3.3.1 Expression von Stammzell- und mesenchymalen Markern
Tumorstammzellen exprimieren spezifische Marker wie ALDH1 [40] und ZEB1 [42]. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die TNBC-Zelllinien diese Marker ebenfalls exprimieren, ob ein Unterschied zur luminalen Zelllinie besteht und ob sich dies auf die Zellmorphologie auswirkt. Hierfür wurde die Expression im Western-Blot- und die Morphologie im Lichtmikroskop untersucht.
Abb. 3.21 (A) zeigt die Expression von E-Cadherin, Vimentin, ZEB1 und ALDH1. Bei der Expression des epithelialen Faktors E-Cadherin zeigten die TNBC-Zelllinien eine deutlich geringere Expression als die luminale MCF7, die eine sehr starke Expression aufwies. Innerhalb der TNBC-Zelllinien zeigte die MDA-MB-231 eine deutlich stärkere Expression als die beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA. Die mesenchymale Marker Vimentin wurde in den TNBC-Zelllinien deutlich stärker exprimiert als in der luminalen MCF7. Die MDA-MB-231 und die MDA-231-BR zeigten eine vergleichbar starke Expression, die MDA-231 SA wies die stärkste Expression auf. Bei der luminalen MCF7 war keine Bande erkennbar, somit musste die Expression sehr gering sein. Der als mesenchymaler- und Stammzellmarker definierte Transkriptionsfaktor ZEB1 wurde in den TNBC-Zelllinien deutlich stärker exprimiert als in der luminalen Zelllinie.
Bei der MDA-MB-231 und ihrer Subzelllinie MDA-MB-231-BR war die ZEB1-Expression vergleichbar stark. Die MDA-MB-231-SA zeigte die stärkste ZEB1-Expression. In der luminalen Zelllinie wurde ZEB1 nur gering exprimiert. Bei der Expression des Stammzellmarkers ALDH1 zeigten die MDA-MB-231 BR und -SA die stärkste Expression, gefolgt von der MDA-MB-231, die eine deutlich geringere Expression aufwies. Die luminale MCF7 zeigte eine mit der MDA-MB-231 vergleichbare Expression.
Abb. 3.21 (B) zeigt eine Korrelation zwischen der Expression von CHK1 und ZEB1. Nach Zhang et al. 2014 [42] stabilisiert ZEB1 über USP7 CHK1, deshalb wurde die Expression dieser beiden Faktoren korreliert. Die Korrelation zwischen der Expression von CHK1 und ZEB1 zeigte einen klaren, linearen Zusammenhang, alle Datenpunkte liegen nahe- oder auf der Regressionsgeraden, die ein R2 nahe 1,0 hat mit R2= 0,96. Die Korrelation war hochsignifikant mit p < 0,0001.
Abb. 3.21 (C) zeigt) die Morphologie der untersuchten Zelllinien. Bei der Zellmorphologie zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den TNBC-Zelllinien und der luminalen MCF7.
Die TNBC-Zelllinien zeigten eine mesenchymale Zellmorphologie, die Zellen waren spindelförmig und es gab nur wenige Zell-Zell-Kontakte. Die Zellen der MCF7 zeigten hingegen eine epitheliale Zellmorphologie mit abgerundeten Zellen und zahlreichen Zell-Zell-Kontakten.
Zusammenfassend zeigte sich, dass die TNBC-Zelllinien einen mesenchymalen- und Tumorstammzellcharakter aufwiesen, während die luminale MCF7 einen deutlich epithelialen- und keinen Tumorstammzellcharakter aufwies. Die MDA-MB-231 lag hinsichtlich der Expression von E-Cadherin und ALDH1 zwischen der luminalen MCF7 und den beiden TNBC-Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA, wurde aber anhand der hohen Expression von Vimentin und ZEB1 sowie der Zellmorphologie dem Stammzellphänotyp zugeordnet. Darüber
Abbildung 3.21: Einfluss der Expression von Mesenchymalen- und Stammzellmarkern auf die Expression von CHK1 und die Zellmorphologie.
(A) 40 µg Protein exponentiell wachsender Zellen wurden separiert und mittels Western-Blot transferiert. Die Detektion der Proteine erfolgte mit spezifischen Erst- und fluoreszenzgekoppelte Zweitantikörpern. GAPDH diente als Ladekontrolle. (B) Korrelation zwischen der Expression von CHK1 und ZEB1. Die Daten für die Quantifikation wurden aus Abbildung 3.1 und Abbildungen 3.21 A entnommen. (C) Die Morphologie der Zellen wurde im Lichtmikroskop (100x Vergrößerung) analysiert.
A B
C
1 2 3 4
1 2 3
ZEB1 Expression
CHK1 Expression
MDA-231 BR MDA-231 MCF7
MDA-231 SA
R2=0,96 p < 0,0001
hinaus korrelierte Expression von ZEB1 signifikant mit der Expression von CHK1 und wies auf eine Verbindung zwischen stammzellartigem Phänotyp und S-Phase Schadensantwort hin.
3.3.2 Klonogenität als Merkmal eines Stammzellphänotyps
Ein wichtiges Merkmal von Tumorstammzellen ist ihre Fähigkeit Tumore bilden zu können. Im Mausmodell wurden nur wenige hundert Zellen mit Tumorstammzellphänotyp für eine Tumorinitiation benötigt [41]. Übertragen auf ein 2D-Modell kann hier die Klonogenität als Maßstab verwendet werden [122]. Im Folgenden wurde die Klonogenität untersucht.
Abb. 3.22 zeigt die Klonogenität (Plating-Efficiency, PE) der luminalen- und der TNBC-Zelllinien. Es zeigten sich deutliche Unterschiede; die luminale MCF7 zeigte eine signifikant geringere PE als die Gruppe der Triple-negativen mit 0,30 ± 0,009, p=0,009. Auch in der Gruppe der negativen zeigten sich Unterschiede: so zeigte MDA-MB-231 unter den Triple-negativen die geringste PE mit 0,51 ± 0,025. Bei den beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA war die PE etwas höher mit 0,59 ± 0,008 und 0,63 ± 0,048.
Zusammenfassend zeigten die TNBC- im Vergleich zur luminalen Zelllinie eine signifikant erhöhte PE. Das bestätigt die erhobenen Expressionsdaten hinsichtlich der Expression von Mesenchymal- und Stammzellmarkern (Vgl. Abb. 3.21 A), die in den TNBC-Zelllinien ebenfalls deutlich erhöht waren.
0 .2 0 .4 0 .6
Anwachsrate
* *
M C F 7 M D A -2 3 1
M D A -2 3 1 B R
M D A -2 3 1
S A
Luminal TNBC
Abbildung 3.22: Klonogenität der Luminalen- und der TNBC Zelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden ausplattiert und nach 14 Tagen fixiert, gefärbt und die Anzahl der Kolonien bestimmt. Dargestellt ist die mittlere Anwachsrate (Plating efficiency). Es handelt sich um Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Experimenten mit sechs-fach Bestimmung. Der Fehler ist der Mittelwert +SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: ** p < 0,01 (Student’s t-Test).
3.3.3 Aktivität von ALDH1 als Marker eines Stammzellphänotyps
Die Expression von Stammzellmarkern (Vgl. Abb. 3.21 A) und die Klonogenität (Vgl. Abb. 3.22) der TNBC-Zelllinien wiesen darauf hin, dass sie einen Tumorstammzell-Phänotyp aufwiesen.
Mit dem ALDEFLUORTM-Assay kann durch Bestimmung der ALDH1-Aktivität der Stammzellanteil in einer Zellpopulation bestimmt werden. Zur Bestätigung des Tumorstammzell-Phänotyps wurde der Anteil ALDH1-positiver Zellen mittels ALDEFLUORTM -Assay überprüft.
Abb. 3.23 zeigt den prozentualen Anteil ALDH1-positiver Zellen in der jeweiligen Zellpopulation. Die TNBC-Zelllinien hatte einen signifikant höheren Anteil ALDH1-positiver Zellen als die luminale MCF7 mit 71,9 ± 3,8 % zu 39,1 ± 1,0 %, p=0,007. Innerhalb der Gruppe der TNBC-Zelllinien gab es ebenfalls Unterschiede. So zeigte die MDA-MB-231 den höchsten Anteil ALDH1-positiver Zellen mit 79,0 ± 3,3 %, gefolgt von den beiden Subzelllinien MDA-MB-231 BR und -SA mit 66,0 ± 2,2 % und 70,9 ± 6 %.
Zusammenfassend bestätigte die Messung ALDH1-positiver Zellen den Tumorstammzellcharakter der TNBC-Zelllinien. Zwar enthielt auch die Zellpopulation der luminalen Zelllinie einen hohen Anteil ALDH1-positiver Zellen, dieser war jedoch signifikant geringer als in den TNBC-Zelllinien.
Abbildung 3.23: Aktivität von ALDH1 in der luminalen- und den TNBC Zelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit ALDEFLUOR™-Reagenz inkubiert, in der Kontrollgruppe wurde zusätzlich ein ALDH1-Inhibitor (N,N-diethylaminobenzaldehyd, DEAB) zugesetzt. Anschließend wurde der Anteil fluoreszierender Zellen im Durchflusszytometer bestimmt. Dargestellt ist der prozentuale Anteil fluoreszierender Zellen. Es handelt sich um Mittelwerte dreier unabhängiger Experimente. Fehler sind Mittelwerte + SEM.
Statistisch signifikante Abweichungen: ** p < 0,01 (Student’s t-Test).
40 60 80
ALDH1 positive Zellen, %
MCF7 MDA-231
MDA-231 BR
MDA-231
SA DEAB +
-**
+ - + - +
-Luminal TNBC
3.3.4 Migrationskapazität als Merkmal von Tumorstammzellen
Tumorstammzellen besitzen zumeist einen mesenchymalen Phänotyp, der sie zu einer erhöhten Migration befähigt [123], die einen wichtigen Teil ihrer Biologie ausmacht. Um die Migrationsfähigkeit der luminalen- und TNBC-Zelllinien zu überprüfen wurde im Folgenden der Transwell-Assay verwendet.
Abb. 3.24 zeigt die relative Migrationskapazität der luminalen- und TNBC-Zelllinien. Die TNBC-Zelllinien zeigten eine signifikant höhere Migrationskapazität als die luminale MCF7 mit 4,3 ± 0,55 zu 1,01 ± 0,35, p=0,025. Innerhalb der Gruppe der TNBC-Zelllinien zeigten sich ebenfalls Unterschiede; die MB-231 hatte im Vergleich zu den beiden Subzelllinien 231 BR und -SA die geringste relative Migrationskapazität mit 3,3 ± 0,29. Die MDA-MB-231 BR zeigte hingegen die höchste relative Migrationskapazität mit 5,24 ± 0,75, gefolgt von der MDA-MB-231 SA mit 4,2 ± 0,22.
Zusammenfassend bestätigte die Migrationskapazität den mesenchymalen- und Stammzellphänotyp der TNBC-Zelllinien.
3.3.5 Erhöhung der Tumorstammzellpopulation durch wiederholte Bestrahlung
Tumorstammzellen sind eine Subpopulation innerhalb der Zellpopulation und zeichnen sich durch eine erhöhte Resistenz gegen DNA-Schäden aus [42, 48, 119-121]. Um die Subpopulation der Tumorstammzellen innerhalb der gesamten Zellpopulation zu selektionieren wurden die Zelllinien wiederholt bestrahlt in der Annahme, dass dies den Anteil von Tumorstammzellen erhöht. Um diese radioresistenten Klone hinsichtlich ihrer
2 4 6
Relative Migration
MCF7 MDA-231
MDA-231 BR
MDA-231
SA
*
Luminal TNBC
Abbildung 3.24: Relative Migration in der luminalen- und den TNBC-Zelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden auf die Oberseite einer Membran mit 8 µm großen Poren ausgelegt und für 16 Stunden inkubiert. Die auf der Membran-Oberseite verbliebenen Zellen wurden entfernt, die Zellen auf der Unterseite der Membran mit DAPI gefärbt. Die Migration wurde relativ zur absoluten Anzahl migrierter MCF7 Zellen kalkuliert. Dargestellt ist der relative Anteil migrierter Zellen. Es handelt sich um Mittelwerte dreier unabhängiger Experimente. Fehler sind Mittelwerte +SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: * p < 0,05 (Student’s t-Test).
Strahlenempfindlichkeit zu überprüfen wurde das zelluläre Überleben nach Bestrahlung bestimmt.
Abb. 3.25 zeigt das zelluläre Überleben der parentalen Zelllinien im Vergleich mit den aus ihnen hervorgegangenen radioresistenten Klonen (RR Klonen). In allen RR-Klonen zeigte sich eine deutliche Zunahme der Radioresistenz im Vergleich zu ihren parentalen Zelllinien. Der radioresistente Klon der MDA-MB-231 zeigte im Vergleich zu seiner parentalen Zelllinie eine signifikante Zunahme der Strahlenresistenz bei den Dosispunkten 4Gy und 6Gy und einer deutlich höheren D37 von 4,4 ± 0,3 auf 6,1 ± 0,1 Gy, p=0,0008 und p=0,0002. Der RR Klon der MDA-MB-231 BR zeigte ebenfalls eine im Vergleich zu seiner parentalen Zelllinie erhöhte Strahlenresistenz und ein signifikant höhere Überleben bei den Dosispunkten 4 Gy und 6 Gy und einer erhöhten D37 von 2,6 ± 0,1 Gy auf 3,8 ± 0,2 Gy, p=0,003 und p=0,0004. Auch der RR Klon der MDA-MB-231 SA zeigte ein signifikant höheres Überleben bei den Dosispunkten 4 Gy und 6 Gy sowie eine deutliche Zunahme der D37 von 3,0 ± 0,1 Gy auf 4,2 ± 0,1 Gy, p= 0,049 und p=0,008. Der RR Klon der luminalen MCF7 zeigte zwar eine deutliche, aber keine signifikant höhere Strahlenresistenz als die parentale Zelllinie mit einer Zunahme der D37 von 3,0 ± 0,1 Gy auf 5,1 ± 0,2 Gy.
Abbildung 3.25: Zelluläre Strahlenempfindlichkeit in den radioresistenten Klonen (RR Klonen) und den parentalen Zelllinien.
Exponentiell wachsende Zellen wurden ausplattiert, bestrahlt und nach 14 Tagen fixiert, gefärbt und die Zahl der Kolonien bestimmt. Dargestellt ist das zelluläre Überleben mit ansteigender Dosis. Es handelt sich um Mittelwerte aus sechs-fach Bestimmungen von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Fehler sind Mittelwerte ± SEM. Statistisch signifikante Abweichungen: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 (Student‘s t-test).
Überleben
0.1 1
MCF7 RR Klon D37
0.1 1
Überleben
MDA-231 RR Klon
***
***
D37
0 2 4 6
0.1 1
Dosis, Gy
Überleben
MDA-231 BR RR Klon
**
***
D37
0 2 4 6
0.1 1
Dosis, Gy
Überleben
RR Klon MDA-231 SA
**
* D37
Zusammenfassend zeigten alle radioresistenten Klone eine deutliche Zunahme der Strahlenresistenz. Dies war ein Indiz für eine mögliche Erhöhung des Tumorstammzellanteils in der Zellpopulation durch wiederholte Bestrahlung.
3.3.6 Zusammenfassung 3
Triple-negative Mammakarzinome zeichnen sich durch einen erhöhten Anteil von Tumorstammzellen aus [23, 38]. Tumorstammzellen sind therapieresistent und besitzen eine verstärkte Aktivierung der DNA-Schadensantwort und DNA-Reparatur [42, 48, 119-121]. Zur Untersuchung ob die TNBC-Zelllinien einen Tumorstammzell-Phänotyp aufweisen und dieser im Zusammenhang mit Therapieresistenz steht, wurden die Zellen mittels Expression von Stammzellfaktoren und deren Einfluss auf die Morphologie, Klonogenität, ALDH1-Aktivität und Migration untersucht. Des Weiteren wurde der Anteil von Tumorstammzellen in den Zellpopulationen durch wiederholte Bestrahlung erhöht.
Die TNBC-Zelllinien wiesen eine hohe Expression von mesenchymalen- und Stammzellmarkern auf, während die luminale MCF7 einen epithelialen- und keine erhöhte Expression von Tumorstammzellmarkern zeigte. Die Expression des mesenchymalen Markers ZEB1 korrelierte signifikant mit der Expression von CHK1 (p <0,0001), somit deutete sich eine Verbindung zwischen Stammzell-Phänotyp und einer stärkeren S-Phase Schadensantwort an.
Die Zellen der TNBC-Zelllinien zeigten eine spindelförmige, mesenchymale Morphologie mit geringen Zell-Zell Kontakten, während die Zellen der luminalen Zelllinie abgerundet waren und es zahlreiche Zell-Zell-Kontakte gab. Um den Tumorstammzellphänotyp sicherzustellen wurde die Klonogenität untersucht und bestätigte die Expressionsdaten. Die TNBC-Zelllinien zeigten eine signifikant höhere PE als die luminale Zelllinie (p=0,009). Auch die Messung von ALDH1 bestätigte dies mit signifikant höherer ALDH1-Aktivität in den TNBC- als in der luminalen Zelllinie (p= 0,007). Der Tumorstammzellphänotyp spiegelte sich auch in der Migrationskapazität wider, die TNBC-Zelllinien zeigten eine signifikant höhere Migrationskapazität als die luminale Zelllinie (p= 0,025). Das Ausmaß der Tumorstammzellpopulation bzw. des Tumorstammzellphänotyps der parentalen TNBC-Zelllinien korrelierte nicht mit der Strahlenempfindlichkeit (Vgl. Abb. 3.6 B) oder der zellulären Empfindlichkeit gegen Cpt (Vgl. 3.5), Olaparib (Vgl. Abb. 3.6 A) oder MMC (Vgl. Abb. 3.7).
Um schließlich zu untersuchen ob der Anteil der Tumorstammzellen in der Zellpopulation erhöht werden konnte wurden die Zellen wiederholt bestrahlt und zeigten im zellulären Überleben nach Bestrahlung eine deutliche Zunahme der Strahlenresistenz im Vergleich zu den parentalen Zelllinien, die mutmaßlich mit einer Erhöhung des Anteils stammzellartiger Tumorzellen einherging. Dies war jedoch nicht auf den Triple-negativen Subtyp beschränkt, auch der radioresistente Klon der luminalen Zelllinie zeigte eine Erhöhung der Strahlenresistenz.