3. Ergebnisse
3.1 Die Funktionen der Homologen Rekombination in TNBCs
3.1.1 Expression ausgewählter an DNA Reparatur und Zellzykluskontrolle beteiligter Proteine
Zunächst wurde überprüft, ob sich die Expression von DNA Reparaturproteinen in luminalen und Triple-negativen (TNBC) Tumorzelllinien unterscheiden. Dafür wurden Proteine der Basenexzisionsreparatur, des Fanconi-Anämie Reparaturweges, der HR und des Intra-S Phase Kontrollpunktes ausgewählt.
Abb. 3.1 zeigt die Expression von BRCA2, ATR, FANCD2, PARP1, CHK1 und RAD51.
BRCA2 zeigte ein heterogenes Expressionsmuster bei den Triple-negativen Zelllinien (TNBC-Zelllinien) mit hoher Expression in der MDA-MB-231 und MDA-MB-231-SA mit 1,8 ± 0,2 und 1,5 ± 0,2. Die MDA-MB-231 BR wies eine deutlich geringere Expression mit 0,8 ± 0,1 auf, die luminale Vergleichszelllinie eine dazwischen liegende Expression von 1,1 ± 0,2. ATR zeigte ebenfalls kein eindeutiges Expressionsmuster bei den TNBC-Zelllinien. Die Expression war in der Triple negativen MDA-MB-231 deutlich höher als in der MDA-MB-231 BR und -SA mit 1,4
± 0,2 zu 0,9 ± -0,2 und 1,0 ± -0,2. Die Expression in der luminalen Vergleichszelllinie war mit 1,0 ± 0,2 mit der Expression der TNBC-Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA vergleichbar.
FANCD2 zeigte ein heterogenes Expressionsmuster in den TNBC- Zelllinien mit sehr geringer Expression in der MDAMB231 mit 0,2 ± 0,1. Die beiden Subzelllinien MDAMB231 BR und
-SA zeigten dagegen eine etwas höhere Expression von jeweils 0,5 ± 0,2. Die luminale MCF7 zeigte dagegen eine deutlich stärkere Expression von 1,0 ± 0,2. Die PARP1 Expression zeigte keine deutlichen Unterschiede zwischen den drei TNBC- und der luminalen Zelllinie mit 1,0 ± 0,3 zu 1,1 ± 0,2 zu 1,3 ± 0,1 und 1,0 ± 0,2.
Auffallend war die deutlich stärkere Expression von CHK1 und RAD51 in den TNBC Zelllinien.
Die MDA-MB-231 zeigte für CHK1 eine Expression von 1,57 ± 0,1, die in den beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA noch einmal deutlich höher lag mit 3,5 ± 0,1 und 4,3 ± 0,2. Die Expression von CHK1 lag in der luminalen MCF7 deutlich darunter mit 1,1 ± 0,2. Für RAD51 verhielt es sich ähnlich mit einer Expression von 1,63 ± 0,2 in der MDA-MB-231 und 2,0
± 0,3 und 2,6 ± 0,2 in der MDA-MB-231 BR und -SA. Die RAD51-Expression der luminalen MCF7
Abbildung 3.1: Vergleich der Expression von Proteinen DNA Reparatur und Zellzykluskontrolle in luminalen- und Triple-negativen Mammakarzinomzelllinien
40 µg Protein exponentiell wachsender Zellen wurden separiert und mittels Western-Blot transferiert. Die Detektion der Proteine erfolgte mit spezifischen Primär- und floureszierender Zweitantikörper. ß-Aktin diente als Ladekontrolle. Zur Normierung diente ß-Aktin. Die Proteinexpression wurde auf die Expression der MCF7 normiert. Zur Quantifizierung wurden Daten dreier unabhängiger Experimente verwendet. Fehler sind Mittelwerte +SEM.
PARP1
lag deutlich darunter mit 1,1 ± 0,2. Somit zeigten die TNBC-Zelllinien eine deutlich stärkere Expression von RAD51 und CHK1 als die luminale Zelllinie.
3.1.2 Einfluss der Zellzyklusverteilung auf die Expression von RAD51 und CHK1
Die DNA Reparatur mittels HR findet hauptsächlich in der S- und G2-Phase des Zellzyklus statt und RAD51 und CHK1 werden zellzyklusabhängig hauptsächlich in der S-/G2-Phase exprimiert [114, 115]. Somit konnte die erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 möglicherweise auf Unterschiede in der Zellzyklusverteilung mit erhöhtem S-/G2-Phase Anteil in den TNBC Zelllinien sein. Deshalb wurden Zellzyklusanalysen für die vier Zelllinien durchgeführt.
Abb. 3.2 zeigt den prozentualen Anteil an G1, S- und G2-Phase für die drei TNBC-Zelllinien und die luminale Zelllinie. Der S-/G2-Phase-Anteil variierte um ca. 15 % zwischen allen untersuchten Zelllinien. Die MDA-MB-231 zeigte unter den TNBC-Zelllinien den geringsten Anteil S-/G2-Zellen von 45,2 ± 2,5 %, der in den beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA deutlich höher lag mit 56,7 ± 5,5 % und 54,4 ± 4,1 %. Die luminale MCF7 wies den geringsten Anteil von S-/G2-Zellen auf mit 39,7 ± 0,9 %. Dies deutete darauf hin, dass die erhöhte Expression von CHK1 und RAD51 zum Teil auf Zellzyklusverschiebungen zurückführbar gewesen sein könnte. Die Unterschiede in der Expression zwischen luminaler und den TNBC-Zelllinien von RAD51 war jedoch um 200 % - und von CHK1 um 300 % deutlich größer als die Unterschiede im Anteil der S-/G2-Zellen (Vgl. Abb. 3.2). Zusammenfassend zeigte sich basal ein erhöhter Anteil von Zellen in der S/G2-Phase in den beiden Zelllinien mit erhöhter CHK1 und RAD51 Expression, der Unterschied bei der Expression war dennoch deutlich größer als die Unterschiede im Zellzyklus.
Abbildung 3.2: Vergleich der Zellzyklusverteilung in der luminalen- und den Triple-negativen Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden fixiert, die DNA mit Propidiumiodid markiert und die Zellzyklusphase anhand des DNA Gehalts im Durchflusszytometer bestimmt. Dargestellt sind die Anteile der Zellen in der G1- (grau), S- (weiß) und G2- (hellgrau) Phase; es handelt sich um Mittelwerte dreier unabhängiger Experimente.
Fehler sind Mittelwerte +SEM
0 5 0 1 0 0
Zellzyklusverteilung, %
M C F 7 M D A -2 3 1 W T
M D A -2 3 1
B R
M D A -2 3 1
S A 5 9 , 8
2 0 , 3 1 9 , 4
5 4 , 8 2 6 , 1 1 9 , 1
4 3 , 4 3 4 , 5 2 2 , 2
4 6 , 6 4 1 , 0
1 3 , 4 S
G 1 G 2
TNBC Luminal
3.1.3 Bestimmung der Reparatur zwei-endiger DSBs durch HR
TNBCs zeichnen sich durch einen HR-Defekt aus [32]. Es wurde untersucht ob sich dies bei der Bestimmung der Reparatur zwei-endiger DSBs bestätigt und welche Auswirkung die endogen erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 der TNBC-Zelllinien auf die Reparatur durch HR hat.
Zudem sollte die Bedeutung der Replikation auf die HR-abhängige Reparatur zwei-endiger DSBs untersucht werden. Die HR-Kapazität wurde im Plasmid-Rekonstruktionsassay ermittelt.
Die Reparaturkapazität der Zellen für zwei-endiger DSBs durch HR (HR-Kapazität) wurde replikationsunabhängig- und nahe eines aktiven Replikationsursprungs mit zwei unterschiedlichen Plasmiden untersucht. Die replikationsunabhängige Reparatur wurde durch Transfektion mit dem Plasmid pDR-GFP- (Abb. 3.3 A) und die Reparatur nahe eines aktiven Replikationsursprungs mit dem Plasmid DR-oriP-GFP (Abb. 3.3 B) untersucht. Bei einer fehlerfreien Reparatur des zuvor in vitro induzierten DSB durch HR exprimieren die Zellen GFP.
Die Transfektion erfolgte für beide Plasmide transient, pDR-GFP wurde alleine- und DR-oriP-GFP zusammen mit dem Plasmid MSCV-N EBNA1 cotransfiziert, um den Replikationsursprung auf dem DR-oriP-GFP Plasmid zu aktivieren.
Abb. 3.3 (A) zeigt die relative HR-Kapazität in den TNBC- und der luminalen Zelllinie. Es konnte eine signifikant geringere HR-Kapazität für die TNBC-Zelllinien im Vergleich zur luminalen Zelllinie festgestellt werden mit 0,27 ± 0,1 zu 1,03 ± 0,04, p=0,003. Innerhalb der Gruppe der TNBC-Zelllinien zeigten sich ebenfalls signifikante Unterschiede, die MDA-MB-231
Abbildung 3.3: Vergleich der HR-Kapazität für replikationsunabhängige DSBs (A) und DSBs nahe eines aktiven Replikationsursprungs (B) in der luminalen- und den Triple-negativen Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden transient mit dem Reparaturkonstrukt pDRGFP (A) oder DR-ori-P GFP plus das Ori-aktivierende EBNA1 (MSCV-N EBNA1) (B) transfiziert. Als Kontrolle diente das GFP-kodierende pEGFPN1.
Der Anteil GFP-exprimierender Zellen wurde flusszytometrisch bestimmt. Zur Normierung diente die HR-Kapazität der MCF7. Dargestellt sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Doppelbestimmungen. Fehler sind Mittelwerte + SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: * p<0,05; ** p< 0,01; ***p< 0,001 (Student’s t-Test).
0 .0 0 .5 1 .0
Relative HR Kapazität **
*
M C F 7 M D A -2 3 1
M D A -2 3 1
B R
M D A -2 3 1
S A
**
A
0 .0 0 .5 1 .0
Relative HR Kapazität
***
**
M C F 7 M D A -2 3 1
M D A -2 3 1
B R
M D A -2 3 1
S A
**
B
TNBC
Luminal Luminal TNBC
wies die geringste HR Kapazität auf mit 0,12 ± 0,008, signifikant geringer als die der MDA-MB-231 BR mit 0,23 ± 0,04, p= 0,04 und der MDA-MB-MDA-MB-231 SA mit 0,45 ± 0,07, p= 0,006.
Abb. 3.3 (B) zeigt die relative HR-Kapazität für die Reparatur von DSBs nahe eines aktiven Replikationsursprungs. Die TNBC-Zelllinien zeigten eine signifikant geringere HR-Kapazität als die luminale Zelllinie, mit 0,45 ± 0,1 zu 1,0 ± 0,03, p=0,008. Innerhalb der Gruppe der TNBC-Zelllinien zeigte die MDA-MB-231 die geringste HR-Kapazität, signifikant geringer als die der MDA-MB-231-SA mit 0,17 ± 0,03, p=0,0008. Die MDA-MB-231 BR zeigte ebenfalls eine signifikant geringere HR-Kapazität als die MDA-MB-231 SA mit 0,27 ± 0,03 zu 0,75 ± 0,05, p=0,0013.
Im Vergleich zur replikationsunabhängigen Reparatur (Vgl. Abb. 3.3 A) zeigten die MDA-MB-231, MDA-MB-231 BR und die MDA-MB-231 SA bei der Reparatur nahe eines aktiven Replikationsursprungs (Abb. 3B) eine höhere relativen HR-Kapazität mit 0,12 ± 0,008 zu 0,17 ± 0,03 und 0,23 ± 0,03 zu 0,27 ±0,03 und 0,43 ± 0,07 zu 0,74 ± 0,05. Bei der luminalen MCF7 zeigte sich ebenfalls eine geringe Steigerung der HR-Kapazität mit 1,03 ± 0,04 zu 1,05 ± 0,05.
Zusammenfassend wiesen die drei TNBC-Zelllinien eine signifikant geringere HR-Kapazität auf als die luminale Vergleichszelllinie, unabhängig davon, ob die Reparatur replikationsunabhängig oder nahe eines aktiven Replikationsursprungs war. Innerhalb des isogenen TNBC-Zellsystems korrelierte die erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 mit der HR-Kapazität, allerdings wiesen sie auch Unterschiede im Anteil der S-/G2-Phase Zellen auf, was die HR-Kapazität ebenfalls beeinflusst. Bei der Reparatur nahe eines aktiven Replikationsursprungs zeigte sich hingegen, dass eine sehr hohe Expression von RAD51 und CHK1, wie sie die MDA-MB-231 SA aufwies, zu einer vergleichsweise hohen HR-Kapazität führte.
3.1.4 Bestimmung der Stabilisierung angehaltener Replikationsgabeln
Neben der Reparatur von DSB besitzt die HR die Funktion angehaltene Replikationsgabeln zu stabilisieren und vor der Degradation durch Nukleasen zu schützen [77]. Hierbei erfüllen RAD51 und CHK1 besonders wichtige Funktionen. Die Stabilisierung von Replikationsgabeln wurde mit dem DNA-Fiber-Assay überprüft und die Längen von Chromatinfasern nach Hydroxyharnstoff (Hydroxyurea, HU) -Behandlung erfasst. HU inhibiert das Enzym Ribonukleotidreduktase, wodurch der Nukleotid-Vorrat depletiert wird und die DNA Replikation anhält. Zelllinien mit einem HR-Defekt zeigten nach HU-Behandlung deutlich kürzere Chromatinfasern als in der Kontrolle [77].
Abb. 3.4 zeigt die relative Länge von Chromatinfasern nach der Behandlung mit HU. Hierbei wurde die Länge des ersten Labels (CldU) nach HU-Behandlung mit der Länge des ersten Labels (CldU) in der Kontrolle verglichen. Nach HU-Behandlung zeigten die TNBC-Zelllinien kürzere Chromatinfasern als in der Kontrolle, die Verkürzung war jedoch signifikant geringer als in der luminalen Vergleichszelllinie MCF7 mit 0,9 ± 0,003 zu 0,8 ± 0,004, p= 0,009. Die MDA-MB-231 zeigte kürzere Chromatinfasern nach HU-Behandlung, die vergleichbar war mit der Subzelllinie MDA-MB-231 BR mit 0,89 ± 0,003, p= <0,0001 zu 0,89 ± 0,001, p= 0,045. Die MDA-MB-231 SA zeigte eine etwas längere Chromatinfasern mit 0,93 ± 0,006, p= 0,012. Die luminale MCF7 wies die kürzesten Chromatinfasern auf mit 0,8 ± 0,004, p= 0,0003.
Zusammenfassend war die Schutzfunktion der HR vor nukleolytischer Degradation von Replikationsgabeln in allen Zelllinien beeinträchtigt. Jedoch zeigten die TNBC-Zelllinien eine signifikant geringere Degradation der Chromatinfasern als die luminale Zelllinie. Die Länge der Chromatinfasern nach HU-Behandlung korrelierte jedoch nicht signifikant mit der Expression von RAD51 und CHK1 (Vgl. Abb. 3.1). Auch die HR-Kapazität oder der Triple-negative Status korrelierten nicht mit der Degradation von Chromatinfasern nach HU-Behandlung.
Abbildung 3.4: Vergleich der mittleren Länge von Chromatinfasern der luminalen- und den Triple-negativen Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden 30 min mit CldU markiert, für zwei Stunden mit Hydroxyharnstoff behandelt, die DNA präpariert und eingebauten Nukleotide mit spezifischen Erst- und fluoreszenzgekoppelten Zweitantikörpern detektiert. Zur Normierung diente die Kontrolle. Dargestellt sind die Chromatinfaser- Längen dreier unabhängiger Experimente. Fehler sind MIttelwerte + SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: * p <
0,05; ** p < 0,01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001 (Student’s t-Test).
3.1.5 Bestimmung der Reparatur ein-endiger DSBs und Bestrahlungsschäden
Ein-endige DSBs, die während der DNA-Replikation in der S-Phase des Zellzyklus auftreten können, gehen aus kollabierten Replikationsgabeln hervor. Diese Struktur wird ausschließlich durch HR repariert [65]. Zur Überprüfung dieser Funktion wurde das zelluläre Überleben nach Camptothecin (Cpt)- und Olaparib-Schädigung überprüft. Cpt inhibiert die Topoisomerase I, die einen transienten Einzelstrangbruch (SSB) direkt vor der Replikationsgabel zur Relaxierung der replikationsbedingten Torsionsspannung induziert [111]. Cpt verhindert die Religation des SSB und führt beim Zusammentreffen mit der Replikationsgabel zu einem ein-endigen DSB.
Olaparib inhibiert spezifisch PARP1, einem integralen Bestandteil der Basenexzisionsreparatur. Ist PARP1 inhibiert werden SSBs nicht mehr durch die Basenexzisionsreparatur (BER) repariert, was in der S-Phase zur Kollision von Replikationsgabeln mit unreparierten SSBs führt und in ein-endigen DSBs resultiert, bei deren Reparatur die Zelle auf HR angewiesen ist [31]. Des Weiteren wurde das zelluläre Überleben nach Bestrahlung und Bestrahlung in Kombination mit Olaparib untersucht. Bestrahlung verursacht alle Arten von DNA-Schäden [108] und amplifiziert in Kombination mit Olaparib die Anzahl der replikationsassoziierten, ein-endigen DSBs.
Abb. 3.5 zeigt das zelluläre Überleben nach Schädigung mit Cpt. Die Empfindlichkeiten unterscheiden sich auf Grundlage der Dosis, bei der 50% der eingesetzten Zellen überleben (IC50) nur geringfügig. Die Triple-negative MDA-MB-231 zeigte hierbei mit 82,5 ± 7.5 nm die höchste IC50, die bei den beiden Subzelllinien MDA-MB-231-BR und –SA deutlich geringer war mit einer IC50 von 48,0 ± 1,7 nm und 45,7 ± 1,8 nm. Die luminale Vergleichszelllinie MCF7 zeigte eine vergleichbare Empfindlichkeit mit einer IC50 von 49,1 ± 2,1 nm. Es musste berücksichtigt werden, dass nur S-Phase-Zellen durch Cpt geschädigt werden, deshalb stellte sich bei allen Zelllinien ein Sättigungseffekt ein, ab einer Dosis von 200 nm wurden alle S-Phase-Zellen geschädigt. Zusammengefasst zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei der Reparatur ein-endiger DSBs. Das zelluläre Überleben korrelierte nicht mit dem Triple-negativen Status,
Abbildung 3.5: Zelluläres Überleben nach Camptothecin-Behandlung der luminalen- und den Triple-negativen Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden ausplattiert, mit Camptothecin behandelt und nach 14 Tagen fixiert, gefärbt und die Zahl der Kolonien bestimmt. Dargestellt ist das zelluläre Überleben mit ansteigender Dosis aus sechs-fach Bestimmungen dreier unabhängiger Experimente. Zur Normierung diente die Kontrolle. Fehler sind Mittelwerte ± SEM.
0 1 0 0 2 0 0
0 .0 1 0 .1 1
C p t , n m
M D A - 2 3 1
M D A - 2 3 1 S A M D A - 2 3 1 B R M C F 7
Überleben
I C5 0
der HR-Kapazität (Vgl. Abb. 3.3), der Stabilisierung von Replikationsgabeln (Abb. 3.4) oder der Expression von RAD51 und CHK1 (Vgl. Abb. 3.1).
Abbildung 3.6 zeigt das zelluläre Überleben nach Olaparib-Behandlung (A), Bestrahlung (B) und Kombinationsbehandlung (C-F). Beim zellulären Überleben nach Olaparib (A) zeigte die Triple-negative MDA-MB-231 die geringste Empfindlichkeit aller Zelllinien mit einer IC50 von 10,1 ± 0,2 µM. Die beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA zeigten eine höhere Empfindlichkeit mit einer IC50 von 6,8 ± 0,2 µM und 7,7 ± 0,1 µM. Die luminale MCF7 zeigte vergleichbare Empfindlichkeit mit einer IC50 von 7,5 ± 0,2 µM. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede beim zellulären Überleben nach Olaparib-Behandlung. Das zelluläre Überleben korrelierte nicht mit dem Triple-negativem Status, der HR-Kapazität (Vgl.
Abb. 3.3), der Stabilisierung von Replikationsgabeln (Vgl. Abb. 3.4) oder der RAD51 und CHK1 Expression (Vgl. Abb. 3.1).
Beim zellulären Überleben nach Bestrahlung (B) wurde die Strahlenempfindlichkeit mit Hilfe der D37 kalkuliert, der Dosis bei der statistisch jede Zelle mindestens ein letales Ereignis erfährt. Die MDA-MB-231 zeigte eine hohe D37 von 4,4 ± 0,3 Gy und das höchste Überleben nach 6Gy Bestrahlung, signifikant höher als das der anderen Zelllinien mit p=0,007. Die Triple-negative MDA-MB-231 BR und -SA wiesen eine höhere Strahlenempfindlichkeit auf mit einer D37 von 3,0 ± 0,1 Gy und 2,6 ± 0,1 Gy. Die luminale Vergleichszelllinie MCF7 zeigten eine mit der MDA-MB-231 SA vergleichbare Strahlenempfindlichkeit mit einer D37 von 3,0 ± 0,1 Gy.
Zusammenfassend zeigten sich beim zellulären Überleben nach Bestrahlung signifikante Unterschiede, diese korrelierten jedoch nicht mit dem Triple-negativem Status, der HR-Kapazität (Vgl. Abb. 4.3), der Stabilisierung von Replikationsgabeln (Vgl. Abb. 4.4) oder einer erhöhten Expression von Rad51 und CHK1 (Vgl. Abb. 4.1). Da Bestrahlung alle Arten von DNA-Schäden unabhängig von der jeweiligen Zellzyklusphase induziert, erfolgt die Reparatur strahlungsinduzierter Schäden durch zahlreiche Reparaturwege. DSBs werden nach Bestrahlung hauptsächlich durch das NHEJ repariert, HR spielt bei der Reparatur dieser Schäden eine untergeordnete Rolle [82].
Bei der Kombinationsbehandlung von Bestrahlung mit Olaparib (3.6 C-F) zeigte sich nur bei der Triple-negativen MDA-MB-231 (D) ein signifikanter Sensibilisierungseffekt bei den Dosispunkten 4Gy und 6Gy mit p=0,02 und p= 0,001. Die D37 verringerte sich durch die Olaparib-Behandlung von 4,4 ± 0,3 Gy auf 3,2 ± 0,2 Gy, was einer Dosis-Ersparnis von 1,2 Gy entspricht. Bei den beiden Subzelllinien MDA-MB-231-BR und –SA sowie der luminalen MCF7 zeigte sich kein signifikanter Sensibilisierungseffekt. Der Sensibilisierungseffekt korrelierte nur bei der MDA-MB-231 mit der Kapazität (Vgl. Abb. 3.3), jedoch mit keiner anderen HR-Funktion oder der Expression von RAD51 und CHK1 (Vgl. Abb. 3.1). Die hohe Sensibilisierbarkeit der Zelllinie mit der geringsten HR-Kapazität deutete darauf hin, dass unter PARP1-Inhibition die HR bei der Reparatur strahleninduzierter Schäden von herausgestellter Bedeutung ist. Hierbei musste jedoch berücksichtigt werden, dass die anderen Zelllinien bereits strahlenempfindlich waren und ein geringeres Potenzial zur Sensibilisierung boten.
Zusammengefasst zeigten sich nur geringe Unterschiede in der Kompetenz der HR-vermittelten Reparatur ein-endiger DSB. Das zelluläre Überleben korrelierte bei keiner Schädigung mit dem Triple-negativen Status, der Expression von RAD51 und CHK1 (Vgl. Abb.
3.1), der Stabilisierung von Replikationsgabeln (Vgl. Abb. 3.4) und nur eingeschränkt der HR-Kapazität (Vgl. Abb. 3.3).
3.1.6 Bestimmung des zellulären Überlebens nach MMC-Schädigung
Das Zytostatikum MMC verursacht Vernetzungen von benachbarten und gegenüberliegenden Guaninresten und führt dadurch in der S-Phase zur Störung der Replikation [109, 110]. Bei diesem Schaden sind die HR-Funktionen der Stabilisierung von Replikationsgabeln und die Reparatur ein-endiger DSBs von Bedeutung. Zellen mit einem Defekt in HR zeigen deshalb ein ausgesprochen geringes Überleben nach Behandlung mit MMC [116]. Zur Überprüfung der
0 .0 1 0 .1 1
Überleben
M D A - 2 3 1 M D A - 2 3 1 + O l a p a r i b
**
* D3 7
0 2 4 6
0.01 0.1 1
Dosis, Gy
Überleben
MDA-231-BR + Olaparib MDA-231-BR
D37
0 2 4 6
0.01 0.1 1
Dosis, Gy
Überleben
MDA-231-SA + Olaparib MDA-231-SA
D37
0 .0 1 0 .1 1
Überleben
M C F 7 + O l a p a r i b M C F 7
D3 7
C D
E F
0 2 4 6
0.01 0.1 1
Dosis, Gy
Überleben
MDA-231
MDA-231-BR MDA-231-SA MCF7
**
* D37
A B
0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0
0 .1 1
M D A - 2 3 1 S A M D A - 2 3 1 B R M D A - 2 3 1
M C F 7
O la p a r ib , µ M I C5 0
Überleben
Abbildung 3.6: Zelluläres Überleben nach Olaparib-, Bestrahlungs- und Kombinationbehandlung der luminalen- und den Triple-negativen-Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden ausplattiert, (A) mit Olaprib behandelt, (B) bestrahlt oder (C-F) mit Olaparib behandelt und anschließend bestrahlt und nach 14 Tagen fixiert, gefärbt und die Zahl der Kolonien bestimmt. Dargestellt ist das zelluläre Überleben mit ansteigender Dosis aus sechs-fach Bestimmungen dreier unabhängiger Experimente. Zur Normierung diente die Kontrolle. Fehler sind Mittelwerte ± SEM.
Reparatur von DNA-Vernetzungen wurde das zelluläre Überleben nach MMC-Schädigung überprüft.
Abb. 3.7 zeigt das zelluläre Überleben nach MMC-Schädigung. Die TNBC-Zelllinien zeigten ein deutlich höheres Überleben als die luminale Vergleichszelllinie. Die Triple-negative MDA-MB-231 SA zeigte die geringste Empfindlichkeit mit dem höchsten Überleben bei der stärksten eingesetzten Dosis mit einer IC50 von 2,2 ± 0,1 µg/ml und 0,81 ± 0,006 µg/ml. Die MDA-MB-231 zeigte ebenfalls eine geringe MMC-Empfindlichkeit und hohes Überleben bei der stärksten Dosis mit IC50 von 1,8 ± 0,1 µg/ml und 0,66 ± 0,01 µg/ml. Die MDA-MB-231 BR zeigte mit einer IC50=0,75 ± 0,05 µg/ml die höchste Empfindlichkeit innerhalb der Gruppe der Triple-negativen. Bei der höchsten eingesetzten Dosis zeigte sie mit 0,22 ± 0,07 ein signifikant geringeres Überleben als die MDA-MB-231 und die MDA-MB-231 SA mit p=0,009 und p=0,02.
Die luminale Vergleichszelllinie MCF7 zeigte die höchste Empfindlichkeit mit IC50= 0,4 ± 0,05 µg/ml und das geringste Überleben bei der höchsten Dosis von 0,007 ± 0,002 µg/ml. Dies war signifikant geringer als das Überleben der MDA-MB-231-SA und MDA-MB-231 mit p=0,003 und p=0,0155. Es stellte sich kein Sättigungseffekt bei der Schädigung mit MMC ein, obwohl es nur S-Phase-Zellen schädigt. MMC erzeugt jedoch bei seiner Reduktion, die zur Bindung an Guaninreste notwendig ist, Sauerstoffradikale, die Zellen in jeder Zellzyklusphase schädigen können.
Zusammenfassend korrelierte das zelluläre Überleben eindeutig mit dem Triple-negativen Status, nicht jedoch mit der der Stabilisierung von Replikationsgabeln (Vgl. Abb.
3.4), der Reparatur ein-endiger DSBs (Vgl. Abb. 3.5 & 3.6) oder der HR-Kapazität (Vgl. Abb.
3.3). Die MDA-MB-231 mit der geringsten HR-Kapazität war resistent und die luminale Vergleichszelllinie MCF7, die die höchste HR-Kapazität aufwies, war am MMC-empfindlichsten. Die Expression von RAD51 und CHK1 korrelierte nicht signifikant mit dem Überleben nach MMC (Vgl. Abb. 3.1).
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
0 .0 0 1 0 .0 1 0 .1 1
M M C , µ g /m l
Überleben
M D A - 2 3 1 M D A - 2 3 1 B R M D A - 2 3 1 S A
M C F 7
* * *
* I C5 0
Abbildung 3.7: Zelluläres Überleben nach MMC-Behandlung in der luminalen und den TNBC Mammakarzinomzelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden ausplattiert, mit MMC behandelt und nach 14 Tagen fixiert, gefärbt und die Zahl der Kolonien bestimmt. Dargestellt ist das zelluläre Überleben mit ansteigender Dosis. Es handelt sich um Mittelwerte aus sechs-fach Bestimmungen von mindestens drei unabhängigen Experimenten ± SEM. Zur Normierung diente die Kontrolle. Statistisch signifikante Abweichungen: * p < 0,05; ** p < 0,01.
3.1.7 RAD51- und γH2AX-Foci Bildung nach MMC-Schädigung
Das Zytostatikum MMC induziert DNA-Vernetzungen, die in der S-Phase zu Replikationsstress mit angehaltenen- und kollabierten Replikationsgabeln führen können und somit Schäden induzieren, für deren Reparatur die benötigt wird [65]. Die Voraussetzung für alle HR-Prozesse ist die Bildung von RAD51 Reparatur-Foci. Ein Reparatur-Focus stellt die Akkumulation von Reparatur-Proteinen dar, die an DNA-Schäden rekrutiert werden. Der Nachweis von RAD51-Foci diente als Marker für aktive HR, γH2AX als genereller Marker für DNA-Schäden. In der S-Phase ist sind RAD51 und γH2AX zudem Marker für angehaltene- oder kollabierte Replikationsgabeln [65, 66]. Nach erfolgter Reparatur dissoziiert RAD51 von der DNA und уH2AX wird dephosphoryliert, was als erfolgreich abgeschlossene Reparatur bewertet werden kann [117].
Es wurde mittels Analyse der RAD51 und γH2AX-Foci untersucht, ob sich die Zelllinien hinsichtlich der Formation von RAD51-Foci an replikationsassoziierten DNA-Schäden unterscheiden. Da MMC S-Phase-spezifische Schäden induziert wurde EdU als Marker für replizierende Zellen verwendet. Die Zelllinien wurden fortan auf Grundlage ihres Überlebens nach MMC in MMC-empfindlich und –resistent gruppiert und nicht länger nach ihrem molekularen Subtyp.
Abb. 3.8 zeigt die relative Anzahl von RAD51- (A) und γH2AX-Foci (B) 24 Stunden nach MMC-Schädigung in EdU-positiven (S-Phase) Zellen. Die MMC-resistenten- zeigten eine signifikant geringere Anzahl von RAD51-Foci als die MMC-empfindlichen Zelllinien mit 1,4 ± 0,02 zu 2,1 ± 0,01, p=0,0009. Innerhalb der MMC–empfindlichen Zelllinien zeigten die MCF7 und die MDA-MB-231 BR eine vergleichbare relative Anzahl von RAD51-Foci pro Zelle nach Schädigung mit einer im Vergleich zur Kontrolle signifikanten erhöhten Anzahl von 2,2 ± 0,2, p= 0,02 und 2,1 ± 0,045, p= 0,0005. In der Gruppe der MMC-resistenten Zelllinien war die relative Anzahl von RAD51-Foci pro Zelle in der MDA-MB-231 und der MDA-MB-231 SA deutlich geringer, verglichen mit der Kontrolle dennoch signifikant erhöht mit 1,3 ± 0,06, p=
0,02 und 1,4 ± 0,02, p=0,003.
Die Anzahl der γH2AX-Foci (B) war in den MMC-empfindlichen Zelllinien signifikant höher als in den MMC-resistenten- mit 4,0 ± 0,07 zu 1,23 ± 0,016, p= 0,0006. Die MCF7 wies nach Schädigung signifikant weniger γH2AX-Foci auf als die MDA-231 BR mit 2,8 ± 0,06 zu 5,3
± 0,08, p= 0,0015. Beide zeigten jedoch im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Erhöhung in der Anzahl der relativen γH2AX-Foci mit 2,8 ± 0,06, p= <0,0001 und 2,3 ± 0,08, p= <0,0001.
Bei den MMC-resistenten Zelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-231 SA zeigte sich eine im Vergleich zur Kontrolle geringe Erhöhung der relativen Anzahl der уH2AX-Foci mit 1,1 ± 0,002 und 1,4 ± 0,03, p= 0,003.
Zusammenfassend konnten alle untersuchten Zelllinien RAD51-Foci bilden und waren somit HR- profizient. Die RAD51- und γH2AX-Foci waren größtenteils kolokalisiert, was zeigte, dass die induzierten Schäden hauptsächlich durch HR repariert wurden. Nach MMC-Behandlung wiesen die MMC-empfindlichen- Zelllinien signifikant mehr RAD51- und γH2AX Foci auf als die MMC-resistenten Zelllinien. Somit waren die Reparaturprozesse 24 Stunden nach der MMC-Schädigung in den MMC-resistenten Zelllinien bereits abgeschlossen, während in den MMC-empfindlichen Zelllinien deutlich mehr DNA-Schäden vorlagen, bei denen die HR aktiv war. Es wurde im Folgenden untersucht, ob die Anzahl der DNA-Schäden (γH2AX Foci) mit dem Überleben nach MMC korrelierte.
Abb. 3.9 zeigt die Korrelation zwischen zellulärem Überleben nach MMC-Behandlung und der Anzahl der γH2AX-Foci nach MMC-Behandlung. Es bestand ein nahezu perfekter linearer Zusammenhang, die Datenpunkte befinden sich auf- oder nahe bei der Regressionsgeraden, die mit einem R2 von 0,92 nahe an einer perfekten Korrelation von 1,0 lag. Die Korrelation war statistisch signifikant mit p= 0,0039.
RAD51 γH2AX DAPI EdU Merge Kontrolle
+MMC
1 2
Rad51 Foci per Edu+ Cell, relative
M D A -2 3 1 M D A -2 3 1 B R
M D A -2 3 1
S A
***
* **
*
M M C - +
M C F 7
- +
- +
- +
***
A
MMC- empfindlich
MMC- resistent
2 4 6
Relative yH2AX Foci pro Edu+ Zelle
MDA-231 MDA-231 BR
MDA-231
SA MMC
MCF7
****
****
**
**
* n.s.
- + - + - +
- +
B ***
MMC- empfindlich
MMC- resistent
Abbildung 3.8: Vergleich der relativen Anzahl von RAD51- (A) und γH2AX-Foci (B) in S-Phase Zellen nach MMC-Schädigung.
Exponentiell wachsende Zellen wurden für 20 min mit EdU, gefolgt von- 1h mit 0,5 µg/ml MMC behandelt. Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgte 24 h nach Schädigung mit spezifischen Erst- und fluoreszenzgekoppelten Zweitantikörpern. DAPI diente zur Darstellung des Zellkerns. Zur Normierung diente die unbehandelte Kontrolle.
Dargestellt sind die relativen Werte dreier unabhängiger Experimente. Fehler sind Mittelwerte + SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: * p < 0,05; ** p < 0,01; ***p < 0,001 (Student’s t-Test).
Zusammenfassend hing das zelluläre Überleben nach MMC-Schädigung von der Anzahl der DNA-Schäden ab. Deren Anzahl (γH2AX-Foci) und das zelluläre Überleben korrelierten jedoch nicht mit der Stabilisierung von Replikationsgabeln (vgl. Abb. 3.4), der Reparatur ein-endiger DSBs (vgl. Abb. 3.5 und 3.6) oder der HR-Kapazität (Vgl. Abb. 3.3). Die zelluläre MMC-Empfindlichkeit war somit nicht abhängig von den Funktionen der HR.