2. Schrifttum
2.4 Intestinale Adaptation
2.4.1 Intestinale Adaptation nach Dünndarmresektion
Veränderungen, die bei einer Adaptation des Darmes nach einer Resektion beobachtet werden, sind eine Dilatation des Darmrohres, eine Zunahme der Darmwanddicke und eine Längenzunahme des Darmes (WEALE et al. 2005).
Mikroskopisch kann eine Zunahme in Höhe und Durchmesser der Villi, eine Elongation der Krypten und eine erhöhte Proliferationsrate sowie eine reduzierte Apoptoserate der Epithelzellen beobachtet werden (WEALE et al. 2005). Der verbliebene Darm zeigt außerdem eine forcierte Nährstoffabsorption durch eine vergrößerte Absorptionsfläche und eine Reduzierung der Darmmotilität, um einen intensiveren Kontakt zwischen Nährstoffen und Tunica mucosa zu ermöglichen (TAYLOR u. FULLER 1994;
TAPPENDEN 2014). Die intestinale Adaptation wird von vielen Faktoren reguliert, unter anderem spielen Nährstoffe im Darmlumen eine wichtige Rolle. Unterschiede im Nährstoffgehalt der Nahrung (oral oder enteral appliziert) verändern die strukturellen und funktionellen Merkmale der Adaptation des Darmes (TAPPENDEN 2006).
Insbesondere Fett (langkettige Triglyceride gleichermaßen wie kurzkettige Fettsäuren) scheint die Adaptation zu fördern (TAPPENDEN 2014). Ebenfalls scheint die aus der Fermentation malabsorbierter Kohlenhydrate und nicht verdauter Strukturkohlenhydrate entstandene Buttersäure ein wichtiges trophisches Signal im Rahmen der intestinalen Adaptation nach einer massiven Dünndarmresektion zu sein (BURRIN et al. 2001; TAPPENDEN et al. 2003). Die lokale Wirkung nicht absorbierter Nährstoffe im Darmlumen würde außerdem eine Erklärung für das adaptive Wachstum des Darmes distal des resezierten Darmstückes (TAYLOR u. FULLER 1994) darstellen. Jedoch ist es schwierig, die direkten trophischen Effekte der Nährstoffe von jenen der endogenen Wachstumsfaktoren, welche durch das Vorhandensein der Nährstoffe im Darmlumen ausgeschüttet werden, zu differenzieren (TAYLOR u.
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FULLER 1994). Eine Vielzahl an intestinotrophischen Faktoren ist bekannt (s. Tab.1), unter anderem das rekombinante humane Wachstumshormon (Somatropin) (TAPPENDEN 2014). In früheren Studien konnte außerdem eine Elongation des Darmes (ORSKOV et al. 2005) und eine Zunahme der Villuslänge (DRUCKER et al.
1996; SIGALET et al. 2014) durch eine exogene Gabe von GLP-2 gezeigt werden.
Das GLP-2 Analog Teduglutide und das rekombinant hergestellte Somatotropin wurden zur klinischen Anwendung bei erwachsenen Patienten mit Short-Bowel Syndrom zugelassen (TAPPENDEN 2014).
Tabelle 1: Intestinotrophische Faktoren und ihre Wirkung (Modifiziert nach WEALE et al. 2005)
Faktor Wirkung (experimentell)
Growth Hormon (GH) Darmlänge und Funktion pro Längeneinheit↑
(Effekte werden vermutlich über Insulin-like growth factors vermittelt)
Insulin-like growth factor
IGF-1 Proliferation von Kryptenzellen und glatten Muskelzellen↑
Epidermal growth factors
EGF, TGFα Enterozytenproliferation↑, Apoptoserate↓
Glucagon-like peptide
GLP-2 Kryptenzellproliferation↑ u.a., siehe Kapitel 2.3 Andere
Hepatocyte growth factor
Masse des verbliebenen Darmes nach Resektion↑
Keratinocyte growth factor
Epithelzellproliferation↑, Apoptoserate↓
Neurotensin Villuslänge↑ (Wirkung möglicherweise über Proglukagon abgeleitete Peptide)
Leptin Kohlenhydrat-Aufnahme aus dem Lumen↑
Interleukin 11 Epithelproliferation↑, Absorption von Kohlenhydraten bei hoher Dosierung↑
25 2.5 Gastrointestinale Hormone
2.5.1 Inkretinhormone
Inkretine sind Darmhormone, welche die Insulinsekretion nach der Nahrungsaufnahme in einer Glukose-abhängigen Weise potenzieren. Die beiden am besten untersuchten Hormone sind das Glucose-dependent insulinotropic Peptid (GIP) und das Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1). Beide Hormone wirken über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die vornehmlich von β-Zellen der Langerhans-Inseln exprimiert werden. Die GLP-1 und GIP-Rezeptoren kommen aber auch in anderen Geweben, wie z.B. in Herz, Niere, Gehirn und Darm sowie auf Immunzellen vor und haben darüber hinaus verschiedene indirekte metabolische Effekte (CAMPBELL u. DRUCKER 2013).
2.5.1.1 Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)
GLP-1 wird von enteroendokrinen L-Zellen gebildet (BAGGIO u. DRUCKER 2007).
Dabei gibt es zwei Formen: Das GLP-1 (7-36) Amid und das GLP-1 (7-37). Plasma-GLP-1-Level steigen innerhalb weniger Minuten nach Nahrungsaufnahme rapide an, daher wird davon ausgegangen, dass zwei Faktoren, neuronale und/oder endokrine Faktoren, die GLP-1-Freisetzung aus L-Zellen fördern, lange bevor Nährstoffe den Dünndarm erreicht haben und in direkten Kontakt mit den L-Zellen treten (DRUCKER 2006). Der genaue Mechanismus ist aber bisher noch unbekannt. GLP-1 erhöht, abhängig vom Glukosespiegel, die Insulinsynthese und reduziert die Glukagon-Ausschüttung (DRUCKER 2006). Es verleiht außerdem Glukose-resistenten β-Zellen Glukosesensibilität, stimuliert die β-Zell-Proliferation, inhibiert die β-Zell-Apoptose (CAMPBELL u. DRUCKER 2013) und fördert indirekt die Aufnahme von Nährstoffen in die Zelle.
2.5.1.2 Glucose-dependent insulinotropic Peptide (GIP)
Das Glucose-dependent-insulinotropic Peptid ist ein 42-Aminosäurenpeptid, welches hauptsächlich in K-Zellen des proximalen Duodenums gebildet wird. Der vorherrschende Stimulus der GIP-Sekretion sind Nährstoffe, insbesondere Fette im Lumen des Dünndarms. Zirkulierende GIP-Level sind im nüchternen Zustand gering und steigen nach Nahrungsaufnahme innerhalb von Minuten an (DRUCKER 2006).
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Das GIP stimuliert die Insulinsekretion, die Insulinbiosynthese sowie die β-Zell-Proliferation und inhibiert die β-Zell-Apoptose. Darüber hinaus konnten GIP-Rezeptoren im Gehirn und auf Adipozyten nachgewiesen werden. Ebenfalls besitzt das GIP anabole Wirkungen auf den Knochen (YIP u. WOLFE 2000; NYBERG et al.
2005; BAGGIO u. DRUCKER 2007).
2.5.1.3 Glucagon-like Peptide 2 (GLP-2)
Glucagon-like Peptide-2 ist ein vom Proglukagon abgeleitetes Peptidhormon (proglucagon-derived peptide = PGDP), bestehend aus 33 Aminosäuren. Proglukagon ist ein Prohormon-Vorläufer, welcher neben GLP-2 auch Glukagon, Oxyntomodulin und GLP-1 kodiert (DRUCKER u. YUSTA 2014). GLP-2 wird in enteroendokrinen L-Zellen des Darmes aus Proglukagon gebildet und freigesetzt. Darüber hinaus kommt es im Gehirn, vorwiegend im Stammhirn, vor, von wo es in weiter distal gelegene Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) transportiert wird, um dort eine eher lokale Wirkung auszuüben (DRUCKER u. YUSTA 2014).
Sekretionsmechanismus:
Die intestinale GLP-2-Synthese wird über Nährstoffe reguliert, aber auch im nüchternen Zustand werden niedrige basale Level von GLP-2 ausgeschüttet (DRUCKER u. YUSTA 2014). Der Eintritt von Nährstoffen in den proximalen Dünndarm verursacht, vermittelt über den Vagusnerv, einen ersten Anstieg der GLP-1 und 2 Sekretion (s. Abb. 2). Vagale efferente Bahnen stimulieren die distalen L-Zellen über einen Mechanismus innerhalb des enterischen Nervensystems, welcher Acetylcholin (Ach) und Gastrin-Releasing Peptid (GRP) beinhaltet.
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Abbildung 2: Überblick über den GLP-2-Regelkreislauf (modifiziert nach SIGALET 2015)
Der aborale Transport der Nährstoffe innerhalb des Darmlumens führt durch die direkte Stimulation der L-Zellen zu einem zweiten, späteren Anstieg von GLP-1 und 2 (BRUBAKER u. ANINI 2003). Ein weiterer Trigger-Faktor könnten SCFA (short-chain fatty acids) aus der Fermentation malabsorbierter Kohlenhydrate und nicht verdauter Strukturkohlenhydrate sein, insbesondere aus der Fermentation entstandenes Butyrat bzw. Buttersäure (BURRIN et al. 2001; TAPPENDEN et al. 2003).
Wirkung:
Die Wirkung des GLP-2 wird hauptsächlich über einen einzigen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, den GLP-2-Rezeptor, vermittelt (MUNROE et al. 1999). GLP-2 stimuliert die Kryptenzellproliferation (s. Abb. 3) und führt damit zu einer Zunahme der Schichtdicke der Tunica mucosa im Dünn- und Dickdarm (DRUCKER et al. 1996, DRUCKER u.
YUSTA 2014). Weitere Wirkungen auf den Intestinaltrakt sind die Inhibition der Apoptose im Darmepithel, Steigerung des Blutflusses und der Nährstoffaufnahme (z.B.
die Steigerung des aktiven Transportes von Glukose in die Zelle) sowie Reduktion der Magensäureproduktion, Darmmotilität und Permeabilität (DRUCKER u. YUSTA 2014).
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Abbildung 3: Schematische Darstellung der Wirkung von GLP-2 am GLP-2 Rezeptor (modifiziert nach BURRIN et al. 2003)
2.6 Exokrine Pankreasinsuffizienz
Eine exokrine Pankreasinsuffizienz (PEI) liegt nach LINDKVIST (2013) vor, wenn die Pankreasenzymaktivität im Darmlumen unter die für eine normale Verdauung benötigte Schwelle fällt. Der Mangel an Pankreasenzymaktivität kann zum einen durch den Verlust von funktionalem Gewebe durch z.B. chronische Pankreatitis, Mukoviszidose, Tumoren des Pankreas oder Pankreasresektion entstehen, zum anderen durch eine verminderte Sekretion trotz intaktem Gewebe durch z.B. eine Obstruktion des Ausführungsganges (Tumor der Papilla duodeni), eine Abnahme der endogenen Stimulation durch Zöliakie, Morbus Crohn oder Diabetes mellitus oder durch eine intraluminale Inaktivierung bei z.B. dem Zollinger Ellison Syndrom oder der Anwendung von Tetrahydrolipstatin (Orlistat) (KELLER u. LAYER 2005). Eine pankreato-cibale Asynchronie (Pankreasenzyme können durch eine veränderte Darmanatomie erst im Jejunum Nahrungsbestandteile spalten) durch Dünndarmresektion, Short-Bowel Syndrom, Morbus Crohn oder Diabetes mellitus, können weitere Ursachen darstellen (KELLER u. LAYER 2005). Der Pankreassaft besteht aus Bikarbonat und Wasser, die beide von tubulären Zellen sezerniert werden, und aus Enzymen, mit der Fähigkeit Proteine, Kohlenhydrate und Fette zu spalten,
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welche aus Acinus-Zellen sezerniert werden (LINDKVIST 2013). Im Körper existieren kaum extrapankreatische Lipasen. Deshalb ist die pankreatische Lipase das wichtigste lipolytische Enzym, jedoch auch gleichzeitig das Pankreasenzym mit der niedrigsten Stabilität im Darmlumen (LINDKVIST 2013). Eine verminderte Lipaseaktivität führt zu einer reduzierten Fettverdauung und damit zur Steatorrhoe, was wiederum ein Defizit an fettlöslichen Vitaminen (A, D, E und K), Gewichtsverlust und abdominale Beschwerden bedingt, da im Dickdarm keine Kompensation der Fettverdauung stattfindet (HACKERT et al. 2014).
2.7 Das pankreasgangligierte Schwein als Modelltier für die exokrine Pankreasinsuffizienz des Menschen
Das Schwein ähnelt dem Menschen in Bezug auf die Verdauungsphysiologie und Ernährung in vielen Punkten. Beide Spezies ähneln sich in der Anatomie des Verdauungstraktes, in der Physiologie und im Metabolismus (MOUGHAN et al. 1994).
Trotz bestehender Unterschiede zwischen den Spezies, die in den jeweiligen Modellen bedacht werden müssen, kann das Schwein als gutes Modelltier für Studien zur humanen Verdauung bezeichnet werden (MOUGHAN et al. 1994). So hat sich das pankreasgangligierte Schwein als Modelltier für die humane exokrine Pankreasinsuffizienz bewährt (IMONDI et al. 1972; TABELING et al. 1998; GREGORY et al. 1999; GREGORY et al. 2016). In der Studie von SCHWARZMAIER (2012) wurden abgesetzte Ferkel als ein Modell für wachsende Individuen (Kinder) genutzt.
Es konnten aus früheren Studien an adulten pankreasgangligierten Schweinen gewonnene Erkenntnisse auch an jungen Tieren bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass die praecaecale Verdaulichkeit sowie die Verdaulichkeit über den gesamten GIT von organischer Substanz, Rohfett und Rohprotein nach Auslösung einer experimentellen PEI signifikant niedriger war als bei den gleichaltrigen gesunden Kontrolltieren. Die Verdaulichkeit von Stärke war dabei nur ileal reduziert und zeigte bis zum Colon und über den gesamten GIT keinen Unterschied zu den Kontrolltieren (SCHWARZMAIER 2012). Die niedrige ileale Stärkeverdaulichkeit wird bei pankreasgangligierten Tieren durch mikrobielle Fermentation im Dickdarm kompensiert; dabei wird Stärke mikrobiell v.a. zu den kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Butyrat und Propionat abgebaut (MÖSSELER et al. 2007; ENGELHARDT et al. 2010;
SCHWARZMAIER 2012). Daneben entsteht aus Stärke evtl. auch Laktat, welches zu
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Propionat verstoffwechselt werden kann (ENGELHARDT et al. 2010). In der Studie konnte ebenfalls gezeigt werden, dass pankreasgangligierte Schweine nicht einfach nur „kleiner“ waren im Vergleich zur Kontrollgruppe, sondern einen signifikant höheren Anteil des GIT an der Körpermasse aufwiesen und damit Fettgewebe und Muskulatur relativ weniger stark ausgeprägt waren (SCHWARZMAIER 2012). Der erhöhte Anteil des GIT an der Körpermasse war nicht nur allein auf eine vermehrte Darmfüllung der pankreasgangligierten Tiere zurückzuführen, es zeigte sich dabei auch eine Längenzunahme des Dünndarmes (SCHWARZMAIER 2012; MÖSSELER et al.
2015b). Diese Befunde konnten mittlerweile in 2 nachfolgenden Studien bestätigt werden (MÖSSELER et al. 2014; 2015b). Neben der Dünndarmelongation waren bei pankreasgangligierten Tieren auch höhere Serumwerte von GLP-2, GLP-1 und GIP nachweisbar (MÖSSELER et al. 2015b), welche (vor allem GLP-2) für die intestinale Adaptation nach Dünndarmresektion relevant sind.
Vor diesem Hintergrund sollen in dieser Arbeit folgende Fragen bearbeitet und beantwortet werden.
1. Welche Abschnitte des Dünndarmes sind von der Elongation betroffen?
2. Bestehen histologische Unterschiede in der Tunica mucosa und der Tunica muscularis des Dünndarmes? Kommt es zu einer „Streckung“ des Darmrohres?
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3. Material und Methoden
3.1 Versuchsziel
Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welcher Darmabschnitt (Duodenum, Jejunum, Ileum) bei jungen Schweinen mit einer experimentell ausgelösten PEI mit einer Elongation reagiert. Darüber hinaus wurde auf das Vorhandensein möglicher Unterschiede im histologischen Aufbau der Darmwand der PL-Tiere im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren untersucht. Aufgrund der Probenentnahme in der vorangegangenen Studie (Entnahme von Proben im Abstand von zwei Metern) war es nicht möglich, die exakte Länge der verschiedenen Dünndarmabschnitte zu bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit (Punkt 3.3) wurde daher die offene Kernfrage, welche Abschnitte des Dünndarmes genau von der Elongation betroffen sind, anhand einer weiteren experimentellen Studie behandelt.
An den in dieser Untersuchung genutzten Tieren wurde zudem auf die Auswirkungen der PEI bei jungen Individuen auf das Körperwachstum eingegangen. Da in der vorangegangenen Studie (MÖSSELER et al. 2015b) die größten Effekte der PEI auf die Länge des Dünndarmes bei Tieren beobachtet wurden, bei denen die experimentelle Auslösung der PEI im Alter von 16 Wochen erfolgte, wurde die Operation der Tiere im zweiten Teil dieser Studie analog dazu im Alter von 16 Wochen vorgenommen.
Es wurden folgende Parameter bestimmt:
Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben von Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI aus einer vorangegangen Studie.
Lichtmikroskopische Untersuchung
o Zuordnung der einzelnen Proben zu den entsprechenden Darmabschnitten (Duodenum/Jejunum/Ileum) anhand histologischer Merkmale
o Messung der Schichtdicken des Jejunums (Tunica mucosa, Tunica muscularis) in der HE-Färbung
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Immunhistochemische Untersuchungen
o Färbung mittels PCNA-Antikörper (Proliferationsmarker)
o Färbung mittels Chromogranin A-Antikörper (Marker für enteroendokrine Zellen)
Zweiter Teil: Eigene tierexperimentelle Untersuchungen an jungen Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI
Futteraufnahme der Tiere
Wachstum der Tiere (kontinuierliche Erfassung während der 10-wöchigen Versuchsphase)
o Körpermasse o Brustumfang
o Bauchumfang auf Höhe des Nabels o Röhrbeinumfang
o Nasen-Steiß-Länge
Makroskopische Untersuchung des Magendarmtraktes
o Organmassen und Länge des GIT und seiner einzelnen Abschnitte
Chymusparameter
o Chymusmasse (g uS)
o Trockensubstanz-Gehalt (g/kg uS) o Chymusmasse (g TS)
o pH-Wert
o Rohnährstoffe (Rohprotein, Rohfett, Stärke)
o Gehalt an Chromoxid (Marker zur Bestimmung der Verdaulichkeit)
Der Versuch ist unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-15/1910 der Bezirksregierung Hannover genehmigt.
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3.2 Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben von Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI aus einer vorangegangen Studie
3.2.1 Tiere und Versuchsaufbau
Die untersuchten Gewebeproben entstammen einer vorherigen Studie (MÖSSELER et al. 2015b). Dabei wurden 19 juvenile Hausschweine in vier Gruppen eingeteilt: eine Kontrollgruppe mit vier gesunden Tieren und drei Gruppen mit pankreasgangligierten Tieren. Die Kontrollgruppe wurde im Alter von sieben Wochen einer Schein-OP unterzogen. Bei zehn Tieren wurde in der siebten Lebenswoche der Pankreasgang ligiert (im Weiteren als PL7 Gruppe bezeichnet), wovon fünf dieser Tiere ab der neunten Lebenswoche zusätzlich zum Alleinfutter eine orale Vitaminsubstitution (90,000 I.E. Vitamin A, 500 I.E. Vitamin D und 600 mg Vitamin E pro kg Futter-TS) erhielten (PL7VIT Gruppe). Bei den letzten fünf Tieren wurde erst im Alter von 16 Wochen der Pankreasgang ligiert (PL16 Gruppe). Alle Tiere erhielten ein Alleinfuttermittel. In der 26. Lebenswoche wurden alle Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen (s. Abb. 4).
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus (Modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
34 3.2.2 Probenentnahme:
Während der Sektion wurde das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entnommen und vom Gekröse befreit. Der Dünndarm wurde in mäanderförmigen Schlingen ausgebreitet und die Länge gemessen. Beginnend hinter dem Pylorus wurden im Abstand von jeweils zwei Metern Gewebeproben von ca. 3 cm x 3 cm Größe genommen (s. Abb. 5, die gelben Markierungen kennzeichnen die Lokalisation der Probenentnahme). Dabei wurde die letzte Gewebeprobe kurz vor der Ileo-Caecal-Klappe, unabhängig zum Abstand zur vorherigen Probe, entnommen. Die entnommenen Gewebeproben wurden in neutral gepuffertem Formalin nach Lillie fixiert.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Gewebeprobenentnahme (gelbe Kästchen); die rote Markierung kennzeichnet den Pylorus, die blaue Markierung das Caecum (modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
3.2.3 Histologische Untersuchungen
3.2.3.1 Probenverarbeitung
Aus den in Formalin fixierten Gewebeproben wurde nach makroskopischer Beurteilung jeweils ein 0,5 x 1 cm großes Darmstück geschnitten und in eine Einbettungskassette gelegt. Die Einbettungskassetten wurden anschließend für zwei Stunden unter fließendem Leitungswasser gespült. Über Nacht erfolgte die Entwässerung sowie die Durchtränkung der Proben mit flüssigem Paraffin im Einbettautomat ASP 300 S (Leica
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Biosystems GmbH, Wetzlar). Die aufsteigende Alkoholreihe diente der Entwässerung und das Xylol als Intermedium zur Überführung in flüssiges Paraffin. Soweit nicht anders angegeben, kamen die Reagenzien im Einbettautomaten bei Raumtemperatur (RT) zum Einsatz.
Protokoll der Paraffineinbettung
70% Ethanol I 2 Stunden oder länger (Präinkubation) 70% Ethanol II 1,5 Stunden
80% Ethanol 1,5 Stunden 90% Ethanol 1,5 Stunden 100% Ethanol I 1 Stunde 100% Ethanol II 1 Stunde Isopropanol 1 Stunde Xylol 1 Stunde Xylol bei 35°C 1 Stunde Xylol bei 50°C 1 Stunde Paraffin I bei 59°C 1 Stunde Paraffin II bei 59°C 1 Stunde Paraffin III bei 59°C 1 Stunde
Am nächsten Tag wurden die Gewebeproben mit Hilfe der Ausgießstation Leica E61150H (Leica Biosystems GmbH, Wetzlar) in Paraffinblöcke eingebettet. Nach Aushärtung der Blöcke wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica 1512, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) vier µm dicke Schnitte erstellt und in einem mit 37°C warmem Aqua dest. gefüllten Wasserbad (GFL Gesellschaft für Labortechnik m.b.H.
&Co, Burgwedel) gestreckt. Diese Schnitte wurden auf silanbeschichtete Objektträger (Objektträger Histobond®, Paul-Marienfeld GmbH&CoKG, Lauda-Königshofen) aufgezogen und über Nacht bei 60°C im Wärmeschrank getrocknet.
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Vorbehandlung der Schnitte für histologische Färbungen und immunhistochemische Untersuchungen
Aus den oben genannten Gewebeproben wurden für die Färbungen (HE) sowie für die immunhistochemischen Untersuchungen (IHC) Objektträger mit jeweils einem Gewebeschnitt hergestellt. Nach Einbringen der Objektträger in ein Glasschiffchen wurden diese nach folgendem Protokoll entparaffiniert und rehydriert.
Entparaffinieren:
Xylol I 10 Minuten Xylol II 10 Minuten
Rehydratation:
Isopropanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten
80% Ethanol 2 Minuten (histologische Färbungen) 80% Ethanol + 3%iges H2O2 30 Minuten (IHC)
70% Ethanol 2 Minuten
Die nach der Färbung bzw. IHC anschließende Dehydratation erfolgte für die HE-Färbung sowie für die IHC nach identischem Schema:
Dehydratation:
70% Ethanol 2 Minuten 80% Ethanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten Isopropanol 2 Minuten Xylol I 5 Minuten Xylol II 5 Minuten
Danach erfolgte das Eindecken der Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
37 3.2.3.2 Histologische Färbungen
Für die Überprüfung der Qualität und Intaktheit der Schnitte sowie zur Beurteilung der Gewebemorphologie wurde die HE-Färbung genutzt. Die Zusammensetzung der Lösungen für die HE-Färbung ist im Anhang aufgelistet (s. Abschnitt Nr. 13.1.2).
Hämatoxylin-Eosin Färbung
Für die HE-Färbung wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Entparaffinierung und Rehydratation s. Abschnitt 3.2.3.1.
Färbung:
Aqua dest. 2 Minuten Hämalaun nach Delafield 8 Minuten 0,1% HCl (in Aqua dest.) 3-4 x spülen fließendes Leitungswasser 15 Minuten 0,1% Eosin in Aqua dest. + 3-4 Tropfen Eisessig 5 Minuten Aqua dest. 2 Minuten
Nach anschließender Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg) eingedeckt.
3.2.3.3 Immunhistochemische Färbungen
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
Für die immunhistochemische Darstellung des Polypeptides PCNA wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Nach Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über die Dauer von je fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Danach erfolgte eine 20-minütige Inkubation der Gewebeschnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A-6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer, um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Human Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Klon PC10, Maus IgG2a, monoklonal, BioGenex, Fremont California, USA) in einer
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Verdünnung von 1:6000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Spülen in PBS der Sekundärantikörper (Envision Mouse, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung zugegeben und für 30 Minuten belassen (feuchte Kammer bei Raumtemperatur). Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einem adäquaten Farbumschlag behandelt und direkt danach in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Danach erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus der Maus stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
Chromogranin A
Die Darstellung des Proteins Chromogranin A mit spezifischen Antikörpern erfolgte an Gewebeschnitten von formalinfixierten Gewebeproben. Nach der Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase durch eine Behandlung mit 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über jeweils fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte bei 96-99°C in einem Citratpuffer (eigene Rezeptur des Anatomischen Institutes der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; beschrieben u.a. FRANZ 2013) 20 Minuten gekocht. Nach Abkühlung auf 60°C und einmaligem Spülen in TBS-T erfolgte eine 20-minütige Inkubation der Schnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A-6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Chromogranin A; synthetisches Peptid, entspricht humanem Chromogranin A aa 1-100, N-terminal; Kaninchen IgG, polyklonal, Abcam
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plc, Cambridge, UK) in einer Verdünnung von 1:16000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde, nach dreimaligem Spülen in PBS, der Sekundärantikörper (Envision Rabbit, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung aufgetragen und für 30 Minuten inkubiert (feuchte Kammer bei RT). Anschließend wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle entwickelt und direkt im Anschluss erst in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Abschließend erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (siehe oben) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus dem Kaninchen stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
3.2.3.4 Lichtmikroskopische Untersuchung
Zunächst wurden von den Gewebeproben jeder Entnahmelokalisation HE-gefärbte
Zunächst wurden von den Gewebeproben jeder Entnahmelokalisation HE-gefärbte