Auswirkungen der Inhibition von CHK1 auf die Zellzyklusverteilung

Die Inhibition von CHK1 wirkte sich auf replikativer- und zellulärer Ebene nur auf die MMC-resistenten Zelllinien aus (Vgl. Abb. 3.16, 3.17 & 3.18). Es war im Folgenden von Interesse ob sich dies in der Zellzyklusverteilung abbildete. Die Aktivierung von CHK1 führt zu einer Akkumulation von Zellen in der S- oder G2-Phase des Zellzyklus [60]. Die MMC-empfindlichen Zelllinien zeigten geringe Aktivierung von CHK1 nach MMC-Behandlung (Vgl. Abb. 3.11), deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Inhibition von CHK1 bei den MMC-empfindlichen Zelllinien nur geringen Einfluss auf die Zellzyklusverteilung hat, während dies bei den MMC-resistenten Zelllinien zu einer deutlichen Verschiebung des Zellzyklus mit geringerem S-/G2- und erhöhtem G1-Anteil führen sollte.

Abbildung 3.18: Anzahl von Zellen mit kernweiten γH2AX-Signal nach Behandlung mit MMC und MK8776.

(Links): Exponentiell wachsende Zellen wurden zwei Stunden vor Schädigung mit MK8776 (2 µM) inkubiert und für eine Stunde mit 0,5µg/ml MMC behandelt. Die Färbung erfolgte mit spezifischen Erst- und fluoreszenzgekoppelten Zweitantikörpern 24 Stunden nach Schädigung DAPI diente zur Darstellung des Zellkerns. Dargestellt sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Experimente. Der Fehler ist der Fehler des Mittelwertes. Statistisch relevante Abweichungen: * p < 0,05; ** p < 0,01 (Student’s t-Test). Rechts:

exemplarische Bilder der Immunfluoreszenzaufnahmen, die Pfeile markieren Nuklei mit kernweitem γH2AX-Signal.

5 10 15 20

Zellen mit kernweitem yH2AX Signal, %

MMC +

MK8776 +

-+ -+

+ -

-+

-+ + -

-+

-+ + -

-+

-MCF7

MDA-231 BR

MDA-231 WT

MDA-231 SA + +

+ +

**

*

**

*

**

**

**

**

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

MMC- empfindlich

MMC- resistent

γH2AX DAPI

Abb. 3.19 zeigt die prozentuale Verteilung der Zellzyklusphasen nach Behandlung mit MK8776, MMC oder Kombinationsbehandlung. Bei den MMC-empfindlichen zeigte die MCF7 nach Behandlung mit MK8776 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine deutliche Zunahme der G1 Fraktion von 60,0 ± 1,3 % auf 75,1 ± 3 % unter gleichzeitiger Abnahme der S-Phase Fraktion von 20,3 ± 0,3 % auf 14,7 ± 3,0 % und der G2-Fraktion von 19,4 ± 1,4 % auf 10,1

± 0,5 %. Nach alleiniger Behandlung mit MMC zeigte sich im Vergleich zur Kontrolle hingegen eine deutliche Abnahme der G1-Fraktion von 60 ± 1,3 % auf 15,9 ± 0,2 %. Die Fraktion der S-Phase-Zellen nahm hingegen deutlich zu von 20,3 ± 0,3 % auf 43,4 ± 1,0 %, auch der Anteil der G2-Phase-Zellen nahm deutlich zu von 19,4 ± 1,4 % auf 40,6 ± 0,8 %. Die Kombinationsbehandlung zeigte eine deutlich abweichende Verteilung im Vergleich zur alleinigen MMC-Behandlung mit deutlich erhöhter G1-Fraktion von 15,9 ± 0,2 % auf 40,6 ± 0,1

%, jedoch noch immer geringer als in der unbehandelten Kontrolle oder nach alleiniger Behandlung mit MK8776. In der MDA-MB-231-BR verhielt es sich ähnlich, auch hier zeigte die Behandlung mit MK8776 im Vergleich zur Kontrolle eine deutliche Verschiebung des Zellzyklus mit einer deutlichen Zunahme der G1-Fraktion von 43,4 ± 0,1 % auf 66,7 ± 4,5 %, geringer Reduktion der S-Phase-Fraktion von 34,5 ± 4,6 % auf 26,9 ± 3,2 % und deutlicher Reduktion der G2-Phase-Fraktion von 22,2 ± 4,5 % auf 6,4 ± 1,3 %. Die Behandlung mit MMC führte im Vergleich zur Kontrolle zu einer gänzlich anderen Verteilung mit deutlicher Reduktion der G1-Fraktion von 43,4 ± 0,1 % auf 13,7 ± 0,8 %. In der S-Phase-G1-Fraktion zeigte sie nach MMC-Behandlung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle hingegen keine Veränderung mit 34,5

± 4,6 % zu 35,3 ± 1,1 %, jedoch eine deutliche Zunahme der G2-Fraktion von 22,2 ± 4,6 % auf 51,1 ± 0,3 %. Die Kombinationsbehandlung wirkte sich im Vergleich zur alleinigen MMC-Behandlung deutlich aus mit einer deutlichen Zunahme der G1-Fraktion von 13,7 ± 0,8 % auf

0 50 100

Zellzyklusverteilung, % G1

G2 S MCF7

MMC MK8776

+ + -

-- + -+

WT

+ + -

-- + -+ BR

+ + -- +

-+

SA

+ + -- +

-+

MMC-empfindlich MMC-resistent

Abbildung 3.19: Zellzyklusverteilung in MMC-empfindlichen und –resistenten Zellen.

Exponentiell wachsende Zellen wurden für zwei Stunden mit 2µM MK8776 behandelt, gefolgt von einer Stunde 1,5 µg/ml MMC. 24 Stunden nach Schädigung wurden die Zellen fixiert, die DNA mit Propidiumiodid markiert und die Zellzyklusphase anhand des DNA Gehalts im Durchflusszytometer bestimmt. Dargestellt sind die Anteile der Zellen in der G1- (grau), S- (weiß) und G2- (hellgrau) Phase; es handelt sich um Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten. Fehler sind Mittelwerte + SEM.

51,3 ± 8,0 %, jedoch immer noch geringer als in der unbehandelten Kontrolle oder nach alleiniger Behandlung mit MK8776. In der S-Phase-Fraktion zeigte sich keine Veränderung, hier betrug der Unterschied 35,3 ± 1,1 % zu 32,1 ± 3,3 %. Ein deutlicher Unterschied zeigte sich nach Kombinationsbehandlung im Vergleich zur alleinigen MMC-Behandlung in der G2-Fraktion von 51,1 ± 0,3 % zu 16,6 ± 4,7 %. Bei den MMC-resistenten waren ebenfalls deutliche Unterschiede festzustellen. Die MDA-MB-231 zeigte nach Behandlung mit MK8776 im Vergleich zur Kontrolle eine moderate Abnahme der G1-Fraktion von 54,8 ± 0,2 % zu 61,5 ± 0,2 %. Auch der Anteil der S-Phase-Fraktion nahm nur moderat ab von 26,1 ± 2,8 % auf 26,9 ± 3,2 %, wie auch der Anteil der G2-Phase Zellen von 19,1 ± 2,2 % auf 16,8 ± 1,0 %. Durch die Behandlung mit MMC machte sich eine deutlichere Verschiebung in der Zellzyklusverteilung im Vergleich zur Kontrolle bemerkbar, der Anteil der G1-Fraktion reduzierte sich von 54,8 ± 0,6 % auf 26,0 ± 0,8 %, während der Anteil der S-Phase-Zellen deutlich erhöhte von 26,1 ± 2,8

% auf 45,0 ± 1,8 %. Auch bei in der G2-Fraktion war im Vergleich zur Kontrolle eine deutliche Zunahme zu verzeichnen von 26,1 ± 2,8 % auf 45 ± 1,8 %. Einen deutlichen Unterschied zur alleinigen MMC-Behandlung bewirkte die Kombinationsbehandlung mit einer deutlichen Zunahme der G1-Fraktion von 26,0 ± 0,8 % auf 54,1 ± 0,2 %. Die Fraktion der S-Phase-Zellen reduzierte sich im Vergleich deutlich von 45,0 ± 1,8 % auf 26,1 ±0,5 %, auch die G2-Fraktion reduzierte sich von 29,1 ± 2,6 % auf 16,7 ± 0,5 %. Bei der MDA-MB-231-SA zeigte die Behandlung mit MK8776 im Vergleich zur Kontrolle eine deutliche Zunahme der G1-Fraktion von 45,6 ± 0,7 % auf 64,9 ± 7,2 % bei gleichzeitiger, deutlicher Abnahme der Fraktion der S-Phase-Zellen von 41 ± 4,5 % auf 24,4 ± 2,4 %. Der Anteil der G2-S-Phase-Zellen reduzierte sich nur geringfügig von 13,4 ± 3,8 % auf 10,7 ± 4,8 %. Die Behandlung mit MMC führte im Vergleich zur Kontrolle ebenfalls zu einer deutlichen Verschiebung der Zellzyklusverteilung mit einer deutlichen Abnahme der G1-Fraktion von 45,6 ± 0,7 % auf 7,2 ± 0,5 %. Der Anteil der S-Phase-Zellen reduzierte sich ebenfalls deutlich von 41,0 ± 4,5 % auf 17,3 ± 1,2 %, Ein Extremer Anstieg war in der G2-Fraktion zu verzeichnen, hier stieg der Anteil von 13,4 ± 3,8 % auf 75,5

± 1,0 %. Einen deutlichen Unterschied zur Behandlung mit MMC bewirkte im Vergleich die Kombinationsbehandlung mit einer deutlichen Zunahme der G1-Fraktion von 7,2 ± 0,5 zu 46,1

± 0,5 %. Die Fraktion der S-Phase-Zellen war im Vergleich nur geringfügig höher mit 17,3 ± 1,2

% zu 23,3 ± 0,4 %. Der Anteil der G2-Phase Zellen veränderte sich hingegen deutlich von 75,5

± 1,0 % auf 30,0 ± 0,5 %.

Zusammenfassend zeigten sich nur geringe Unterschiede in der Zellzyklusverteilung nach der Inhibition von CHK1. Die Behandlung mit dem CHK1-Inhiitor MK8776 führte bei allen Zelllinien zu einer deutlichen Verschiebung des Zellzyklus. Nach alleiniger Behandlung mit MK8776 zeigten alle Zelllinien einen im Vergleich zur Kontrolle deutlich höheren Anteil von G1-Zellen bei gleichzeitiger Verringerung des Anteils der S- und G2-Phasezellen. Nach Kombinationsbehandlung mit MK8776 und MMC zeigte sich im Vergleich zur alleinigen MMC-Behandlung ebenfalls eine deutliche Verschiebung des Zellzyklus mit deutlicher Zunahme des G1-Phase-Anteils bei gleichzeitiger Verringerung des G2-Phase-Anteils und teilweise auch des S-Phase-Anteils. Die Hypothese, dass sich die Inhibition von CHK1 stärker auf die MMC-resistenten Zelllinien auswirkt, bestätigte sich somit nicht.

3.2.8 Auswirkung der Inhibition von CHK1 auf das Überleben nach MMC-Behandlung