3. Material und Methoden
3.2 Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben
3.2.1 Tiere und Versuchsaufbau
Die untersuchten Gewebeproben entstammen einer vorherigen Studie (MÖSSELER et al. 2015b). Dabei wurden 19 juvenile Hausschweine in vier Gruppen eingeteilt: eine Kontrollgruppe mit vier gesunden Tieren und drei Gruppen mit pankreasgangligierten Tieren. Die Kontrollgruppe wurde im Alter von sieben Wochen einer Schein-OP unterzogen. Bei zehn Tieren wurde in der siebten Lebenswoche der Pankreasgang ligiert (im Weiteren als PL7 Gruppe bezeichnet), wovon fünf dieser Tiere ab der neunten Lebenswoche zusätzlich zum Alleinfutter eine orale Vitaminsubstitution (90,000 I.E. Vitamin A, 500 I.E. Vitamin D und 600 mg Vitamin E pro kg Futter-TS) erhielten (PL7VIT Gruppe). Bei den letzten fünf Tieren wurde erst im Alter von 16 Wochen der Pankreasgang ligiert (PL16 Gruppe). Alle Tiere erhielten ein Alleinfuttermittel. In der 26. Lebenswoche wurden alle Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen (s. Abb. 4).
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus (Modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
34 3.2.2 Probenentnahme:
Während der Sektion wurde das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entnommen und vom Gekröse befreit. Der Dünndarm wurde in mäanderförmigen Schlingen ausgebreitet und die Länge gemessen. Beginnend hinter dem Pylorus wurden im Abstand von jeweils zwei Metern Gewebeproben von ca. 3 cm x 3 cm Größe genommen (s. Abb. 5, die gelben Markierungen kennzeichnen die Lokalisation der Probenentnahme). Dabei wurde die letzte Gewebeprobe kurz vor der Ileo-Caecal-Klappe, unabhängig zum Abstand zur vorherigen Probe, entnommen. Die entnommenen Gewebeproben wurden in neutral gepuffertem Formalin nach Lillie fixiert.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Gewebeprobenentnahme (gelbe Kästchen); die rote Markierung kennzeichnet den Pylorus, die blaue Markierung das Caecum (modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
3.2.3 Histologische Untersuchungen
3.2.3.1 Probenverarbeitung
Aus den in Formalin fixierten Gewebeproben wurde nach makroskopischer Beurteilung jeweils ein 0,5 x 1 cm großes Darmstück geschnitten und in eine Einbettungskassette gelegt. Die Einbettungskassetten wurden anschließend für zwei Stunden unter fließendem Leitungswasser gespült. Über Nacht erfolgte die Entwässerung sowie die Durchtränkung der Proben mit flüssigem Paraffin im Einbettautomat ASP 300 S (Leica
35
Biosystems GmbH, Wetzlar). Die aufsteigende Alkoholreihe diente der Entwässerung und das Xylol als Intermedium zur Überführung in flüssiges Paraffin. Soweit nicht anders angegeben, kamen die Reagenzien im Einbettautomaten bei Raumtemperatur (RT) zum Einsatz.
Protokoll der Paraffineinbettung
70% Ethanol I 2 Stunden oder länger (Präinkubation) 70% Ethanol II 1,5 Stunden
80% Ethanol 1,5 Stunden 90% Ethanol 1,5 Stunden 100% Ethanol I 1 Stunde 100% Ethanol II 1 Stunde Isopropanol 1 Stunde Xylol 1 Stunde Xylol bei 35°C 1 Stunde Xylol bei 50°C 1 Stunde Paraffin I bei 59°C 1 Stunde Paraffin II bei 59°C 1 Stunde Paraffin III bei 59°C 1 Stunde
Am nächsten Tag wurden die Gewebeproben mit Hilfe der Ausgießstation Leica E61150H (Leica Biosystems GmbH, Wetzlar) in Paraffinblöcke eingebettet. Nach Aushärtung der Blöcke wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica 1512, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) vier µm dicke Schnitte erstellt und in einem mit 37°C warmem Aqua dest. gefüllten Wasserbad (GFL Gesellschaft für Labortechnik m.b.H.
&Co, Burgwedel) gestreckt. Diese Schnitte wurden auf silanbeschichtete Objektträger (Objektträger Histobond®, Paul-Marienfeld GmbH&CoKG, Lauda-Königshofen) aufgezogen und über Nacht bei 60°C im Wärmeschrank getrocknet.
36
Vorbehandlung der Schnitte für histologische Färbungen und immunhistochemische Untersuchungen
Aus den oben genannten Gewebeproben wurden für die Färbungen (HE) sowie für die immunhistochemischen Untersuchungen (IHC) Objektträger mit jeweils einem Gewebeschnitt hergestellt. Nach Einbringen der Objektträger in ein Glasschiffchen wurden diese nach folgendem Protokoll entparaffiniert und rehydriert.
Entparaffinieren:
Xylol I 10 Minuten Xylol II 10 Minuten
Rehydratation:
Isopropanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten
80% Ethanol 2 Minuten (histologische Färbungen) 80% Ethanol + 3%iges H2O2 30 Minuten (IHC)
70% Ethanol 2 Minuten
Die nach der Färbung bzw. IHC anschließende Dehydratation erfolgte für die HE-Färbung sowie für die IHC nach identischem Schema:
Dehydratation:
70% Ethanol 2 Minuten 80% Ethanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten Isopropanol 2 Minuten Xylol I 5 Minuten Xylol II 5 Minuten
Danach erfolgte das Eindecken der Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
37 3.2.3.2 Histologische Färbungen
Für die Überprüfung der Qualität und Intaktheit der Schnitte sowie zur Beurteilung der Gewebemorphologie wurde die HE-Färbung genutzt. Die Zusammensetzung der Lösungen für die HE-Färbung ist im Anhang aufgelistet (s. Abschnitt Nr. 13.1.2).
Hämatoxylin-Eosin Färbung
Für die HE-Färbung wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Entparaffinierung und Rehydratation s. Abschnitt 3.2.3.1.
Färbung:
Aqua dest. 2 Minuten Hämalaun nach Delafield 8 Minuten 0,1% HCl (in Aqua dest.) 3-4 x spülen fließendes Leitungswasser 15 Minuten 0,1% Eosin in Aqua dest. + 3-4 Tropfen Eisessig 5 Minuten Aqua dest. 2 Minuten
Nach anschließender Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg) eingedeckt.
3.2.3.3 Immunhistochemische Färbungen
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
Für die immunhistochemische Darstellung des Polypeptides PCNA wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Nach Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über die Dauer von je fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Danach erfolgte eine 20-minütige Inkubation der Gewebeschnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A-6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer, um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Human Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Klon PC10, Maus IgG2a, monoklonal, BioGenex, Fremont California, USA) in einer
38
Verdünnung von 1:6000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Spülen in PBS der Sekundärantikörper (Envision Mouse, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung zugegeben und für 30 Minuten belassen (feuchte Kammer bei Raumtemperatur). Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einem adäquaten Farbumschlag behandelt und direkt danach in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Danach erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus der Maus stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
Chromogranin A
Die Darstellung des Proteins Chromogranin A mit spezifischen Antikörpern erfolgte an Gewebeschnitten von formalinfixierten Gewebeproben. Nach der Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase durch eine Behandlung mit 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über jeweils fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte bei 96-99°C in einem Citratpuffer (eigene Rezeptur des Anatomischen Institutes der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; beschrieben u.a. FRANZ 2013) 20 Minuten gekocht. Nach Abkühlung auf 60°C und einmaligem Spülen in TBS-T erfolgte eine 20-minütige Inkubation der Schnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A-6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Chromogranin A; synthetisches Peptid, entspricht humanem Chromogranin A aa 1-100, N-terminal; Kaninchen IgG, polyklonal, Abcam
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plc, Cambridge, UK) in einer Verdünnung von 1:16000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde, nach dreimaligem Spülen in PBS, der Sekundärantikörper (Envision Rabbit, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung aufgetragen und für 30 Minuten inkubiert (feuchte Kammer bei RT). Anschließend wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle entwickelt und direkt im Anschluss erst in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Abschließend erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (siehe oben) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus dem Kaninchen stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
3.2.3.4 Lichtmikroskopische Untersuchung
Zunächst wurden von den Gewebeproben jeder Entnahmelokalisation HE-gefärbte Paraffinschnitte erstellt und diese anhand histologischer Merkmale den jeweiligen Darmabschnitten (Duodenum, Jejunum, Ileum) zugeordnet. Gleichzeitig wurde dabei auf die Intaktheit des Gewebes und auf den Anschnitt im richtigen Winkel (möglichst 90°) geachtet. Konnte ein Schnitt diese Anforderungen nicht erfüllen, wurde bei der weiteren Auswertung (Bestimmung der Schichtdicken) auf einen Schnitt aus einer angrenzenden Gewebeprobe zurückgegeriffen. Die Schichtdicken der Tunica mucosa und Tunica muscularis des Jejunums wurden in den HE-gefärbten Schnitten bestimmt.
Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen wurde von insgesamt drei Personen unabhängig voneinander vorgenommen. Dabei lagen die Proben verblindet vor. Die Auswertungen der HE-gefärbten Schnitte sowie die Schnitte der immunhistochemischen Färbungen wurden mit Hilfe des Axioskops (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena) und der Mikroskopkamera DP-70 inklusive Software DP-Soft (Olympus Europa GmbH, Hamburg) durchgeführt.
40 Beurteilung der Gewebearchitektur
Um eine Übersicht über das gesamte Jejunum zu bekommen, wurden für jedes Tier Gewebeschnitte von jeweils 3 Gewebeproben aus dem vorderen (0-25% der Länge), mittleren (40-60% der Länge) und hinteren Abschnitt (75-100% der Länge) des Jejunums ausgewertet. Pro Gewebeschnitt wurden mindestens zehn möglichst in einem 90° Winkel angeschnittene Zotten vermessen. Es wurde die Zottenlänge, die Kryptentiefe, die Höhe der gesamten Tunica mucosa (Zotten + Krypten) sowie die Dicke des Stratum circulare, des Stratum longitudinale und die Gesamtdicke der Tunica muscularis in Anlehnung an (DRUCKER et al. (1996); MARTIN et al. (2005);
SIGALET et al. (2014)) ermittelt. Die Messungen wurden in der 25-fachen Vergrößerung durchgeführt.
Bestimmung der PCNA-positiver Zellkerne
Die Auswertung der PCNA-Färbung gliederte sich in 2 Teile und wurden in Anlehnung an SIGALET et al. (2014) durchgeführt:
1. Bestimmung des Anteils PCNA-positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa
Es wurde für jedes Tier jeweils ein Gewebeschnitt aus einer Gewebeschnittserie aus dem vorderen (0-25% der Länge), mittleren (40-60% der Länge) und hinteren Bereich (75-100% der Länge) des Jejunums ausgewertet, sodass sich eine Anzahl von 3 Gewebeschnitten pro Tier ergab. Pro Schnitt wurden 10 longitudinal angeschnittene Krypten ausgewertet und die Anzahl an positiven Zellkernen im Verhältnis zur Gesamtzahl an Zellkernen in den Krypten bestimmt. Die Auswertung wurde in der 200-fachen Vergrößerung vorgenommen.
2. Bestimmung der PCNA positiven Zellkerne in der Tunica muscularis
Für die Bestimmung PCNA-positiver Zellkerne in der Tunica muscularis wurde jeweils ein Gewebeschnitt aus der gleichen Schnittserie wie für die Bestimmung des Anteils PCNA-positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa genutzt. Dadurch ergaben sich identische Lokalisationen und Anzahl von Schnitten je Tier. Pro
41
Gewebeschnitt wurden zehn Gesichtsfelder ausgewertet und die Anzahl an positiven Zellkernen im Stratum circulare und Stratum longitudinale je Gesichtsfeld bestimmt.
Die Auswertung wurde in der 200-fachen Vergrößerung vorgenommen.
Bestimmung der Anzahl Chromogranin A-positiv gefärbter Zellen je Gesichtsfeld in der Tunica mucosa
Die Anzahl Chromogranin A-positiv gefärbter Zellen je Gesichtsfeld in der Tunica mucosa wurde für jedes Tier jeweils an einem Gewebeschnitt aus der gleichen Serie der Gewebeschnitte durchgeführt, die auch für die Bestimmung des Anteils PCNA-positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa zum Einsatz kam. Dadurch ergaben sich eine identische Lokalisation und Anzahl von Schnitten je Tier. Pro Schnitt wurden ebenfalls zehn Gesichtsfelder durchgemustert und die Anzahl an positiven Zellkernen in der Tunica mucosa je Gesichtsfeld bestimmt. Die Auswertung wurde in der 200-fachen Vergrößerung vorgenommen.
3.3 Zweiter Teil: Untersuchungen an Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI (eigener Fütterungsversuch)
3.3.1 Zielsetzung und Versuchsaufbau
Ziel der Durchführung war, die makroskopische Bestimmung der verschiedenen Darmabschnitte anhand anatomischer Strukturen (z.B. Plica duodenocolica, Plica ileocaecalis) zur Klärung der Frage, welche Darmabschnitte bei Vorliegen einer PEI verlängert ist. Die Untersuchungen erfolgten vergleichend an gesunden Kontrolltieren und an pankreasgangligierten Tieren. Im Versuchsverlauf wurden sowohl Köpermasse als auch Körpermaße kontinuierlich ermittelt. In der 26. Lebenswoche wurden die Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen. Dabei wurden neben der Länge der einzelnen Darmabschnitte auch die Organgewichte und deren Inhalt bestimmt sowie Gewebeproben aus Duodenum, Jejunum, Ileum und Caecum entnommen.
42 3.3.2 Eingesetzte Tiere
Zu Beginn des Versuches waren die Tiere (acht weibliche deutsche Masthybriden) 15 Wochen alt. Bei fünf Tieren wurde in der 16. Lebenswoche der Ausführungsgang des Pankreas ligiert und dadurch eine PEI induziert. Die übrigen drei Tiere wurden in der 16. Lebenswoche einer Schein-OP unterzogen und gemeinsam mit den pankreasgangligierten Tieren (PL-Tiere) eingestallt. In Tabelle 2 sind die Daten der einzelnen Tiere (Körpermasse zum Zeitpunkt der Operation, Einteilung in die Gruppen) dargestellt.
Tabelle 2: Im Versuchsteil 2 genutzte Tiere, ihre Kennzeichnung, Körpermasse zu Versuchsbeginn und Gruppenzugehörigkeit (PL16 = pankreasgangligierte Tiere)
Tier Nr. Körpermasse (kg) Gruppe
28 56,0 Kontrolle
29 55,5 Kontrolle
80 54,5 PL16
81 53,5 PL16
83 58,5 PL16
84 56,0 PL16
93 59,5 PL16
97 44,5 Kontrolle
3.3.2.1 Operationstechnik zur Induktion der pankreatischen exokrinen Insuffizienz
Narkose
Als Anästhesie wurde eine Injektionsnarkose verwendet. Diese bestand aus Ursotamin® (Serumwerk Bernburg AG, Bernburg) in einer Dosierung von 0,023 mg Ketaminhydrochlorid/kg Köpermasse (KM) und Stresnil® (Elanco™ Deutschland
43
GmbH, Bad Homburg) in einer Dosierung von 2 mg Azaperon/kg KM. Sofern die Narkosetiefe nicht ausreichend war, wurde ggf. eine weitere Injektion vorgenommen (Ursotamin®, Hälfte der Initialdosis)
Ligatur des Pankreasganges
Die Ligatur des Pankreasganges erfolgte nach der von TABELING et al. (1998) beschriebenen Methode. Nach Vorbereitung des OP-Feldes wurde die Bauchhöhle ca.
5 cm kaudal des Schaufelknorpels in der Linea alba über etwa 10 cm eröffnet.
Anschließend wurde der Ductus pancreaticus accessorius aufgesucht, freigelegt, doppelt ligiert und durchtrennt. Danach wurde die Bauchhöhle in drei Schichten verschlossen.
Operation der Kontrolltiere („Schein-Operation“)
Die OP der Kontrolltiere gestaltete sich wie bei den PL-Tieren, allerdings wurde die Ligatur des Pankreasganges unterlassen. Im Bereich des Duodenums wurde stattdessen einige Minuten lang manipuliert. Dazu wurden der Darm und das Pankreasgewebe manuell durchtastet, um – abgesehen von der Pankreasgangligatur - vergleichbare Bedingungen zu den PL-Tieren zu schaffen.
Postoperative Versorgung
Die Tiere wurden nach der Operation dreimalig in Abstand von 48h antibiotisch mit Duphamox L.A.® (Zoetis Deutschland GmbH, Berlin) in einer Dosierung von 15 mg Amoxicillin/kg KM und 3 Tage lang analgetisch mit Metacam® (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein) in einer Dosierung von 8 mg Meloxicam/kg KM/Tag intramuskulär versorgt. Das Nahtmaterial der Hautnaht wurde nach 10 Tagen entfernt.
3.3.2.2 Überprüfung der Funktion des exokrinen Pankreas
Eine Woche nach der Operation wurde der Chymotrypsingehalt im Kot mittels Chymotrypsin-Kit® (Fa. Immundiagnostik AG, Bensheim) ermittelt. Die Tiere mit einer Chymotrypsinkonzentration unter 0,9 I.E./g Kot wurden als PEI Tiere definiert.
44 3.3.2.3 Haltung
Die Tiere wurden jeweils zu zweit einstreulos auf unperforiertem Boden in Stallabteilungen mit einer Größe von ca. 1 x 3 m gehalten. Der Liegebereich war mit Gummimatten ausgelegt, die Lufttemperatur betrug im Mittel 18°C. Durch große Fenster war ein Tageslichteinfall gegeben. Das Deckenlicht wurde manuell gesteuert und bei Bedarf genutzt. Wasser war über Nippeltränken jederzeit verfügbar.
3.3.2.4 Fütterung
Das eingesetzte Mischfutter wurde im Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Chargen von je 300kg gemischt. Die Zusammensetzung ist in den Tabellen 3 und 4 dargestellt. Die Futtermenge wurde kontinuierlich gesteigert. Um Futterverluste zu vermeiden, wurde jedoch die Futtermenge an die Futteraufnahme der Tiere angepasst, sodass am nächsten Morgen keine bzw. nur geringe Futterreste vorhanden waren.
Tabelle 3: Zusammensetzung des verwendeten Mischfutters (Komponenten) Komponente % - Anteil der Mischung
Weizen 35,5
Gerste 30,3
Sojaschrot 15,0
Leinöl 5,00
Magermilchpulver 5,00
Sojaöl 3,00
Mineralfutter F401 3,00
Bierhefe 2,00
Tryptophan 0,56
Lysin 0,30
Threonin 0,20
Methionin 0,15
1 Zusammensetzung siehe Abschnitt 13.8
45
Tabelle 4: Chemische Zusammensetzung des verwendeten Mischfutters (Analyse)
1.Charge 2.Charge 3.Charge g/kg uS
TS 911 905 901
g/kg TS
Ra 51,9 49,2 50,9
Rp 191 190 204
Rfe 96,2 105 103
Rfa 43,7 36,4 41,8
NfE 528 525 501
Stärke 407 402 398
Zucker 57,6 56,2 58,3 mg/kg TS
Cu 24,9 15,1 20,4
Zn 103 117 113
Fe 328 272 294
Mn 106 110 109
3.3.3 Sektion
Nachdem die Tiere für 10 Wochen in den Stallungen des Instituts für Physiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgestallt waren, erfolgte die Euthanasie und Sektion der Tiere. Aus organisatorischen Gründen konnten nicht alle Tiere zur gleichen Zeit bzw. am gleichen Tag euthanasiert und seziert werden. In der Übersicht 1 sind die einzelnen Tiere und deren Euthanasiezeitpunkt dargestellt. In der Woche, in der die Sektion durchgeführt wurde, erfolgte die Fütterung aller Tiere täglich um 06:00 Uhr morgens.
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Übersicht 1: Darstellung der Sektionszeitpunkte der einzelnen Tiere, grau hinterlegte Felder markieren die Kontrolltiere
Uhrzeit Montag Dienstag Donnerstag Freitag
09:00 29 80 83 28
12:00 93 97 84 81
Es wurden stets beide in einer Bucht zusammen gehaltene Tiere an einem Tag euthanasiert und seziert. Die Tiere der verschiedenen Gruppen wurden dabei alternierend (früher Zeitpunkt um 9:00 bzw. späterer Zeitpunkt um 12:00) euthanasiert, um einen Effekt des Zeitpunktes der Sektion auf die Versuchsergebnisse zu minimieren. Da die Gruppengrößen nicht identisch waren (Kontrolltiere: n=3;
pankreasgangligierte Tiere (PL-Tiere): n=5) war, eine vollständige Angleichung nicht möglich (s. Übersicht 1)
Ablauf:
1. Wägung: Die Tiere wurden am Tag der Sektion unmittelbar vor dem Transport über eine Viehwaage geführt, um die aktuelle Körpermasse zu ermitteln und danach auf einen Transportwagen verbracht.
2. Narkose: Auf dem Transportwagen erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion von Ketamin (Ursotamin® Serumwerk Bernburg AG, Bernburg in einer Dosierung von 0,023 mg Ketaminhydrochlorid/kg KM) und Azaperon (Stresnil® Elanco™ Deutschland GmbH, Bad Homburg) in einer Dosierung von 2 mg Azaperon/kg KM). Nach dem Erreichen einer ausreichenden Narkosetiefe wurden die Tiere vom Physiologischen Institut in die Sektionshalle des Anatomischen Instituts der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht.
3. Bestimmung der Körpermaße und Blutentnahme: Mittels Maßband wurden Brust-, Bauch- und Röhrbeinumfang sowie die Nasen-Steißlänge bestimmt. Im Anschluss wurde das Herz auf der linken Körperseite aufgesucht und mit einer Kanüle (TSK-Supra Sonderkanüle, 1,2 mm x 100 mm, Fa. Erhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen) punktiert. Es erfolgte die Entnahme von Blutproben (S-Monovetten® (9ml) der Firma Sarstedt).
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4. Euthanasie: Die Euthanasie erfolgte durch die intracardiale Injektion von T61® (Fa. Intervet, Unterschleißheim; Wirkstoffe: Tetracainhydrochlorid, Embutramid, Mebezoniumjodid; Dosierung: 0,24 ml/kg i.c.). Durch den Stillstand des Herzens, dem Ausbleiben des Cornealreflexes sowie geweitete lichtstarre Pupillen wurde der Tod der Tiere festgestellt.
5. Eröffnung der Bauchhöhle: Der Bauch der Tiere wurde zunächst trocken gereinigt und danach entlang der Linia alba eröffnet. Im Anschluss wurden an der rechten und linken Bauchwand Entlastungsschnitte gesetzt.
6. Aufsuchen und Kennzeichnung der einzelnen Darmabschnitte: Im ersten Schritt wurde der Übergang des Pylorus in das Duodenum aufgesucht und dort zwei Ligaturen gesetzt. Danach erfolgte das Aufsuchen des Überganges vom Duodenum zum Jejunum. Dort wurden ebenfalls zwei Ligaturen gesetzt. Als nächstes wurde anhand der Plica ileocaecalis das Ende des Jejunums bzw. der Beginn des Ileums bestimmt und ebenfalls mit zwei Ligaturen versehen. Jeder Dünndarmabschnitt wurde an seinem oralen und aboralen Ende mittels entsprechender Schilder markiert. Zum Schluss erfolgte das Aufsuchen des colo-rectalen Überganges. Nach doppelter Ligierung wurde dieser durchtrennt.
Nach der Durchtrennung des Überganges Pylorus-Duodenum wurde das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entnommen.
7. Längenbestimmung der Darmabschnitte: Das entnommene Darmkonvolut wurde zunächst in Dünn- und Dickdarm getrennt und von beiden Teilen jeweils die Masse mit Inhalt bestimmt. Danach erfolgten die Trennung des Dünndarms vom Gekröse und die meanderförmige Anordnung auf einem Sektionstisch. Mit einem Maßband wurde die Länge des gesamten Dünndarms sowie der einzelnen Abschnitte bestimmt. Es erfolgte zusätzlich eine Längenbestimmung des ebenfalls vom Gekröse befreiten und linear ausgelegten Colons. Am Caecum wurden darüber hinaus Länge und Breite bestimmt.
8. Entnahme der Chymusproben aus dem Darm: Nach der Längenbestimmung wurden die jeweiligen Dünndarmabschnitte getrennt und entleert. Dabei wurden sowohl die Masse der Ingesta als auch das Leergewicht der einzelnen Darmabschnitte bestimmt. Das gleiche Vorgehen wurde für das Caecum sowie für das Colon angewendet. Der Magen wurde nach institutsüblicher Unterteilung mit vier Darmklemmen (s. WINTERMANN 2011) geviertelt, der Inhalt separat aufgefangen und die Masse des entleerten Organs bestimmt.
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9. Entnahme von Gewebeproben: Während der Sektion wurden von jedem Tier Gewebeproben aus dem Duodenum, Jejunum und Ileum gewonnen. Dabei wurden aus dem Duodenum und Ileum jeweils drei Proben (Anfang des Darmabschnittes, Mitte, Ende des Darmabschnittes) entnommen. Aus dem Jejunum wurden aufgrund der Länge dieses Darmabschnittes jeweils fünf Proben gewonnen: am Anfang (0%), bei 25%, bei 50% und bei 75% der Gesamtlänge sowie am Ende (100%) des Darmabschnittes. Die entnommenen Gewebeproben wurden in PBS gewaschen, mit Stecknadeln auf Moosgummiquadraten befestigt und in Bouin-Lösung zur Fixierung gegeben.
Um eine Autolyse zu vermeiden erfolgte die Probenentnahme möglichst zeitnah zur Euthanasie.
10. Aus dem Tierkörper wurden der Magen, das Pankreas, der Thymus und das Herz entnommen. Die Masse von Magen und Herz wurden durch Wägung ermittelt. Pankreas und Thymus wurden für die histologische Untersuchung aufbereitet.
3.3.4 Probenentnahme
3.3.4.1 Körpermaße
Alle zwei Wochen wurden die Körpermaße Brust-, Bauch-, Röhrbeinumfang und Nasen-Steißlänge jeden Tieres mit einem Maßband bestimmt.
Alle zwei Wochen wurden die Körpermaße Brust-, Bauch-, Röhrbeinumfang und Nasen-Steißlänge jeden Tieres mit einem Maßband bestimmt.