der vorliegenden Arbeit von Bedeutung sein könnten. Die Arbeiten wiesen insgesamt darauf hin, dass vor allem eine verbesserte DNA-Schadensantwort für die Strahlenresistenz von Tumorstammzellen von besonderer Bedeutung ist. In einer der ersten Arbeiten zeigten Glioblastomzellen nach Bestrahlung eine Erhöhung des Tumorstammzellanteils und eine deutlich gesteigerte Strahlenresistenz, die auf eine deutlich stärkere Phosphorylierung von CHK1 zurückgeführt wurde [48]. Die stärkere Aktivierung von CHK1 in Tumorstammzellen nach Bestrahlung wurde in weiteren Arbeiten bestätigt [120, 121] Auch im Mammakarzinom konnte durch die Interaktion von ZEB1 und CHK1 nach Bestrahlung eine besondere Bedeutung von CHK1 in Tumorstammzellen gezeigt werden [42]. Neben der DNA-Schadensantwort spielen auch indirekte Ursachen für die Strahlenresistenz eine Rolle. In Tumorstammzellen des Mammakarzinoms wurde beobachtet, dass diese eine erhöhte Expression von Genen aufwiesen, die den Radikalfängern zugeordnet werden. Dadurch hatten sie endogen- und nach Bestrahlung weniger DNA-Schäden [46].

Zusammengefasst weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und anderer Arbeiten darauf hin, dass die Zunahme der Strahlenresistenz auf eine Erhöhung des Anteils strahlenresistenter Tumorstammzellen in den radioresistenten Klonen zurückzuführen ist.

Weitere Arbeiten weisen darauf hin, dass die Strahlenresistenz von Tumorstammzellen mit geringerem oxidativen Stress- und einer verbesserten Aktivierung der DNA-Schadensantwort, insbesondere CHK1, assoziiert ist.

4.3.4 Konklusion

Bezogen auf die Tumortherapie ist die Selektionierung von therapieresistenten Tumorstammzellen oder die strahleninduzierte Dedifferenzierung von nicht-Tumorstammzellen durch fraktionierte Strahlentherapie, wie sie nach Tumorresektion bei TNBC-Patientinnen angewendet wird, verheerend und eine Entschlüsselung ihrer

Resistenzmechanismen von großer Bedeutung für eine zielgerichtete Therapie. Die Generierung von Tumorstammzellen scheint dabei vor allem auf hohe genomische Instabilität und Schädigung der DNA zurückzuführen sein. So konnte in der Arbeit von Wang (2016) [190]

gezeigt werden, dass die Depletion essenzieller Faktoren der HR wie BRCA1, FANCD2 oder BRG1 in Brustepithelzellen, zu einer Dedifferenzierung und einem mesenchymalen- und stammzellartigen Phänotyp führten. Auch eine kontinuierliche Behandlung mit Cisplatin führte zur Dedifferenzierung und zu einem Tumorstammzellphänotyp. Interessanterweise zeigten die in der vorliegenden Arbeit untersuchten TNBC-Zelllinien, die einen hohem Anteil von Tumorstammzellen aufwiesen, auch eine Überexpression von RAD51 und CHK1, das in vivo mit erhöhter genomischer Instabilität, erhöhter Metastasierung und einer schlechten Prognose in Verbindung gebracht wird [98, 100, 138, 191]. Somit ist die schlechte Prognose bei RAD51 und CHK1-Überexpression möglicherweise auch auf einen erhöhten Tumorstammzellanteil zurückführbar. Wobei es paradox erscheint, dass Tumorstammzellen durch genomische Instabilität entstehen und dennoch über eine effiziente DNA-Reparatur verfügen, auf die sie für ihre Funktionen, wie Selbsterneuerung, angewiesen sind. Dabei zeigen mehrere Arbeiten, dass die Therapieresistenz von Tumorstammzellen unter anderem auf eine verstärkte Aktivierung der DNA-Schadensantwort zurückzuführen ist. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen ist eine Verwendung von Inhibitoren der DNA-Schadensantwort möglicherweise der richtige Ansatz, um diese Zellen gegen Agenzien und Bestrahlung zu sensibilisieren. In dieser Arbeit konnten MMC-resistente, TNBC-Zelllinien mit hohem Tumorstammzellanteil durch die Inhibition von CHK1 deutlich gegen MMC sensibilisiert werden. Somit könnte die Inhibition von CHK1 oder seiner untergeordneten Faktoren wie CDC25 oder CDK2 ein möglicher Ansatzpunkt zur Therapieintensivierung im TNBC sein und sollte in weiteren Experimenten, u.a. an den in der vorliegenden Arbeit generierten, radioresistenten Klonen experimentell überprüft werden.