Zielsetzung und Versuchsaufbau

Ziel der Durchführung war, die makroskopische Bestimmung der verschiedenen Darmabschnitte anhand anatomischer Strukturen (z.B. Plica duodenocolica, Plica ileocaecalis) zur Klärung der Frage, welche Darmabschnitte bei Vorliegen einer PEI verlängert ist. Die Untersuchungen erfolgten vergleichend an gesunden Kontrolltieren und an pankreasgangligierten Tieren. Im Versuchsverlauf wurden sowohl Köpermasse als auch Körpermaße kontinuierlich ermittelt. In der 26. Lebenswoche wurden die Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen. Dabei wurden neben der Länge der einzelnen Darmabschnitte auch die Organgewichte und deren Inhalt bestimmt sowie Gewebeproben aus Duodenum, Jejunum, Ileum und Caecum entnommen.

42 3.3.2 Eingesetzte Tiere

Zu Beginn des Versuches waren die Tiere (acht weibliche deutsche Masthybriden) 15 Wochen alt. Bei fünf Tieren wurde in der 16. Lebenswoche der Ausführungsgang des Pankreas ligiert und dadurch eine PEI induziert. Die übrigen drei Tiere wurden in der 16. Lebenswoche einer Schein-OP unterzogen und gemeinsam mit den pankreasgangligierten Tieren (PL-Tiere) eingestallt. In Tabelle 2 sind die Daten der einzelnen Tiere (Körpermasse zum Zeitpunkt der Operation, Einteilung in die Gruppen) dargestellt.

Tabelle 2: Im Versuchsteil 2 genutzte Tiere, ihre Kennzeichnung, Körpermasse zu Versuchsbeginn und Gruppenzugehörigkeit (PL16 = pankreasgangligierte Tiere)

Tier Nr. Körpermasse (kg) Gruppe

28 56,0 Kontrolle

29 55,5 Kontrolle

80 54,5 PL16

81 53,5 PL16

83 58,5 PL16

84 56,0 PL16

93 59,5 PL16

97 44,5 Kontrolle

3.3.2.1 Operationstechnik zur Induktion der pankreatischen exokrinen Insuffizienz

Narkose

Als Anästhesie wurde eine Injektionsnarkose verwendet. Diese bestand aus Ursotamin^® (Serumwerk Bernburg AG, Bernburg) in einer Dosierung von 0,023 mg Ketaminhydrochlorid/kg Köpermasse (KM) und Stresnil^® (Elanco™ Deutschland

43

GmbH, Bad Homburg) in einer Dosierung von 2 mg Azaperon/kg KM. Sofern die Narkosetiefe nicht ausreichend war, wurde ggf. eine weitere Injektion vorgenommen (Ursotamin^®, Hälfte der Initialdosis)

Ligatur des Pankreasganges

Die Ligatur des Pankreasganges erfolgte nach der von TABELING et al. (1998) beschriebenen Methode. Nach Vorbereitung des OP-Feldes wurde die Bauchhöhle ca.

5 cm kaudal des Schaufelknorpels in der Linea alba über etwa 10 cm eröffnet.

Anschließend wurde der Ductus pancreaticus accessorius aufgesucht, freigelegt, doppelt ligiert und durchtrennt. Danach wurde die Bauchhöhle in drei Schichten verschlossen.

Operation der Kontrolltiere („Schein-Operation“)

Die OP der Kontrolltiere gestaltete sich wie bei den PL-Tieren, allerdings wurde die Ligatur des Pankreasganges unterlassen. Im Bereich des Duodenums wurde stattdessen einige Minuten lang manipuliert. Dazu wurden der Darm und das Pankreasgewebe manuell durchtastet, um – abgesehen von der Pankreasgangligatur - vergleichbare Bedingungen zu den PL-Tieren zu schaffen.

Postoperative Versorgung

Die Tiere wurden nach der Operation dreimalig in Abstand von 48h antibiotisch mit Duphamox L.A.^® (Zoetis Deutschland GmbH, Berlin) in einer Dosierung von 15 mg Amoxicillin/kg KM und 3 Tage lang analgetisch mit Metacam^® (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein) in einer Dosierung von 8 mg Meloxicam/kg KM/Tag intramuskulär versorgt. Das Nahtmaterial der Hautnaht wurde nach 10 Tagen entfernt.

3.3.2.2 Überprüfung der Funktion des exokrinen Pankreas

Eine Woche nach der Operation wurde der Chymotrypsingehalt im Kot mittels Chymotrypsin-Kit^® (Fa. Immundiagnostik AG, Bensheim) ermittelt. Die Tiere mit einer Chymotrypsinkonzentration unter 0,9 I.E./g Kot wurden als PEI Tiere definiert.

44 3.3.2.3 Haltung

Die Tiere wurden jeweils zu zweit einstreulos auf unperforiertem Boden in Stallabteilungen mit einer Größe von ca. 1 x 3 m gehalten. Der Liegebereich war mit Gummimatten ausgelegt, die Lufttemperatur betrug im Mittel 18°C. Durch große Fenster war ein Tageslichteinfall gegeben. Das Deckenlicht wurde manuell gesteuert und bei Bedarf genutzt. Wasser war über Nippeltränken jederzeit verfügbar.

3.3.2.4 Fütterung

Das eingesetzte Mischfutter wurde im Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Chargen von je 300kg gemischt. Die Zusammensetzung ist in den Tabellen 3 und 4 dargestellt. Die Futtermenge wurde kontinuierlich gesteigert. Um Futterverluste zu vermeiden, wurde jedoch die Futtermenge an die Futteraufnahme der Tiere angepasst, sodass am nächsten Morgen keine bzw. nur geringe Futterreste vorhanden waren.

Tabelle 3: Zusammensetzung des verwendeten Mischfutters (Komponenten) Komponente % - Anteil der Mischung

Weizen 35,5

Gerste 30,3

Sojaschrot 15,0

Leinöl 5,00

Magermilchpulver 5,00

Sojaöl 3,00

Mineralfutter F40¹ 3,00

Bierhefe 2,00

Tryptophan 0,56

Lysin 0,30

Threonin 0,20

Methionin 0,15

1 Zusammensetzung siehe Abschnitt 13.8

45

Tabelle 4: Chemische Zusammensetzung des verwendeten Mischfutters (Analyse)

1.Charge 2.Charge 3.Charge g/kg uS

TS 911 905 901

g/kg TS

Ra 51,9 49,2 50,9

Rp 191 190 204

Rfe 96,2 105 103

Rfa 43,7 36,4 41,8

NfE 528 525 501

Stärke 407 402 398

Zucker 57,6 56,2 58,3 mg/kg TS

Cu 24,9 15,1 20,4

Zn 103 117 113

Fe 328 272 294

Mn 106 110 109

3.3.3 Sektion

Nachdem die Tiere für 10 Wochen in den Stallungen des Instituts für Physiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgestallt waren, erfolgte die Euthanasie und Sektion der Tiere. Aus organisatorischen Gründen konnten nicht alle Tiere zur gleichen Zeit bzw. am gleichen Tag euthanasiert und seziert werden. In der Übersicht 1 sind die einzelnen Tiere und deren Euthanasiezeitpunkt dargestellt. In der Woche, in der die Sektion durchgeführt wurde, erfolgte die Fütterung aller Tiere täglich um 06:00 Uhr morgens.

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Übersicht 1: Darstellung der Sektionszeitpunkte der einzelnen Tiere, grau hinterlegte Felder markieren die Kontrolltiere

Uhrzeit Montag Dienstag Donnerstag Freitag

09:00 29 80 83 28

12:00 93 97 84 81

Es wurden stets beide in einer Bucht zusammen gehaltene Tiere an einem Tag euthanasiert und seziert. Die Tiere der verschiedenen Gruppen wurden dabei alternierend (früher Zeitpunkt um 9:00 bzw. späterer Zeitpunkt um 12:00) euthanasiert, um einen Effekt des Zeitpunktes der Sektion auf die Versuchsergebnisse zu minimieren. Da die Gruppengrößen nicht identisch waren (Kontrolltiere: n=3;

pankreasgangligierte Tiere (PL-Tiere): n=5) war, eine vollständige Angleichung nicht möglich (s. Übersicht 1)

Ablauf:

1. Wägung: Die Tiere wurden am Tag der Sektion unmittelbar vor dem Transport über eine Viehwaage geführt, um die aktuelle Körpermasse zu ermitteln und danach auf einen Transportwagen verbracht.

2. Narkose: Auf dem Transportwagen erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion von Ketamin (Ursotamin^® Serumwerk Bernburg AG, Bernburg in einer Dosierung von 0,023 mg Ketaminhydrochlorid/kg KM) und Azaperon (Stresnil^® Elanco™ Deutschland GmbH, Bad Homburg) in einer Dosierung von 2 mg Azaperon/kg KM). Nach dem Erreichen einer ausreichenden Narkosetiefe wurden die Tiere vom Physiologischen Institut in die Sektionshalle des Anatomischen Instituts der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht.

3. Bestimmung der Körpermaße und Blutentnahme: Mittels Maßband wurden Brust-, Bauch- und Röhrbeinumfang sowie die Nasen-Steißlänge bestimmt. Im Anschluss wurde das Herz auf der linken Körperseite aufgesucht und mit einer Kanüle (TSK-Supra Sonderkanüle, 1,2 mm x 100 mm, Fa. Erhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen) punktiert. Es erfolgte die Entnahme von Blutproben (S-Monovetten^® (9ml) der Firma Sarstedt).

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4. Euthanasie: Die Euthanasie erfolgte durch die intracardiale Injektion von T61^® (Fa. Intervet, Unterschleißheim; Wirkstoffe: Tetracainhydrochlorid, Embutramid, Mebezoniumjodid; Dosierung: 0,24 ml/kg i.c.). Durch den Stillstand des Herzens, dem Ausbleiben des Cornealreflexes sowie geweitete lichtstarre Pupillen wurde der Tod der Tiere festgestellt.

5. Eröffnung der Bauchhöhle: Der Bauch der Tiere wurde zunächst trocken gereinigt und danach entlang der Linia alba eröffnet. Im Anschluss wurden an der rechten und linken Bauchwand Entlastungsschnitte gesetzt.

6. Aufsuchen und Kennzeichnung der einzelnen Darmabschnitte: Im ersten Schritt wurde der Übergang des Pylorus in das Duodenum aufgesucht und dort zwei Ligaturen gesetzt. Danach erfolgte das Aufsuchen des Überganges vom Duodenum zum Jejunum. Dort wurden ebenfalls zwei Ligaturen gesetzt. Als nächstes wurde anhand der Plica ileocaecalis das Ende des Jejunums bzw. der Beginn des Ileums bestimmt und ebenfalls mit zwei Ligaturen versehen. Jeder Dünndarmabschnitt wurde an seinem oralen und aboralen Ende mittels entsprechender Schilder markiert. Zum Schluss erfolgte das Aufsuchen des colo-rectalen Überganges. Nach doppelter Ligierung wurde dieser durchtrennt.

Nach der Durchtrennung des Überganges Pylorus-Duodenum wurde das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entnommen.

7. Längenbestimmung der Darmabschnitte: Das entnommene Darmkonvolut wurde zunächst in Dünn- und Dickdarm getrennt und von beiden Teilen jeweils die Masse mit Inhalt bestimmt. Danach erfolgten die Trennung des Dünndarms vom Gekröse und die meanderförmige Anordnung auf einem Sektionstisch. Mit einem Maßband wurde die Länge des gesamten Dünndarms sowie der einzelnen Abschnitte bestimmt. Es erfolgte zusätzlich eine Längenbestimmung des ebenfalls vom Gekröse befreiten und linear ausgelegten Colons. Am Caecum wurden darüber hinaus Länge und Breite bestimmt.

8. Entnahme der Chymusproben aus dem Darm: Nach der Längenbestimmung wurden die jeweiligen Dünndarmabschnitte getrennt und entleert. Dabei wurden sowohl die Masse der Ingesta als auch das Leergewicht der einzelnen Darmabschnitte bestimmt. Das gleiche Vorgehen wurde für das Caecum sowie für das Colon angewendet. Der Magen wurde nach institutsüblicher Unterteilung mit vier Darmklemmen (s. WINTERMANN 2011) geviertelt, der Inhalt separat aufgefangen und die Masse des entleerten Organs bestimmt.

48

9. Entnahme von Gewebeproben: Während der Sektion wurden von jedem Tier Gewebeproben aus dem Duodenum, Jejunum und Ileum gewonnen. Dabei wurden aus dem Duodenum und Ileum jeweils drei Proben (Anfang des Darmabschnittes, Mitte, Ende des Darmabschnittes) entnommen. Aus dem Jejunum wurden aufgrund der Länge dieses Darmabschnittes jeweils fünf Proben gewonnen: am Anfang (0%), bei 25%, bei 50% und bei 75% der Gesamtlänge sowie am Ende (100%) des Darmabschnittes. Die entnommenen Gewebeproben wurden in PBS gewaschen, mit Stecknadeln auf Moosgummiquadraten befestigt und in Bouin-Lösung zur Fixierung gegeben.

Um eine Autolyse zu vermeiden erfolgte die Probenentnahme möglichst zeitnah zur Euthanasie.

10. Aus dem Tierkörper wurden der Magen, das Pankreas, der Thymus und das Herz entnommen. Die Masse von Magen und Herz wurden durch Wägung ermittelt. Pankreas und Thymus wurden für die histologische Untersuchung aufbereitet.

3.3.4 Probenentnahme

3.3.4.1 Körpermaße

Alle zwei Wochen wurden die Körpermaße Brust-, Bauch-, Röhrbeinumfang und Nasen-Steißlänge jeden Tieres mit einem Maßband bestimmt.

3.3.4.2 Körpermasse

Die Körpermasse eines jeden Tieres wurde einmal wöchentlich, stets am gleichen Wochentag, mit Hilfe einer Viehwaage (Einzeltierwaage, Wiegebreich 300kg, Ablesbarkeit 500g) nach der morgendlichen Fütterung bestimmt.

3.3.4.3 Chymusproben

Nach Euthanasie der Tiere wurde der Chymus aus dem Magen, den einzelnen Dünndarmabschnitten (Duodenum, Jejunum und Ileum) sowie aus dem Caecum und Colon entnommen.

49 3.3.5 Untersuchungsparameter

Es wurden verschiedene Parameter im Futter, am lebenden Tier und im Chymus untersucht, die in den Übersichten 2 bis 4 dargestellt sind.

Übersicht 2: Untersuchungsverfahren zur Charakterisierung der Mischfutterzusammensetzung

Parameter Methode

Trockensubstanz

WEENDER Analyse (Vorschriften des VDLUFA) Rohasche

Rohfett Rohfaser Stickstoff-freie Extraktstoffe (NfE)

Rohprotein Vario Max CNS® (Vorschriften des VDLUFA) Stärke Polarimetrie (Vorschriften des VDLUFA) Zucker LUFF-SCHORL (Vorschriften des VDLUFA) Mengenelemente

(Ca, Mg, P, Na, K, Cl)

Atomabsorptionsspektrometrie, Flammenemissionsverfahren (Vorschriften des VDLUFA) Spurenelemente

(Cu, Zn, Fe, Mn)

Atomabsorptionsspektrometrie (Vorschriften des VDLUFA)

50

Übersicht 3: Angewandte Untersuchungsverfahren für die am lebenden Tier ermittelten Parameter

Parameter Methode

Futteraufnahme Quantifizierung der täglichen Einwaage und wöchentliche Rückwaage der Futterreste Körpermasse wöchentliche Wägung

Brustumfang

Messungen im 14-tägigen Abstand mittels Maßband

Bauchumfang Röhrbeinumfang Nasen-Steiß-Länge

Übersicht 4: Angewandte Untersuchungsverfahren für die im Chymus und Kot gemessenen Parameter

Parameter Methode

ursprüngliche Substanz Wiegen

Trockensubstanz Wiegen nach Trocknung bei 103°C

Rohfett Ankom hydrolysis system^® und Ankom XT 15 Extraktor^® Rohprotein Vario Max CNS^® (Vorschriften des VDLUFA) Methode

nach DUMAS

Stärke Polarimetrie (Vorschriften des VDLUFA)

pH Potentiometer der Firma WTW (pH 526 MultiCal^®) Flüchtige Fettsäuren Gaschromatographie (Fa. Pye Unicam)

Chymotrypsin Chymotrypsin Testkit^®

(Immundiagnostik AG, Bensheim) Chromoxid Methode nach PETRY u. RAPP (1970)

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3.3.6 Methoden zur Bestimmung von Rohnährstoffen, pH-Werten und Chymotrypsingehalten

3.3.6.1 Aufbereitung der Futterproben für die Bestimmung von Rohnährstoffen Nach Gewinnung einer repräsentativen Probe jeder Futtercharge wurde aus dieser jeweils ein Aliquot mithilfe eines Probenteilers erstellt und für die weitere Laboranalyse gemahlen (Zentrifugalmühle ZM 1000, Fa. Retsch, Haan; 10.000 Umdrehungen/min.

Sieb 0,5 mm Lochdurchmesser).

3.3.6.2 Bestimmung der Rohnährstoffe im Futter und im Chymus

Die Bestimmung der Rohnährstoffe erfolgte, wie von SCHWARMAIER (2012) beschrieben, mittels der Weender Analyse nach den Grundlagen der VDLUFA:

„Amtliche Methode der chemischen Untersuchung von Futtermitteln“, Methodenbuch III (NAUMANN et al. 1976) einschließlich der achten Ergänzung von 2012 sowie institutsinterne Modifikationen (siehe BORGELT 2015). Die Analysen wurden stets im Doppelansatz durchgeführt.

Es wurden folgende Parameter bestimmt:

 Trockensubstanzgehalt (TS-Gehalt)

 Rohasche (Ra)

 Rohprotein (Rp)

 Rohfett (Rfe)

 Rohfaser (Rfa)

 N-freie Extraktstoffe (NfE)

 Stärke

 Zucker

 Mengenelemente

 Spurenelemente

52 3.3.6.3 pH-Wert

Zur Bestimmung des pH-Wertes wurde der Chymus im Verhältnis von 1:5 mit destilliertem Wasser verdünnt und nach 30 Minuten mit dem pH-Meter (pH526 Multi Cal^® der Firma WTW) gemessen.

3.3.6.4 Chymotrypsin

Im Kot wurde die Chymotrypsinaktivität mit dem Chymotrypsin Testkit^® (Fa.

Immundiagnostik AG, Bensheim) ermittelt. Das Substrat Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA wird in Anwesenheit von Chymotrypsin zu Succ-Ala-Ala-Pro-Phe und p-Nitroanilin umgesetzt. Dabei kommt es zu einer Farbveränderung, welche photometrisch bei 405 nm gemessen wird. Die Tiere mit einer Chymotrypsinkonzentration unter 0,9 I.E./g Kot wurden als PEI Tiere definiert.

3.3.6.5 Flüchtige Fettsäuren

Die Bestimmung von flüchtigen Fettsäuren im Chymus und Kot erfolgte mittels Gaschromatographie (s. SCHWARZMAIER 2012)

3.3.7 Verdaulichkeit

Um die Verdaulichkeit von Futterinhaltsstoffen zu bestimmen, wurde die Markermethode für die Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit (pcVQ) sowie der Verdaulichkeit über den gesamten Verdauungstrakt genutzt.

3.3.7.1 Bestimmung der Verdaulichkeit

Für die Bestimmung der Verdaulichkeit wurde als Marker Chromoxid (Cr2O3) genutzt, welches dem Futter ab dem 10. Tag vor dem ersten Sektionstag (10. Versuchswoche) in einer Konzentration von 2,51 g/kg TS zugesetzt wurde. In der Sektion wurden für die Bestimmung der Verdaulichkeit der Nährstoffe Chymus aus dem Ileum sowie Kot aus dem Rektum gewonnen. Im Anschluss wurde der TS-Gehalt sowie der Gehalt an Rohfett, Rohprotein und Stärke analysiert. Die Verdaulichkeit von Rohfett, Rohprotein und Stärke wurde mit folgender Formel berechnet (KAMPHUES et al. 2014):

53

Verdaulichkeit (%) = 100 – {Indikator im Futter % x Nährstoff im Kot %

Indikator im Kot % x Nährstoff im Futter %} x 100

3.3.7.2 Cr2O3- Analytik

In den Chymus- und Kotproben aus der Sektion wurde der Cr2O3-Gehalt nach der Methode von PETRY u. RAPP (1970) bestimmt.

3.3.8 Aufbereitung der Gewebeproben und histologische Färbung

Die gewonnenen Gewebeproben aus Pankreas, Duodenum, Jejunum und Ileum wurden nach ausreichender Fixierzeit (48 Stunden) in Bouin-Lösung auf die Größe von 0,5 x 2 cm zugeschnitten und in 70%igem Alkohol gelagert. Danach erfolgte ein regelmäßiger Wechsel des Alkohols, welchem einige Tropfen 25%igen Ammoniaks zugesetzt waren, um die Pikrinsäure aus dem Gewebe zu lösen. Diese würde den Polymerisationsvorgang behindern. Der Alkohol wurde so lange gewechselt, bis keine Gelbfärbung mehr zu erkennen war. Danach wurden die Proben für die weitere Untersuchung der Tunica muscularis einer Technovit^®-Einbettung unterzogen (Technovit^® 8100 der Firma Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim). Zunächst erfolgte eine Dehydratation des Gewebes mit kaltem (4°C) 100%igem Aceton. Dabei wurde das Acteon in den ersten Minuten solange gewechselt, bis keine milchige Trübung mehr zu erkennen war. Die Proben wurden daraufhin für 1 Stunde bei 4°C im Aceton belassen. Danach erfolgte die Infiltration der Proben mit der auf 4°C vorgekühlten Infiltrationslösung (100 ml Technovit^® 8100 Basislösung + 1 Beutel (0,6 g) Technovit^® 8100 Härter 1) über Nacht. Am nächsten Tag wurde aus 15 ml Infiltrationslösung und 0,5 ml Technovit^® 8100 Härter 2 die Polymerisationslösung hergestellt. Mit dieser Lösung wurden die Mulden der Einbettungsformen (Histoform, Fa. Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim) vollständig gefüllt, die Gewebeproben darin ausgerichtet und anschließend mit Folie luftdicht verschlossen. Während der Einbettung und des Aushärtens über Nacht lagerten die Formen auf einer Eisschicht (Kühlakku) bei 4°C im Kühlschrank. Nach Aushärtung des Kunststoffes wurden die Folien bei Raumtemperatur entfernt und die entstandenen Blöcke mit Histobloc^® (Fa. Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim) und Technovit^® 3040 (Fa. Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim) aufgeblockt. Im Anschluss wurden von den Blöcken mit einem

54

Rotationsmikrotom (Leica RM2265, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch) 2 µm dicke Schnitte erstellt, in einem mit Aqua dest. gefüllten, Wasserbad (GFL Gesellschaft für Labortechnik m.b.H. &Co, Burgwedel, Deutschland) gestreckt und danach auf unbeschichtete Objektträger (Objektträger Knittel Glasbearbeitungs-GmbH, Braunschweig) aufgezogen. Die Schnitte wurden daraufhin auf einer Wärmeplatte (Fa. Guwina, Berlin) bei 60°C angetrocknet und danach im Wärmeschrank (Venticell, Medcenter Einrichtungen GmbH, Planegg) bei 37°C über Nacht getrocknet. Am nächsten Tag erfolgte die Färbung mit Toluidinblau (Herstellung s. Abschnitt 13.1.3) nach folgendem Protokoll:

Protokoll der Färbung mit Toluidinblau:

Toluidinblau 1 Minute Aqua dest. 3 x spülen 80% Ethanol 3 x spülen 100% Ethanol 3 x spülen

Danach wurden die Schnitte luftgetrocknet und im Anschluss mit DePex (Fa. Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg) eingedeckt.

3.3.8.1 Auswertung der Gewebeproben

Die Auswertung der Gewebeproben erfolgte, wie bereits in Teil 1 beschrieben, mit Hilfe des Axioskops (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena), der dazugehörigen Kamera und Software. Dabei wurden jeweils das Stratum circulare und das Stratum longitudinale der Tunica muscularis von Duodenum, Jejunum und Ileum in der Toluidinblau-Färbung individuell in der 400-fachen Vergrößerung betrachtet und fotografiert. Im erstellten Bild wurde daraufhin ein Messraster mit einer Rasterweite von 40 µm x 40 µm eingeblendet. In jedem Schnitt wurde in jeweils 20 Rasterzellen die Zellkernanzahl bestimmt.

55 3.3.9 Statistische Auswertung

Die Daten werden als arithmetischer Mittelwert und ±Standardabweichung angegeben (MW ± STABW). Die Parameter aus dem ersten Teil wurden mit einem gemischten hierarchischen Varianzanalyse-Modell mit dem festen Effekt „Gruppe“ und dem zufälligen Effekt „Tier innerhalb der Gruppe“ berechnet. Im zweiten Teil wurde für die Berechnung der Parameter Körpermasse und Körpermaße (Nasen-Steiß-Länge, Brust-, Bauch- und Röhrbeinumfang) der t-Test (2-seitig) genutzt. Die statistische Auswertung aller anderen Parameter im zweiten Teil wurde mit einer Varianzanalyse (ANOVA), unter Voraussetzung einer Normalverteilung mit anschließendem post-hoc Test (Fisher’s least significant difference) durchgeführt. Unterschiede im Vergleich mit der Kontrollgruppe werden als signifikant gewertet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit unter 5 % lag (p ≤ 0,05). Dargestellt werden signifikante Unterschiede durch das Anhängen von Buchstaben (a, b, c, d). Ungleiche Buchstaben kennzeichnen dabei statistisch gesicherte Unterschiede zwischen den Gruppen mit Pankreasgangligatur (PL-Gruppen) und der Kontrollgruppe. Die Berechnungen wurden mit Hilfe von Frau Matschurat und der SAS Version 7.1 (Windows 8.1) durchgeführt.

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4. Ergebnisse

4.1 Teil 1

4.1.1 Ergebnisse aus der lichtmikroskopischen Untersuchung und Messung der Schichtdicken in den Gewebeproben mittels HE-Färbung

Die Pankreasgangligatur wurde durchgeführt, um experimentell eine exokrine Pankreasinsuffizienz auszulösen. Der Verlust der exokrinen Funktion des Pankreas beruht auf einer Atrophie des exokrinen Pankreasgewebes. Um zu überprüfen, ob bei den PL-Tieren tatsächlich kein exokrines Pankreasgewebe vorhanden war, wurden neben den Darmgewebeproben auch Proben aus dem Pankreasgewebe von PL-Tieren und Kontrolltieren entnommen und im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht. Dort wurde der vollständige Verlust an exokrinem Pankreasgewebe bei allen PL-Tieren bestätigt (s. Abbildung 6). Gleichzeitig wurde das Auftreten einer Nesidioblastose bei einigen PL-Tieren diagnostiziert.

Abbildung 6: Darstellung des Pankreasgewebes bei einem Kontrolltier und einem PL-Tier (exemplarische Auswahl) A: Pankreasgewebe (Kontrolltier, 100-fache Vergrößerung), B: Pankreasgewebe (PL-Tier, 100-100-fache Vergrößerung), Insets (C-F): C: Sekretgang (Kontrolltier), D: endokriner Inselapparat (Kontrolltier), E:

Sekretgang (PL-Tier), F: endokriner Inselapparat (PL-Tier)

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Nachfolgend werden die Ergebnisse der lichtmikroskopischen Untersuchung und der Messungen in den HE-gefärbten Schnitten dargestellt.

Ergebnisse der lichtmikroskopischen Untersuchung

Zunächst wurden alle Gewebeschnitte im Lichtmikroskop auf ihre Qualität (Vollständigkeit aller Schichten, Anschnitt des Gewebes möglichst in einem 90°

Winkel) überprüft. Gleichzeitig wurde in einer Liste vermerkt, welchen Darmabschnitten die jeweiligen Gewebeproben zuzuordnen sind (siehe Abbildung 7).

In der Liste wurde neben Tiernummer und Probennummer auch die Länge des Dünndarmes eingetragen. Dabei zeigte sich, dass, unabhängig von der Gruppe, nur jeweils eine Gewebeprobe aus dem Duodenum entstammte. Somit konnte dem Duodenum eine Länge von maximal zwei Metern angerechnet werden. Aus dem Ileum stammten ein bis zwei, zum Teil 3 Proben, sodass die errechnete Länge des Ileums (in Abhängigkeit zur Gesamtlänge des Dünndarms) zwischen den einzelnen Tieren beträchtlich variierte (siehe Tabelle 5). Als längster Dünndarmabschnitt konnte somit das Jejunum identifiziert werden und es wurde vermutet, dass dieser Bereich maßgeblich in seiner Länge zwischen den einzelnen Gruppen variierte. Eine gesicherte Aussage konnte aber erst anhand der Ergebnisse aus dem zweiten Teil getroffen werden. Trotzdem wurde im ersten Teil, auf Grund dieser ersten Einschätzung, der Fokus der Untersuchungen auf das Jejunum gelegt.

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Kontrolle PL7 PL7+Vit PL16

39 40 41 43 34 35 36 37 44 31 32 33 38 54 45 46 47 48 49

19,3 17,6 18,2 20,6 16,2 14,7 21,6 26,0 20,4 24,3 26,6 22,9 24,8 22,8 22,4 25,8 28,2 23,8 22,9 Dünn

-darmlänge(m) Position

D D D D D D D D D D D D D D D D D 0,00 1

J J J J J J J J J J J P J J J J J J J 2,00 2

J J J J J J J J J J J J J J J J J J J 4,00 3

J J P J J J J J J J J J J J P J J J J 6,00 4

J J J J J J J P J J J J J J J P J J J 8,00 5

J J J J J J J J J P J J J J J J J P J 10,00 6

J J P J J J J J J J J J J J J J P J J 12,00 7

J J J J P P J J J J J J J J J P J J J 14,00 8

P I I J P P J J J J J J J J J J J P J 16,00 9

J I I J J J J J J J J J J J J J J J 18,00 10

I J J J J J J J J I J J J J J 20,00 11

I I J I J J J I I I J J I I 22,00 12

J I I I I I I P I I 24,00 13

J I I I I P 26,00 14

I J? J 28,00 15

I 30,00 16

Abbildung 7: Übersicht über die Zuordnung der Gewebeproben der jeweiligen Probeentnahmestellen zu den entsprechenden Dünndarmabschnitten D: Duodenum, J: Jejunum, P: Peyer‘sche Platte, I: Ileum

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Die freien Felder in Abbildung 6 zeigen die Lokalisationen an, von denen Proben nicht verfügbar waren. Anhand der erhobenen Befunde (histologische Zuordnung der Gewebeproben zu den verschiedenen Darmabschnitten) wurde sowohl die maximale Länge des Duodenums und des Ileums als auch die minimale Länge des Jejunums kalkuliert. Die in Tabelle 5 dargestellten Werte sind nur rein hypothetische Werte und zeigten zum Teil beträchtliche Abweichungen zur Lehrbuchmeinung (s. NICKEL et al.

2004). Dabei konnte für alle Tiere eine maximale Länge des Duodenums von 2 Metern kalkuliert werden. Jedoch schwankten die Längen des Jejunums (zwischen 12,0 und 26,0 Meter) und des Ileums (zwischen 0,20 und 4,80 Meter) zwischen einzelnen Tieren beträchtlich. Möglicherweise kam es bei den Tieren 34 und 35 zu Verwechslungen des Probengewebes (s. Kritik der Methode: 5.1.4)

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Tabelle 5: Beispielhafte Kalkulationen der Längen der Dünndarmabschnitte Länge in m

Ergebnisse der Messungen in den HE-gefärbten Schnitten

Bei der Untersuchung der Schichtdicken der Tunica mucosa und der Tunica muscularis des Jejunums konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Tiergruppen gemessen werden. Auffällig war jedoch eine optisch dickere Tunica mucosa sowie Tunica muscularis in der PL7 VIT Gruppe (s. Abb. 8), welches sich auch in den Daten wiederspiegelte (s. Abb. 9 und 10).

61

Abbildung 8: Jejunumgewebe der Tiere der verschiedenen Gruppen, gefärbt mit

Abbildung 8: Jejunumgewebe der Tiere der verschiedenen Gruppen, gefärbt mit

Im Dokument Untersuchungen zu den Effekten einer exokrinen Pankreasinsuffizienz auf das Längenwachstum und den histologischen Aufbau des Dünndarmes junger Schweine (Seite 41-0)