Untersuchungen zu den Effekten
einer exokrinen Pankreasinsuffizienz auf das Längenwachstum und den histologischen Aufbau
des Dünndarmes junger Schweine
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
– Doctor medicinae veterinariae – ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Bianca Ahlfänger
Haltern am See
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung Univ. Prof. Dr. R. Brehm Anatomisches Institut
Univ. Prof. Dr. J. Kamphues Institut für Tierernährung
1. Gutachter Univ. Prof. Dr. R. Brehm/Univ. Prof. Dr.
J. Kamphues
2. Gutachter Univ. Prof. Dr. A. Beineke Institut für Pathologie
Tag der mündlichen Prüfung 07.11.2016
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen präsentiert:
70. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie Hannover, 8.-10. März 2016
AHLFÄNGER, B.; A. MÖSSELER; M. LANGEHEINE; R. BREHM, J. KAMPHUES (2016): Histological changes of the jejunal wall in elongated small intestine resulting due to an exocrine pancreatic insufficiency (EPI). Proceedings of the society of nutrition physiology 25, 106
Inhalt
1. Einleitung ... 9
2. Schrifttum ... 11
2.1. Aufgaben des Verdauungsapparates (Apparatus digestorius) ... 11
2.2 Anatomie ... 11
2.2.1. Dünndarm (Intestinum tenue)... 11
2.2.2 Pankreas ... 19
2.3 Entwicklung des Darmes/Organwachstum ... 20
2.3.1 Embryonale Entwicklung des Darmes ... 20
2.3.2 Postnatale Entwicklung des Verdauungstraktes ... 21
2.3.3 Organwachstum ... 22
2.4 Intestinale Adaptation ... 22
2.4.1 Intestinale Adaptation nach Dünndarmresektion ... 23
2.5 Gastrointestinale Hormone ... 25
2.5.1 Inkretinhormone ... 25
2.6 Exokrine Pankreasinsuffizienz ... 28
2.7 Das pankreasgangligierte Schwein als Modelltier für die exokrine Pankreasinsuffizienz des Menschen ... 29
3. Material und Methoden ... 31
3.1 Versuchsziel ... 31
3.2 Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben von Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI aus einer vorangegangen Studie ... 33
3.2.1 Tiere und Versuchsaufbau ... 33
3.2.2 Probenentnahme: ... 34
3.2.3 Histologische Untersuchungen... 34
3.3 Zweiter Teil: Untersuchungen an Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI (eigener Fütterungsversuch) ... 41
3.3.1 Zielsetzung und Versuchsaufbau ... 41
3.3.2 Eingesetzte Tiere ... 42
3.3.3 Sektion ... 45
3.3.4 Probenentnahme ... 48
3.3.5 Untersuchungsparameter ... 49
3.3.6 Methoden zur Bestimmung von Rohnährstoffen, pH-Werten und
Chymotrypsingehalten ... 51
3.3.7 Verdaulichkeit ... 52
3.3.8 Aufbereitung der Gewebeproben und histologische Färbung ... 53
3.3.9 Statistische Auswertung ... 55
4. Ergebnisse ... 56
4.1 Teil 1 ... 56
4.1.1 Ergebnisse aus der lichtmikroskopischen Untersuchung und Messung der Schichtdicken in den Gewebeproben mittels HE-Färbung ... 56
4.1.2 Ergebnisse aus der histologischen Untersuchung von Darmgewebe mittels immunhistochemischer Färbungen (PCNA/Chromogranin A) ... 64
4.2 Teil 2 ... 69
4.2.1 Gesundheitszustand der Tiere ... 69
4.2.2 Futteraufnahme ... 69
4.2.3 Verdaulichkeit von Nährstoffen ... 70
4.2.4 Entwicklung von Körpermassen und Körpermaßen ... 71
4.2.5 Masse der Darmabschnitte und der Digesta der Tiere beider Gruppen zum Zeitpunkt der Sektion ... 75
4.2.6 Dünndarmlängen ... 80
4.2.7 Chymusparameter (TS-Gehalte, pH-Werte, flüchtige Fettsäuren) ... 82
4.2.8 Zellkern-Anzahl in der Tunica muscularis ... 86
5. Diskussion ... 88
5.1 Kritik der Methode ... 88
5.1.1 Auswahl des Modells ... 88
5.1.2 Anzahl der im Versuch genutzten Tiere ... 89
5.1.3 Veränderungen des endokrinen Pankreasgewebes ... 89
5.1.4 Zuordnung von Gewebeproben aus dem Dünndarm (Teil 1) ... 90
5.1.5 Messung der Schichtdicken im Jejunumgewebe (Teil 1) ... 91
5.1.6 Fütterung (Teil 2) ... 92
5.1.7 Sektionszeitpunkt (Teil 2) ... 93
5.1.8 Verdaulichkeit von Futterinhaltsstoffen (Teil 2) ... 94
5.1.9 Auswirkungen der PEI auf die Körpermasse, Körpermaße sowie die Längen und Massen der einzelnen Darmabschnitte ... 94
5.1.10 Welcher Darmabschnitt reagiert bei Vorliegen einer PEI mit einer Verlängerung? ... 96
5.1.11 Morphologie der bei PEI verlängerten Dünndarmabschnitte ... 97
5.1.12 Einfluss auf die Dichte an enteroendokrinen Zellen im Jejunum ... 103
5.2 Übergreifende Diskussion ... 103
6. Zusammenfassung ... 106
7. Summary ... 110
8. Abkürzungsverzeichnis ... 113
9. Literaturverzeichnis... 115
10. Abbildungsverzeichnis ... 128
11. Tabellenverzeichnis ... 130
12. Übersichtenverzeichnis ... 132
13. Anhang: ... 133
13.1 Lösungen für die angewendeten Fixierungen und Färbungen ... 133
13.1.1 Fixierlösungen ... 133
13.1.2 Lösungen für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 133
13.1.3 Lösungen für die Toluidinblau-Färbung ... 134
13.1.4 Puffer und Lösungen für die Immunhistochemie ... 134
13.2 Reagenzien ... 136
13.3 Antikörper ... 137
13.4 Verwendete Medikamente und medizinisches Material ... 137
13.5 Verwendete Geräte in der Histologie ... 137
13.6 Genutzte Materialien in der Histologie ... 138
13.7 Genutzte Geräte für die Futter- und Chymusanalysen ... 138
13.8 Chemische Zusammensetzung des eingesetzten Mineralfutters ... 139
13.9 Tabellen-Anhang ... 140
9
1. Einleitung
Die pankreatische exokrine Insuffizienz (PEI) ist eine Erkrankung, die unter anderem als Folge einer chronischen Pankreatitis (CP) auftritt. Auslöser einer CP sind beim erwachsenen Menschen z.B. ein übermäßiger Alkoholkonsum und eine Hyperlipidämie. Bei Kindern ist hingegen die autosomal rezessiv vererbte Krankheit Mukoviszidose als häufigste Ursache zu nennen (PANCREAS STUDY GROUP 2005).
Unter den Mukoviszidose-Patienten leiden etwa 87% an einer PEI (KRISTIDIS et al.
1992).
Obwohl keine Tierart der Physiologie des menschlichen Verdauungstraktes vollkommen entspricht (NEJDFORS u. WESTRÖM 1997), weist das porcine Verdauungssystem im Bezug auf die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten mit dem des Menschen eine hohe Übereinstimmung auf und ist daher in besonderem Maße zur Untersuchung ernährungsphysiologischer Fragestellungen geeignet (MOUGHAN et al. 1994). Durch Ligatur des Pankreasganges kann beim Schwein eine vollständige exokrine Insuffizienz ausgelöst werden, während die endokrine Funktion über Jahre unbeeinflusst ist. Somit kann das pankreasgangligierte Schwein als Modell für den an PEI erkrankten Menschen dienen (ABELLO et al. 1989).
Im Rahmen einer vorangegangen Dissertation (SCHWARZMAIER 2012) und darauffolgenden Studien (MÖSSELER et al. 2014, 2015b) zeigte sich bei pankreasgangligierten Schweinen ohne Enzymsubstitution eine deutliche Längenzunahme des Dünndarms, die im Mittel 6 Meter innerhalb von 10 Wochen betrug. In der Studie von MÖSSELER et al. (2014) konnten außerdem bei Schweinen mit einer PEI höhere GLP-2 Werte im Serum gemessen werden. GLP-2-Serumwerte können als klinischer Marker für die Intensität der intestinalen Adaptation nach einer massiven Darmresektion dienen (PARIS et al. 2004). Die intestinale Adaptation des verbliebenen Darmes besteht aus einer Darmelongation, Hypertrophie der Tunica muscularis und Hyperplasie der Tunica mucosa, nicht zuletzt als Reaktion auf den Verlust von funktionalem Gewebe durch Krankheit oder Operation (TAYLOR u.
FULLER 1994). Das in Studien zur intestinalen Adaptation üblicherweise genutzte Tiermodell ist die massive Dünndarmresektion („massive small bowel resection“, MSBR), bei der 70-80% des Dünndarms entfernt und die verbliebenen Teile reanastomosiert werden (TAYLOR u. FULLER 1994).
10
GLP-2 wird von intestinalen L-Zellen sezerniert (GUNAWARDENE et al. 2011, DRUCKER 2006). Der primäre Stimulus für die GLP-2-Sekretion aus intestinalen L- Zellen, welche sich v.a. im Ileum und Colon befinden, ist die Konzentration und Masse von Nährstoffen, insbesondere von Kohlenhydraten und Fetten, im Darmlumen bzw.
Chymus (XIAO et al. 1999).
Im Falle einer PEI ist die praecaecale Verdaulichkeit von Fett, Rohprotein und Stärke erheblich beeinträchtigt (MÖSSELER et al. 2006), was die vermehrte Anflutung von nichtabsorbierten Nährstoffen und eine erhöhte Sekretion von GLP-2 zur Folge hat und so vermutlich die Längenzunahme des Dünndarmes erklärt (MÖSSELER et al.
2015b). In den MSBR-Modellen reagieren die verbliebenen Darmabschnitte im Rahmen einer intestinalen Adaptation (TAYLOR u. FULLER 1994). Im Modell der PEI beim Schwein sind hingegen alle Abschnitte des Darmes vorhanden, sodass sich die Frage stellt, welche Abschnitte des Dünndarmes reagieren (ob z.B. das Dünndarmwachstum proportional erfolgt), ob alle Schichten des Dünndarmes von der Elongation gleichermaßen betroffen sind und welche (molekularen) Mechanismen dem insgesamt zu Grunde liegen. In dieser Arbeit sollen daher folgende Kernfragen beantwortet werden:
- Welche Abschnitte des Dünndarms reagieren bei Vorliegen einer nicht therapierten PEI? Reagiert der Dünndarm über die gesamte Länge hinweg in gleicher Weise mit einer Längenzunahme, oder sind nur einzelne Abschnitte dazu in der Lage?
- Ist die Längenzunahme des Dünndarmes durch einen physiologischen Aufbau des Gewebes charakterisiert, oder bestehen Unterschiede im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren bzw. gibt es Unterschiede in der Reaktion der verschiedenen Gewebeschichten (Tunica mucosa/Tunica muscularis)?
- Welche Mechanismen führen zu einer Dünndarmelongation bzw. welche Signalwege sind hierbei aktiv?
11
2. Schrifttum
2.1. Aufgaben des Verdauungsapparates (Apparatus digestorius)
Der Verdauungsapparat setzt sich aus verschiedenen Organen zusammen, deren Aufgabe es ist, die aufgenommene Nahrung soweit in ihre Bestandteile aufzuschließen, dass eine Absorption in das Körperinnere erfolgen kann. Der Prozess der Verdauung beginnt mit der mechanischen Zerkleinerung der Nahrung in der Maulhöhle und wird dabei durch Enzyme des Speichels unterstützt. Nach Abschlucken der Nahrung werden die Kohlenhydrate im Darm weiter verdaut. Sekrete aus dem Magen, Pankreas und der Gallenblase dienen der Spaltung von Proteinen, Fetten und Stärke. Die entstehenden Endprodukte (Monosaccharide, Aminosäuren, Fettsäuren und Glyceride) werden transzellulär durch das Epithel der Darmwand absorbiert und stehen somit dem Körper als Energiequelle und Bausteine zur Verfügung. Neben den enzymatisch gespaltenen Stoffen gelangen Wasser, Elektrolyte und Vitamine ebenfalls durch die Darmwand in den Körper (LIEBICH 2010).
2.2 Anatomie
2.2.1. Dünndarm (Intestinum tenue)
Der Dünndarm besteht aus drei strukturell und funktionell unterschiedlichen Abschnitten, dem Duodenum, Jejunum und Ileum (LIEBICH 2010). Seine Länge beträgt beim Schwein das 15-fache der Körperlänge, sodass sich bei ausgewachsenen Hausschweinen 16-21 Meter ergeben. Auf das Duodenum (Zwölffingerdarm) entfallen dabei lediglich 0,70-0,95 Meter, auf das Jejunum (Leerdarm) 14-19 Meter und auf das Ileum (Hüftdarm) etwa 0,7-1 Meter (NICKEL et al. 2004).
12
2.2.1.1 Lage der Abschnitte des Dünndarmes in der Bauchhöhle
Duodenum:
Das Duodenum entspringt aus dem Pylorus des Magens. Seine Pars cranialis zieht caudodorsal über die viscerale Fläche der Leber hinweg und verläuft cranial der rechten Niere in einer S-förmigen Krümmung, um dann mittels der Flexura cranialis in die Pars descendens überzugehen (NICKEL et al. 2004). Die Pars descendens ist an einem Gekröse befestigt und verläuft ventral der rechten Niere nach caudal und biegt mit der Flexura caudalis nach links und cranial um. Die folgende Pars ascendens verläuft dicht neben der Medianen nach dorsal und wird vom Colon descendens, welches über die Plica duodenocolica mit dem Duodenum verbunden ist, begleitet (NICKEL et al. 2004; MCANULTY 2012). In situ entzieht sich das Duodenum der direkten Betrachtung, da es mit der Basis des Kolonkegels verklebt ist (NICKEL et al.
2004). Auf Höhe der Arteria mesenterica cranialis schlägt das Duodenum, eng am Colon transversum anliegend, nach rechts um und geht nach einem scharfen Bogen in das Jejunum über (NICKEL et al. 2004). Das Ende der Plica duodenocolica markiert den Anfang des Jejunums (MCANULTY 2012).
Jejunum:
Das Jejunum, bestehend aus vielen Schlingen, ist über die Gekröseplatte (Mesenterium craniale), welche an ihrem Ansatz zur Gekrösewurzel gerafft ist, dorsal im Abdomen befestigt (NICKEL et al. 2004; MCANULTY 2012). Es nimmt einen Großteil der rechten Bauchhöhlenhälfte ein, einige Schlingen finden sich aber auch im linken ventralen Bereich (NICKEL et al. 2004).
Ileum:
Das Ileum ist durch die Plica ileocaecalis, die etwas stärkere Muskulatur und das Vorkommen von Lymphgewebe in Form von Peyer’schen Platten charakterisiert (NICKEL et al. 2004). Es verläuft vom Jejunum aus in craniodorsale Richtung und endet im Caecum (MCANULTY 2012).
13 2.2.1.2 Funktionen des Dünndarmes
Die bereits im Vorderdarm (Speiseröhre und Magen) begonnene Spaltung der Futterbestandteile wird durch die Digestionsvorgänge im Dünndarm fortgesetzt und für einige Futterbestandteile abgeschlossen (LIEBICH 2010). Dazu wird im Duodenum die Ingesta aus dem Magen mit Sekreten aus Pankreas, Leber und dem Darm selbst vermengt (MCANULTY 2012). Nicht verdaute Stärke, oder auch Strukturkohlenhydrate (z.B. Cellulose und Pektine) werden beim Schwein teilweise vom Dickdarm, welcher als Gärkammer fungiert, durch mikrobielle Enzyme zu kurzkettigen Fettsäuren (Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure) abgebaut (LIEBICH 2010; ENGELHARDT et al. 2010). Im Dünndarm werden Polysaccharide durch Pankreas-α-Amylase und die intestinale 1,6-Glukosidase zu Monosacchariden abgebaut (LIEBICH 2010). Die entstandenen Monosaccharide (Glukose, Galaktose und Fruktose) werden hauptsächlich im Duodenum und Jejunum absorbiert (MCANULTY 2012). Der weitestgehend vollständige Abbau von Proteinen (Polypeptiden) zu Aminosäuren und deren Absorption findet bis zum Ende des Jejunums bzw. dem Beginn des Ileums statt (LIEBICH 2010; JEEJEEBHOY 2002). Die Verdauung von Triacylglycerinen beginnt im Magen durch die linguale bzw. gastrale Lipase (ENGELHARDT et al. 2010) und wird im Dünndarm durch die pankreatische Lipase, welche mit Abstand die bedeutendste Lipase ist, fortgeführt. Die Triacylglycerine werden zu Monoacylgylzerinen und freien Fettsäuren abgebaut (LIEBICH 2010; ENGELHARDT et al. 2010). Konjugierte Gallensäuren werden für die Emulgierung der wasserunlöslichen Triacylglycerine und die Micellenbildung der Spaltprodukte benötigt und ermöglichen damit eine Aufnahme der entstandenen freien Fettsäuren und Monoacylglycerine (ENGELHARDT et al. 2010). Dieser Mechanismus tritt im gesamten Dünndarm auf, ist aber im Duodenum und im ersten Drittel des Jejunums am effektivsten (MCANULTY 2012). Neben der Sekretion des enzymaktiven Darmsaftes sezernieren die Epithelzellen der Darmschleimhaut darüber hinaus Mukus, welcher der Zytoprotektion der inneren Darmoberfläche dient. In endokrinen Zellen der Darmschleimhaut erfolgt außerdem die Bildung von Gewebshormonen, gleichzeitig werden über die Schleimhaut Wasser, Elektrolyte und Vitamine absorbiert (LIEBICH 2010). Darüber hinaus ist die Darmschleimhaut das flächenmäßig größte lymphatische Organ des Körpers (LIEBICH 2010). Beim Schwein kommt das lymphoretikuläre Gewebe in der Schleimhaut sowohl in Form von Einzellymphknötchen (Lymphonoduli solitarii), als auch in Gestalt von
14
Lymphknötchenplatten (Lymphonoduli aggregati oder auch Peyer‘sche Platten) vor.
Letztere sind im Dünndarm des Schweines besonders zahlreich. Im Durchschnitt sind es 20-30 Platten mit einer mittleren Länge von 100 Millimetern (5-500 mm). Die letzte Lymphknötchenplatte des Dünndarmes besitzt eine Länge von 1,15-3,20 Metern. Sie erstreckt sich über das gesamte Ileum hinweg, tritt auf dessen Mündungsstück, die Papilla ilealis über und setzt sich, dabei breiter werdend, bis zu 100 Millimeter weit auf die angrenzende Schleimhaut des Colons fort (NICKEL et al. 2004).
2.2.1.3 Histologischer Aufbau des Dünndarmes
A. Aufbau der Schichten
A.1 Schleimhaut (Tunica mucosa)
Die Oberflächenvergrößerung der Darmschleimhaut, welche eine hohe Absorptionsoberfläche sicherstellt, wird durch die im Dünndarm quer zur Längsachse des Darmrohrs makroskopisch sichtbaren permanenten Falten (Plicae circulares) erreicht. Diese verlieren von cranial nach caudal an Höhe. Die bindegewebige Grundlage dieser Querfalten wird durch die lockeren Fasergeflechte der Tela submucosa gebildet. Die gesamte Schleimhaut weist zudem Dünndarmzotten (Villi intestinales) auf, welche fingerförmige Ausstülpungen der Lamina propria mucosae darstellen und von einem einschichtigen Epithel (Epithelium mucosae) überzogen sind (LIEBICH 2010). Die Dünndarmzotten besitzen eine Länge von 0,5-1,5 Millimetern und tragen wesentlich zur Oberflächenvergrößerung der Schleimhaut bei. Sie sind im Jejunum am längsten und vergleichsweise kurz im Duodenum und Ileum. Zusätzlich stülpen die Epithelzellen sämtlicher Dünndarmabschnitte oberflächlich einen dichten Mikrovillibesatz aus, der die resorptionsaktive Darmoberfläche noch weiter erhöht (LIEBICH 2010). Des Weiteren wird die Schleimhaut durch Einstülpungen in die Lamina propria mucosae in Form von schlauchförmigen geraden und unverzweigten Darmdrüsen (Glandulae intestinales, Lieberkühn-Drüsen, Krypten) charakterisiert (LIEBICH 2010). Die Krypten münden an der Schleimhautoberfläche. Die Öffnungen der Krypten sind bei Lupenvergrößerung sichtbar (NICKEL et al. 2004). Neben den im gesamten Darmkanal vorkommenden Krypten gibt es in der Submucosa des
15
Duodenums gelegene Drüsen (Glandulae duodenales, Brunnersche Drüsen). Diese erstrecken sich über das gesamte Duodenum, zum Teil auch in das Jejunum hinein, wobei individuelle Variationen in der Ausprägung zu beobachten sind (NICKEL et al.
2004). Die Oberfläche der Zotten und die epitheliale Wandauskleidung der Krypten werden von einem einschichtigen, hochprismatischen Epithel (Epithelium mucosae) gebildet (s. Abb. 1). Die Epithelzellen am Grund der Krypten sind undifferenziert und unterliegen ständiger mitotischer Teilung. Die Tochterzellen schieben sich lumenwärts zur Zottenspitze, um kontinuierlich die abgeschilferten Epithelzellen der Zottenwand zu ersetzen (LIEBICH 2010).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des histologischen Aufbaus einer Darmzotte (modifiziert nach Liebich 2010)
16
Die Tunica mucosa des Darmes ist durchgehend eine echte Schleimhaut und besteht aus verschiedenen Zellpopulationen mit unterschiedlicher Struktur und Funktion (LIEBICH 2010):
- Enterozyten - Becherzellen - endokrine Zellen - Paneth-Zellen
Das Epithel (Epithelium mucosae) wird von einer durchgehenden Basalmembran von der Lamina propria mucosae getrennt. Diese subepitheliale Schicht aus lockerem Bindegewebe schließt Blut- und Lymphgefäße, Nervenfasergeflechte, Immunzellen, Mastzellen und Muskelzellen ein und bildet die Trägerschicht der Schleimhaut. Die Schleimhaut schließt gegenüber der Tela submucosa mit der Lamina muscularis mucosae aus glatten Muskelzellen ab (LIEBICH 2010).
A.2 Tela submucosa
Die Tela submucosa besteht aus lockerem Bindegewebe und enthält neben Blut- und Lymphgefäßen, vegetative Ganglien (Plexus nervorum submucosus, Meißner-Plexus) und freie Immunzellen (Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen). Die Tela submucosa übernimmt zusammen mit der Lamina propria mucosae entscheidende Aufgaben in der Immunabwehr (LIEBICH 2010).
A.3 Tunica muscularis
Die Tunica muscularis, bestehend aus glatter Muskulatur, setzt sich aus einer inneren, zirkulären (Stratum circulare) und einer äußeren, längsverlaufenden Muskelschicht (Stratum longitudinale) zusammen. Zwischen den Muskelschichten verlaufen Blut- und Lymphgefäße sowie vegetative Nerven, welche autonome Ganglien (sog. Plexus nervorum myentericus, Auerbach-Plexus) bilden. Die Muskelschichten sind für den Transport des Darminhaltes in kaudale Richtung verantwortlich. Durch peristaltische
17
Bewegungen wird zudem die Durchmischung des Darminhaltes gesichert (LIEBICH 2010).
B. Zellen der Tunica mucosa und der Tunica muscularis
B.1 Enteroendokrine Zellen
Enteroendokrine Zellen (EEC) liegen intraepithelial in der Wand der Glandulae intestinales (Krypten). Sie synthetisieren Peptidhormone und geben diese in Form von Sekretgranula inkretorisch an das eng anliegende Kapillarnetz ab (LIEBICH 2010).
EECs haben einen schmalen Apex, der bis in das Lumen reicht und eine breitere Basis. Jede Zelle ist mit den Nachbarzellen durch junktionale Komplexe und Desmosomen verbunden. Der Nucleus, der den größten Teil der Zelle ausmacht, ist von ovaler Form und enthält fein granuliertes Chromatin. Das Zytoplasma der EECs beinhaltet kleine Bündel aus Filamenten, welche üblicherweise in der Nachbarschaft der Kernhülle zu finden sind (CHENG u. LEBLOND 1974). EECs kommen im gesamten Darmtrakt vor (STERNINI et al. 2008), dabei finden sich mehr EECs in den Krypten (besonders in der Kryptenbasis) als in den Villi. Die EECs stellen 0,6% der Epithelzellen in den duodenalen und den jejunalen sowie 0,4% in den ilealen Krypten (CHENG u. LEBLOND 1974). EECs sind Tochterzellen von kryptenbasierten hochprismatischen Zellen, die als die Stammzellen für das gesamte Darmepithel gelten, und werden gemeinsam mit Enterozyten und Becherzellen von der Kryptenbasis zur Darmoberfläche geschoben, wo sie schließlich in das Darmlumen abgeschilfert werden (CHENG u. LEBLOND 1974). Die EECs werden in unterschiedliche Zelltypen eingeteilt, abhängig von ihrer Morphologie, der Synthese intestinaler Hormone (z.B. GLP-1) oder Marker-Gen-Expression (VAN DER FLIER u.
CLEVERS 2009).
B.1.1 L-Zellen
L-Zellen gehören zu den enteroendokrinen Zellen des Darmes und kommen vom Duodenum bis zum Rektum vor, wobei sie oral des terminalen Ileum nur spärlich gesät sind. Der Anteil der L-Zellen an der Zellpopulation ist im Rektum am Größten. L-Zellen produzieren GLP-1, GLP-2, PYY und Oxyntomodulin (5-HT) (GUNAWARDENE et al.
18
2011). L-Zellen stellen durch ihre apikale Oberfläche eine Verbindung zwischen den im Darmlumen befindlichen Nährstoffen und über ihre basolaterale Oberfläche mit dem neuronalen und vaskularen Gewebe her (BAGGIO u. DRUCKER 2007).
B.2 Glatte Muskulatur
Die glatte Muskulatur ist überwiegend mesenchymalen Ursprungs und besteht aus glatten Muskelzellen (GABELLA 2012). Die zeitliche Koordinierung und die Mechanismen der Differenzierung der Stammzellen in glatte Muskelzellen sind unklar.
Es ist zudem noch unbekannt, ob der Vorgang reversibel ist, oder ob die Stammzellen einen gewissen Grad an Pluripotenz behalten (GABELLA 2002). Die viszerale glatte Muskulatur ist schon kurz nach der Geburt gut ausdifferenziert und ähnelt jener adulter Lebewesen. Dabei bestehen allerdings deutliche Unterschiede zwischen der glatten Muskulatur verschiedener Organe bezüglich des Zeitpunktes der Entwicklung und der Wachstumsrate. Zum Beispiel ist die glatte Muskulatur des Darmes zum Zeitpunkt der Geburt wesentlich differenzierter als die des Vas deferens (GABELLA 2002). Trotz der Homogenität der Phänotypen in der Muskelzellpopulation ist ein Vorkommen von Mitose in ausgereiften Muskelzellen und die Degeneration von Muskelzellen möglich:
Zellteilung und Zelltod können in jedem viszeralen glatten Muskel zu jedem Zeitpunkt im Leben beobachtet werden (GABELLA 2012). In situ und im nicht kontrahierten Zustand sind viszerale glatte Muskelzellen schlank, mehrere hundert Mal länger als breit und mehr als 20 Mal länger als ihr Nukleus. Das Zellvolumen beträgt 2000-4000 µm³. Die Zellmaße variieren nur wenig zwischen den verschiedenen Tierarten und korrelieren nicht mit der Körpergröße (GABELLA 2012). Die Muskelzellen sind im Stratum circulare marginal größer als im Stratum longitudinale. Im Dünn- und Dickdarm sind die Muskelzellen in der Zirkulärmuskelschicht mit zahlreichen Gap- Junctions ausgestattet, wohingegen in der Längsmuskelschicht keine Gap-Junctions gefunden werden (GABELLA 2012).
19 2.2.2 Pankreas
Die Bauchspeicheldrüse (syn. das Pankreas) ist eine Drüse, die sich zusammen mit der Leber aus dem hepato-pankreatischen Ring der embryonalen Darmanlage entwickelt (LIEBICH 2010). Beim Schwein setzt sich das Pankreas aus einem kleineren, rechten Lappen und einem großen linken Lappen sowie aus dem sie verbindenden Corpus zusammen. Über das Corpus hinweg zieht die Pfortader zur Leber und wird von caudodorsal zusätzlich von einem gabelförmigen Abschnitt des Pankreas überbrückt, welcher den rechten mit dem linken Lappen verbindet (NICKEL et al. 2004). Als Ausführungsgang bleibt in der Mehrzahl der Fälle von den beiden ursprünglich angelegten Gängen (der ventralen und der dorsalen Anlage) nur der Ausführungsgang der dorsalen Anlage bestehen (NICKEL et al. 2004). Dieser als Ductus pancreaticus accessorius bezeichnete Gang entspringt aus dem rechten Lappen des Pankreas und mündet 20-25 cm hinter dem Pylorus auf der Papilla duodeni minor in der Pars descendens des Duodenums (NICKEL et al. 2004). Jedoch ist ein Vorkommen zusätzlicher Ausführungsgänge aus dem Corpus möglich (MCANULTY 2012). So haben 5-18% aller Schweine 2 Ausführungsgänge (IMONDI et al. 1972; CORRING u. BOURDON 1977; ABELLO et al. 1989; MÖSSELER 2016).
Das Gewebe des Pankreas besteht aus kleinen Läppchen, die durch Bindegewebe locker verbunden sind. Im frischen Zustand ist es blass rot und zersetzt sich nach dem Tod durch Autolyse und verfällt durch die aus dem Darm eingewanderten Bakterien schnell der Fäulnis (NICKEL et al. 2004). Im Pankreas werden zwei Zellsysteme unterschieden: ein exokrin-sekretorischer (Pars exocrina pancreatis) und ein endokrin- inkretorischer (Pars endocrina pancreatis oder auch Inselapparat) Teil (LIEBICH 2010). Der exokrine Teil des Pankreas ist eine tubuloazinös zusammengesetzte, seröse Drüse, welche in ihrer Grundstruktur der Ohrspeicheldrüse ähnelt (LIEBICH 2010). Dieser Teil des Pankreas bildet Verdauungsenzyme, welche die Spaltung von Fett, Stärke und Protein ermöglichen. Daneben bildet der endokrine Teil (Inselapparat) z.B. Insulin und Glukagon. Beides sind Hormone, die für die Regulation des Blutzuckerspiegels eine wichtige Rolle spielen. Dieser hormonproduzierende Teil des Pankreas besteht aus Epithelzellhaufen (Langerhans-Inseln), die den Ausführungsgängen der Drüse nicht angeschlossen sind und von einem dichten Kapillarnetz durchzogen werden (NICKEL et al. 2004).
20 2.3 Entwicklung des Darmes/Organwachstum
2.3.1 Embryonale Entwicklung des Darmes
Ein großer Anteil des Wachstums des Gastrointestinaltraktes (GIT) verläuft während der Gestation (KLURFELD 1999). Bei der Krümmung und Abhebung des Embryos entsteht aus dem Entoderm die Darmrinne, welche sich zum primitiven Darmrohr schließt. Der kraniale Teil des Darmrohres beinhaltet die vordere Darmbucht, die von der vorderen Darmpforte bis zur Rachenmembran (Membrana stomatopharyngealis) reicht und sich zum Vorderdarm (Proenteron) entwickelt (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Zwischen der vorderen und der mittleren Darmpforte befindet sich die Mitteldarmhöhle, welche zunächst über den Darmnabel mit dem Dottersack verbunden ist. Die Mitteldarmhöhle entwickelt sich zum Mitteldarm (Mesenteron), wobei sich der Darmnabel zum Ductus omphaloentericus verengt (SCHNORR u. KRESSIN 2011).
Die hintere Darmbucht erstreckt sich von der hinteren Darmpforte bis zur Kloakenmembran (Membrana cloacalis) und entwickelt sich zum Hinterdarm (Metenteron). Der terminale Abschnitt der hinteren Darmbucht erweitert sich zur Kloake (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Aus dem Vorderdarm entstehen der Pharynx und seine Derivate, der ventrale Anteil des Atmungsapparates, die Speiseröhre, der Magen, das Duodenum bis zur Einmündung des Gallenganges, die Leber und das Pankreas. Der restliche Teil des Duodenums, das Jejunum, Ileum, Caecum und das Colon bis zur Mitte des Colon transversum entwickeln sich aus dem Mitteldarm. Der Hinterdarm bildet die linke Hälfte des Colon transversum, das Colon descendens und die Kloake (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Der primitive Darm stellt ein gestreckt verlaufendes Rohr dar, welches am Dorsalgekröse befestigt ist. Nur das Duodenum besitzt an seinem Anfangsteil bis zur Einmündung des Ductus choledochus ein ventrales Gekröse (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Durch starkes Längenwachstum des Darmrohres mit einhergehender Verlängerung des Gekröses entsteht die primitive Darmschleife, in deren Gekröse sich die Arteria mesenterica cranialis aus der rechten Dottersackarterie entwickelt und bis zur Mitte der Schleife zieht (SCHNORR u.
KRESSIN 2011). Der horizontale Teil der Schleife kann als Duodenum, der absteigende Schenkel als Jejunum, der Scheitel mit Dottersackstiel als Jejunum und Ileum, der aufsteigende Schenkel als Caecum, Colon ascendens und transversum und der horizontale Endteil als Colon descendens und Rektum bezeichnet werden
21
(SCHNORR u. KRESSIN 2011). Durch starkes Längenwachstum setzt die Achsendrehung um die A. mesenterica cranialis ein. Die erste Drehung beträgt 180°.
Weiteres Längenwachstum führt zur Herausbildung der einzelnen Darmabschnitte und gleichzeitig wird die Drehung bis zu 360° weitergeführt, dabei bildet sich der kranial geöffnete Bogen des Duodenums und die kaudal offene Schleife des Colons. Das Duodenum behält die charakteristische Schleifenform bei allen Tierarten bei. Durch rasches Längenwachstum des absteigenden Schenkels der Darmschleife zeigt das Jejunum schon frühzeitig eine starke Schlingenbildung. Nach Ausbildung des Caecums wird das Ileum als letzter Abschnitt des Dünndarmes durch die Plica ileocaecalis markiert (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Alle Schichten des Darmes entwickeln sich, mit Ausnahme des Epithels und der Drüsen, aus dem Mesoderm.
Dabei entsteht zuerst die Muskulatur des Darms. Das Stratum longitudinale entwickelt sich später als das Stratum circulare, trotzdem differenzieren und reifen beide Muskelschichten im Anschluss gleichzeitig (GABELLA 2002). Danach entwickelt sich die Lamina muscularis mucosae (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Das Epithel, welches sich zusammen mit den Drüsen aus dem Entoderm entwickelt, ist zunächst mehrschichtig und verlegt das gesamte Darmlumen. Später differenziert es sich in das bleibende einschichtige, hochprismatische Oberflächenepithel und gibt das Lumen des Darmes frei (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Die Darmzotten entwickeln sich aus rein epithelialen Primordialzotten, welche sich nach dem Erhalt mesenchymaler Einlagerungen zu Sekundärzotten entwickeln und sich im Weiteren durch Teilung vermehren. Die Vermehrung der Krypten erfolgt ebenfalls durch Teilung (SCHNORR u. KRESSIN 2011).
2.3.2 Postnatale Entwicklung des Verdauungstraktes
Nach der Geburt reagiert der GIT des Schweines auf Nahrungsaufnahme wesentlich stärker mit Wachstum, als der restliche Körper. Besonders stark reagieren das Jejunum und das Ileum (WIDDOWSON 1985). Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Geburt steigt die absolute Masse des Duodenums um 42% (ausgehend von der Masse zum Zeitpunkt der Geburt). 10 Tage post natum wiegt das Duodenum das 5- fache der ursprünglichen Masse (zum Zeitpunkt der Geburt). Das Jejunum zeigt innerhalb der ersten 24 Stunden eine Zunahme der Masse von 70% und ein Längenwachstum von 22%. In den darauffolgenden Tagen verlangsamt sich das
22
Wachstum. Am 10. Tag post natum wiegt das Jejunum das 4-fache der Masse im Vergleich zum Zeitpunkt der Geburt. Das Ileum reagiert in den ersten 24 Stunden p.n.
in gleicherweise wie das Jejunum und weist ein Längenwachstum von 24% auf (WIDDOWSON 1985). Das Schwein bzw. das Ferkel wiegt 10 Tage p.n. ca. das 3 bis 4-fache des Geburtsgewichtes (WIDDOWSON 1985).
2.3.3 Organwachstum
Die Größe eines Tieres, bzw. dessen Organe wird von der Anzahl und Größe der Zellen sowie der Masse an extrazellulärer Matrix und Flüssigkeit, aus der es besteht, bestimmt (CONLON u. RAFF 1999). Alle Organe und Gewebe wachsen und entwickeln sich in Abhängigkeit zur Körpergröße und der genetischen Veranlagung des betreffenden Organismus (WIDDOWSON 1985; CONLON u. RAFF 1999).
Trotzdem können einige Organe ein gesteigertes Wachstum im adulten Organismus zeigen. Beispiele dafür sind: Herz, Lunge, Leber, Niere, Magen-Darm-Trakt und Skelettmuskulatur (WIDDOWSON 1985). Systemische Faktoren beeinflussen die endgültige Größe eines Organs, so zum Beispiel das Wachstumshormon Growth hormon (GH), welches eine wichtige Rolle in der Stimulation des postnatalen Wachstums von Säugetieren spielt (CONLON u. RAFF 1999). Das GH stimuliert das Wachstum, indem es die Leber und andere Organe dazu anregt, Insulin-linke growth factor 1 (IGF-1) zu produzieren (CONLON u. RAFF 1999). Daneben spielen aber auch andere Faktoren, wie zum Beispiel die Nährstoffversorgung, eine Rolle (CONLON u.
RAFF 1999). So ist bekannt, dass der Gastrointestinaltrakt bei einer erhöhten Futteraufnahme an Länge zunimmt (WIDDOWSON 1985). Bei laktierenden Ratten konnte eine Längenzunahme des Dünndarmes um 77% zwischen dem 12. und 20.
Tag der Laktation im Vergleich zu nicht trächtigen Tieren gezeigt werden (FELL et al.
1963).
2.4 Intestinale Adaptation
Die intestinale Adaptation ist ein Prozess, welcher es dem Darm ermöglicht, das physiologische und morphologische Gleichgewicht bei wechselnden Bedingungen des Umfeldes beizubehalten (BRISTOL u. WILLIAMSON 1988). So kommt es z.B. wie in WIENEMANN et al. (2011) beschrieben, zu Unterschieden in der Caecumlänge von
23
Auerhähnen (Tetrao urogallus). Bedingt durch das unterschiedliche Nahrungsspektrum im Sommer bzw. Winter, welches einen Einfluss auf die Zusammensetzung der Bakterienpopulation in den Caeca nimmt, kommt es bei wilden Auerhähnen im Winter zu einer Längenzunahme der Caeca. Ein weiteres Beispiel ist die Längenzunahme der Caeca bei Moorschneehühnern im Winter, wenn während dieser Jahreszeit nur Heidekraut als alleiniges Futtermittel zur Verfügung steht (MOSS 1989).
2.4.1 Intestinale Adaptation nach Dünndarmresektion
Veränderungen, die bei einer Adaptation des Darmes nach einer Resektion beobachtet werden, sind eine Dilatation des Darmrohres, eine Zunahme der Darmwanddicke und eine Längenzunahme des Darmes (WEALE et al. 2005).
Mikroskopisch kann eine Zunahme in Höhe und Durchmesser der Villi, eine Elongation der Krypten und eine erhöhte Proliferationsrate sowie eine reduzierte Apoptoserate der Epithelzellen beobachtet werden (WEALE et al. 2005). Der verbliebene Darm zeigt außerdem eine forcierte Nährstoffabsorption durch eine vergrößerte Absorptionsfläche und eine Reduzierung der Darmmotilität, um einen intensiveren Kontakt zwischen Nährstoffen und Tunica mucosa zu ermöglichen (TAYLOR u. FULLER 1994;
TAPPENDEN 2014). Die intestinale Adaptation wird von vielen Faktoren reguliert, unter anderem spielen Nährstoffe im Darmlumen eine wichtige Rolle. Unterschiede im Nährstoffgehalt der Nahrung (oral oder enteral appliziert) verändern die strukturellen und funktionellen Merkmale der Adaptation des Darmes (TAPPENDEN 2006).
Insbesondere Fett (langkettige Triglyceride gleichermaßen wie kurzkettige Fettsäuren) scheint die Adaptation zu fördern (TAPPENDEN 2014). Ebenfalls scheint die aus der Fermentation malabsorbierter Kohlenhydrate und nicht verdauter Strukturkohlenhydrate entstandene Buttersäure ein wichtiges trophisches Signal im Rahmen der intestinalen Adaptation nach einer massiven Dünndarmresektion zu sein (BURRIN et al. 2001; TAPPENDEN et al. 2003). Die lokale Wirkung nicht absorbierter Nährstoffe im Darmlumen würde außerdem eine Erklärung für das adaptive Wachstum des Darmes distal des resezierten Darmstückes (TAYLOR u. FULLER 1994) darstellen. Jedoch ist es schwierig, die direkten trophischen Effekte der Nährstoffe von jenen der endogenen Wachstumsfaktoren, welche durch das Vorhandensein der Nährstoffe im Darmlumen ausgeschüttet werden, zu differenzieren (TAYLOR u.
24
FULLER 1994). Eine Vielzahl an intestinotrophischen Faktoren ist bekannt (s. Tab.1), unter anderem das rekombinante humane Wachstumshormon (Somatropin) (TAPPENDEN 2014). In früheren Studien konnte außerdem eine Elongation des Darmes (ORSKOV et al. 2005) und eine Zunahme der Villuslänge (DRUCKER et al.
1996; SIGALET et al. 2014) durch eine exogene Gabe von GLP-2 gezeigt werden.
Das GLP-2 Analog Teduglutide und das rekombinant hergestellte Somatotropin wurden zur klinischen Anwendung bei erwachsenen Patienten mit Short-Bowel Syndrom zugelassen (TAPPENDEN 2014).
Tabelle 1: Intestinotrophische Faktoren und ihre Wirkung (Modifiziert nach WEALE et al. 2005)
Faktor Wirkung (experimentell)
Growth Hormon (GH) Darmlänge und Funktion pro Längeneinheit↑
(Effekte werden vermutlich über Insulin-like growth factors vermittelt)
Insulin-like growth factor
IGF-1 Proliferation von Kryptenzellen und glatten Muskelzellen↑
Epidermal growth factors
EGF, TGFα Enterozytenproliferation↑, Apoptoserate↓
Glucagon-like peptide
GLP-2 Kryptenzellproliferation↑ u.a., siehe Kapitel 2.3 Andere
Hepatocyte growth factor
Masse des verbliebenen Darmes nach Resektion↑
Keratinocyte growth factor
Epithelzellproliferation↑, Apoptoserate↓
Neurotensin Villuslänge↑ (Wirkung möglicherweise über Proglukagon abgeleitete Peptide)
Leptin Kohlenhydrat-Aufnahme aus dem Lumen↑
Interleukin 11 Epithelproliferation↑, Absorption von Kohlenhydraten bei hoher Dosierung↑
25 2.5 Gastrointestinale Hormone
2.5.1 Inkretinhormone
Inkretine sind Darmhormone, welche die Insulinsekretion nach der Nahrungsaufnahme in einer Glukose-abhängigen Weise potenzieren. Die beiden am besten untersuchten Hormone sind das Glucose-dependent insulinotropic Peptid (GIP) und das Glucagon- like Peptide-1 (GLP-1). Beide Hormone wirken über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die vornehmlich von β-Zellen der Langerhans-Inseln exprimiert werden. Die GLP-1 und GIP-Rezeptoren kommen aber auch in anderen Geweben, wie z.B. in Herz, Niere, Gehirn und Darm sowie auf Immunzellen vor und haben darüber hinaus verschiedene indirekte metabolische Effekte (CAMPBELL u. DRUCKER 2013).
2.5.1.1 Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)
GLP-1 wird von enteroendokrinen L-Zellen gebildet (BAGGIO u. DRUCKER 2007).
Dabei gibt es zwei Formen: Das GLP-1 (7-36) Amid und das GLP-1 (7-37). Plasma- GLP-1-Level steigen innerhalb weniger Minuten nach Nahrungsaufnahme rapide an, daher wird davon ausgegangen, dass zwei Faktoren, neuronale und/oder endokrine Faktoren, die GLP-1-Freisetzung aus L-Zellen fördern, lange bevor Nährstoffe den Dünndarm erreicht haben und in direkten Kontakt mit den L-Zellen treten (DRUCKER 2006). Der genaue Mechanismus ist aber bisher noch unbekannt. GLP-1 erhöht, abhängig vom Glukosespiegel, die Insulinsynthese und reduziert die Glukagon- Ausschüttung (DRUCKER 2006). Es verleiht außerdem Glukose-resistenten β-Zellen Glukosesensibilität, stimuliert die β-Zell-Proliferation, inhibiert die β-Zell-Apoptose (CAMPBELL u. DRUCKER 2013) und fördert indirekt die Aufnahme von Nährstoffen in die Zelle.
2.5.1.2 Glucose-dependent insulinotropic Peptide (GIP)
Das Glucose-dependent-insulinotropic Peptid ist ein 42-Aminosäurenpeptid, welches hauptsächlich in K-Zellen des proximalen Duodenums gebildet wird. Der vorherrschende Stimulus der GIP-Sekretion sind Nährstoffe, insbesondere Fette im Lumen des Dünndarms. Zirkulierende GIP-Level sind im nüchternen Zustand gering und steigen nach Nahrungsaufnahme innerhalb von Minuten an (DRUCKER 2006).
26
Das GIP stimuliert die Insulinsekretion, die Insulinbiosynthese sowie die β-Zell- Proliferation und inhibiert die β-Zell-Apoptose. Darüber hinaus konnten GIP- Rezeptoren im Gehirn und auf Adipozyten nachgewiesen werden. Ebenfalls besitzt das GIP anabole Wirkungen auf den Knochen (YIP u. WOLFE 2000; NYBERG et al.
2005; BAGGIO u. DRUCKER 2007).
2.5.1.3 Glucagon-like Peptide 2 (GLP-2)
Glucagon-like Peptide-2 ist ein vom Proglukagon abgeleitetes Peptidhormon (proglucagon-derived peptide = PGDP), bestehend aus 33 Aminosäuren. Proglukagon ist ein Prohormon-Vorläufer, welcher neben GLP-2 auch Glukagon, Oxyntomodulin und GLP-1 kodiert (DRUCKER u. YUSTA 2014). GLP-2 wird in enteroendokrinen L- Zellen des Darmes aus Proglukagon gebildet und freigesetzt. Darüber hinaus kommt es im Gehirn, vorwiegend im Stammhirn, vor, von wo es in weiter distal gelegene Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) transportiert wird, um dort eine eher lokale Wirkung auszuüben (DRUCKER u. YUSTA 2014).
Sekretionsmechanismus:
Die intestinale GLP-2-Synthese wird über Nährstoffe reguliert, aber auch im nüchternen Zustand werden niedrige basale Level von GLP-2 ausgeschüttet (DRUCKER u. YUSTA 2014). Der Eintritt von Nährstoffen in den proximalen Dünndarm verursacht, vermittelt über den Vagusnerv, einen ersten Anstieg der GLP- 1 und 2 Sekretion (s. Abb. 2). Vagale efferente Bahnen stimulieren die distalen L-Zellen über einen Mechanismus innerhalb des enterischen Nervensystems, welcher Acetylcholin (Ach) und Gastrin-Releasing Peptid (GRP) beinhaltet.
27
Abbildung 2: Überblick über den GLP-2-Regelkreislauf (modifiziert nach SIGALET 2015)
Der aborale Transport der Nährstoffe innerhalb des Darmlumens führt durch die direkte Stimulation der L-Zellen zu einem zweiten, späteren Anstieg von GLP-1 und 2 (BRUBAKER u. ANINI 2003). Ein weiterer Trigger-Faktor könnten SCFA (short-chain fatty acids) aus der Fermentation malabsorbierter Kohlenhydrate und nicht verdauter Strukturkohlenhydrate sein, insbesondere aus der Fermentation entstandenes Butyrat bzw. Buttersäure (BURRIN et al. 2001; TAPPENDEN et al. 2003).
Wirkung:
Die Wirkung des GLP-2 wird hauptsächlich über einen einzigen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, den GLP-2-Rezeptor, vermittelt (MUNROE et al. 1999). GLP-2 stimuliert die Kryptenzellproliferation (s. Abb. 3) und führt damit zu einer Zunahme der Schichtdicke der Tunica mucosa im Dünn- und Dickdarm (DRUCKER et al. 1996, DRUCKER u.
YUSTA 2014). Weitere Wirkungen auf den Intestinaltrakt sind die Inhibition der Apoptose im Darmepithel, Steigerung des Blutflusses und der Nährstoffaufnahme (z.B.
die Steigerung des aktiven Transportes von Glukose in die Zelle) sowie Reduktion der Magensäureproduktion, Darmmotilität und Permeabilität (DRUCKER u. YUSTA 2014).
28
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Wirkung von GLP-2 am GLP-2 Rezeptor (modifiziert nach BURRIN et al. 2003)
2.6 Exokrine Pankreasinsuffizienz
Eine exokrine Pankreasinsuffizienz (PEI) liegt nach LINDKVIST (2013) vor, wenn die Pankreasenzymaktivität im Darmlumen unter die für eine normale Verdauung benötigte Schwelle fällt. Der Mangel an Pankreasenzymaktivität kann zum einen durch den Verlust von funktionalem Gewebe durch z.B. chronische Pankreatitis, Mukoviszidose, Tumoren des Pankreas oder Pankreasresektion entstehen, zum anderen durch eine verminderte Sekretion trotz intaktem Gewebe durch z.B. eine Obstruktion des Ausführungsganges (Tumor der Papilla duodeni), eine Abnahme der endogenen Stimulation durch Zöliakie, Morbus Crohn oder Diabetes mellitus oder durch eine intraluminale Inaktivierung bei z.B. dem Zollinger Ellison Syndrom oder der Anwendung von Tetrahydrolipstatin (Orlistat) (KELLER u. LAYER 2005). Eine pankreato-cibale Asynchronie (Pankreasenzyme können durch eine veränderte Darmanatomie erst im Jejunum Nahrungsbestandteile spalten) durch Dünndarmresektion, Short-Bowel Syndrom, Morbus Crohn oder Diabetes mellitus, können weitere Ursachen darstellen (KELLER u. LAYER 2005). Der Pankreassaft besteht aus Bikarbonat und Wasser, die beide von tubulären Zellen sezerniert werden, und aus Enzymen, mit der Fähigkeit Proteine, Kohlenhydrate und Fette zu spalten,
29
welche aus Acinus-Zellen sezerniert werden (LINDKVIST 2013). Im Körper existieren kaum extrapankreatische Lipasen. Deshalb ist die pankreatische Lipase das wichtigste lipolytische Enzym, jedoch auch gleichzeitig das Pankreasenzym mit der niedrigsten Stabilität im Darmlumen (LINDKVIST 2013). Eine verminderte Lipaseaktivität führt zu einer reduzierten Fettverdauung und damit zur Steatorrhoe, was wiederum ein Defizit an fettlöslichen Vitaminen (A, D, E und K), Gewichtsverlust und abdominale Beschwerden bedingt, da im Dickdarm keine Kompensation der Fettverdauung stattfindet (HACKERT et al. 2014).
2.7 Das pankreasgangligierte Schwein als Modelltier für die exokrine Pankreasinsuffizienz des Menschen
Das Schwein ähnelt dem Menschen in Bezug auf die Verdauungsphysiologie und Ernährung in vielen Punkten. Beide Spezies ähneln sich in der Anatomie des Verdauungstraktes, in der Physiologie und im Metabolismus (MOUGHAN et al. 1994).
Trotz bestehender Unterschiede zwischen den Spezies, die in den jeweiligen Modellen bedacht werden müssen, kann das Schwein als gutes Modelltier für Studien zur humanen Verdauung bezeichnet werden (MOUGHAN et al. 1994). So hat sich das pankreasgangligierte Schwein als Modelltier für die humane exokrine Pankreasinsuffizienz bewährt (IMONDI et al. 1972; TABELING et al. 1998; GREGORY et al. 1999; GREGORY et al. 2016). In der Studie von SCHWARZMAIER (2012) wurden abgesetzte Ferkel als ein Modell für wachsende Individuen (Kinder) genutzt.
Es konnten aus früheren Studien an adulten pankreasgangligierten Schweinen gewonnene Erkenntnisse auch an jungen Tieren bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass die praecaecale Verdaulichkeit sowie die Verdaulichkeit über den gesamten GIT von organischer Substanz, Rohfett und Rohprotein nach Auslösung einer experimentellen PEI signifikant niedriger war als bei den gleichaltrigen gesunden Kontrolltieren. Die Verdaulichkeit von Stärke war dabei nur ileal reduziert und zeigte bis zum Colon und über den gesamten GIT keinen Unterschied zu den Kontrolltieren (SCHWARZMAIER 2012). Die niedrige ileale Stärkeverdaulichkeit wird bei pankreasgangligierten Tieren durch mikrobielle Fermentation im Dickdarm kompensiert; dabei wird Stärke mikrobiell v.a. zu den kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Butyrat und Propionat abgebaut (MÖSSELER et al. 2007; ENGELHARDT et al. 2010;
SCHWARZMAIER 2012). Daneben entsteht aus Stärke evtl. auch Laktat, welches zu
30
Propionat verstoffwechselt werden kann (ENGELHARDT et al. 2010). In der Studie konnte ebenfalls gezeigt werden, dass pankreasgangligierte Schweine nicht einfach nur „kleiner“ waren im Vergleich zur Kontrollgruppe, sondern einen signifikant höheren Anteil des GIT an der Körpermasse aufwiesen und damit Fettgewebe und Muskulatur relativ weniger stark ausgeprägt waren (SCHWARZMAIER 2012). Der erhöhte Anteil des GIT an der Körpermasse war nicht nur allein auf eine vermehrte Darmfüllung der pankreasgangligierten Tiere zurückzuführen, es zeigte sich dabei auch eine Längenzunahme des Dünndarmes (SCHWARZMAIER 2012; MÖSSELER et al.
2015b). Diese Befunde konnten mittlerweile in 2 nachfolgenden Studien bestätigt werden (MÖSSELER et al. 2014; 2015b). Neben der Dünndarmelongation waren bei pankreasgangligierten Tieren auch höhere Serumwerte von GLP-2, GLP-1 und GIP nachweisbar (MÖSSELER et al. 2015b), welche (vor allem GLP-2) für die intestinale Adaptation nach Dünndarmresektion relevant sind.
Vor diesem Hintergrund sollen in dieser Arbeit folgende Fragen bearbeitet und beantwortet werden.
1. Welche Abschnitte des Dünndarmes sind von der Elongation betroffen?
2. Bestehen histologische Unterschiede in der Tunica mucosa und der Tunica muscularis des Dünndarmes? Kommt es zu einer „Streckung“ des Darmrohres?
31
3. Material und Methoden
3.1 Versuchsziel
Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welcher Darmabschnitt (Duodenum, Jejunum, Ileum) bei jungen Schweinen mit einer experimentell ausgelösten PEI mit einer Elongation reagiert. Darüber hinaus wurde auf das Vorhandensein möglicher Unterschiede im histologischen Aufbau der Darmwand der PL-Tiere im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren untersucht. Aufgrund der Probenentnahme in der vorangegangenen Studie (Entnahme von Proben im Abstand von zwei Metern) war es nicht möglich, die exakte Länge der verschiedenen Dünndarmabschnitte zu bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit (Punkt 3.3) wurde daher die offene Kernfrage, welche Abschnitte des Dünndarmes genau von der Elongation betroffen sind, anhand einer weiteren experimentellen Studie behandelt.
An den in dieser Untersuchung genutzten Tieren wurde zudem auf die Auswirkungen der PEI bei jungen Individuen auf das Körperwachstum eingegangen. Da in der vorangegangenen Studie (MÖSSELER et al. 2015b) die größten Effekte der PEI auf die Länge des Dünndarmes bei Tieren beobachtet wurden, bei denen die experimentelle Auslösung der PEI im Alter von 16 Wochen erfolgte, wurde die Operation der Tiere im zweiten Teil dieser Studie analog dazu im Alter von 16 Wochen vorgenommen.
Es wurden folgende Parameter bestimmt:
Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben von Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI aus einer vorangegangen Studie.
Lichtmikroskopische Untersuchung
o Zuordnung der einzelnen Proben zu den entsprechenden Darmabschnitten (Duodenum/Jejunum/Ileum) anhand histologischer Merkmale
o Messung der Schichtdicken des Jejunums (Tunica mucosa, Tunica muscularis) in der HE-Färbung
32
Immunhistochemische Untersuchungen
o Färbung mittels PCNA-Antikörper (Proliferationsmarker)
o Färbung mittels Chromogranin A-Antikörper (Marker für enteroendokrine Zellen)
Zweiter Teil: Eigene tierexperimentelle Untersuchungen an jungen Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI
Futteraufnahme der Tiere
Wachstum der Tiere (kontinuierliche Erfassung während der 10-wöchigen Versuchsphase)
o Körpermasse o Brustumfang
o Bauchumfang auf Höhe des Nabels o Röhrbeinumfang
o Nasen-Steiß-Länge
Makroskopische Untersuchung des Magendarmtraktes
o Organmassen und Länge des GIT und seiner einzelnen Abschnitte
Chymusparameter
o Chymusmasse (g uS)
o Trockensubstanz-Gehalt (g/kg uS) o Chymusmasse (g TS)
o pH-Wert
o Rohnährstoffe (Rohprotein, Rohfett, Stärke)
o Gehalt an Chromoxid (Marker zur Bestimmung der Verdaulichkeit)
Der Versuch ist unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-15/1910 der Bezirksregierung Hannover genehmigt.
33
3.2 Erster Teil: Untersuchungen an bereits vorliegenden Darmgewebeproben von Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI aus einer vorangegangen Studie
3.2.1 Tiere und Versuchsaufbau
Die untersuchten Gewebeproben entstammen einer vorherigen Studie (MÖSSELER et al. 2015b). Dabei wurden 19 juvenile Hausschweine in vier Gruppen eingeteilt: eine Kontrollgruppe mit vier gesunden Tieren und drei Gruppen mit pankreasgangligierten Tieren. Die Kontrollgruppe wurde im Alter von sieben Wochen einer Schein-OP unterzogen. Bei zehn Tieren wurde in der siebten Lebenswoche der Pankreasgang ligiert (im Weiteren als PL7 Gruppe bezeichnet), wovon fünf dieser Tiere ab der neunten Lebenswoche zusätzlich zum Alleinfutter eine orale Vitaminsubstitution (90,000 I.E. Vitamin A, 500 I.E. Vitamin D und 600 mg Vitamin E pro kg Futter-TS) erhielten (PL7VIT Gruppe). Bei den letzten fünf Tieren wurde erst im Alter von 16 Wochen der Pankreasgang ligiert (PL16 Gruppe). Alle Tiere erhielten ein Alleinfuttermittel. In der 26. Lebenswoche wurden alle Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen (s. Abb. 4).
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus (Modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
34 3.2.2 Probenentnahme:
Während der Sektion wurde das Darmkonvolut aus der Bauchhöhle entnommen und vom Gekröse befreit. Der Dünndarm wurde in mäanderförmigen Schlingen ausgebreitet und die Länge gemessen. Beginnend hinter dem Pylorus wurden im Abstand von jeweils zwei Metern Gewebeproben von ca. 3 cm x 3 cm Größe genommen (s. Abb. 5, die gelben Markierungen kennzeichnen die Lokalisation der Probenentnahme). Dabei wurde die letzte Gewebeprobe kurz vor der Ileo-Caecal- Klappe, unabhängig zum Abstand zur vorherigen Probe, entnommen. Die entnommenen Gewebeproben wurden in neutral gepuffertem Formalin nach Lillie fixiert.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Gewebeprobenentnahme (gelbe Kästchen); die rote Markierung kennzeichnet den Pylorus, die blaue Markierung das Caecum (modifiziert nach MÖSSELER et al. 2014)
3.2.3 Histologische Untersuchungen
3.2.3.1 Probenverarbeitung
Aus den in Formalin fixierten Gewebeproben wurde nach makroskopischer Beurteilung jeweils ein 0,5 x 1 cm großes Darmstück geschnitten und in eine Einbettungskassette gelegt. Die Einbettungskassetten wurden anschließend für zwei Stunden unter fließendem Leitungswasser gespült. Über Nacht erfolgte die Entwässerung sowie die Durchtränkung der Proben mit flüssigem Paraffin im Einbettautomat ASP 300 S (Leica
35
Biosystems GmbH, Wetzlar). Die aufsteigende Alkoholreihe diente der Entwässerung und das Xylol als Intermedium zur Überführung in flüssiges Paraffin. Soweit nicht anders angegeben, kamen die Reagenzien im Einbettautomaten bei Raumtemperatur (RT) zum Einsatz.
Protokoll der Paraffineinbettung
70% Ethanol I 2 Stunden oder länger (Präinkubation) 70% Ethanol II 1,5 Stunden
80% Ethanol 1,5 Stunden 90% Ethanol 1,5 Stunden 100% Ethanol I 1 Stunde 100% Ethanol II 1 Stunde Isopropanol 1 Stunde Xylol 1 Stunde Xylol bei 35°C 1 Stunde Xylol bei 50°C 1 Stunde Paraffin I bei 59°C 1 Stunde Paraffin II bei 59°C 1 Stunde Paraffin III bei 59°C 1 Stunde
Am nächsten Tag wurden die Gewebeproben mit Hilfe der Ausgießstation Leica E61150H (Leica Biosystems GmbH, Wetzlar) in Paraffinblöcke eingebettet. Nach Aushärtung der Blöcke wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica 1512, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) vier µm dicke Schnitte erstellt und in einem mit 37°C warmem Aqua dest. gefüllten Wasserbad (GFL Gesellschaft für Labortechnik m.b.H.
&Co, Burgwedel) gestreckt. Diese Schnitte wurden auf silanbeschichtete Objektträger (Objektträger Histobond®, Paul-Marienfeld GmbH&CoKG, Lauda-Königshofen) aufgezogen und über Nacht bei 60°C im Wärmeschrank getrocknet.
36
Vorbehandlung der Schnitte für histologische Färbungen und immunhistochemische Untersuchungen
Aus den oben genannten Gewebeproben wurden für die Färbungen (HE) sowie für die immunhistochemischen Untersuchungen (IHC) Objektträger mit jeweils einem Gewebeschnitt hergestellt. Nach Einbringen der Objektträger in ein Glasschiffchen wurden diese nach folgendem Protokoll entparaffiniert und rehydriert.
Entparaffinieren:
Xylol I 10 Minuten Xylol II 10 Minuten
Rehydratation:
Isopropanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten
80% Ethanol 2 Minuten (histologische Färbungen) 80% Ethanol + 3%iges H2O2 30 Minuten (IHC)
70% Ethanol 2 Minuten
Die nach der Färbung bzw. IHC anschließende Dehydratation erfolgte für die HE- Färbung sowie für die IHC nach identischem Schema:
Dehydratation:
70% Ethanol 2 Minuten 80% Ethanol 2 Minuten 100% Ethanol 2 Minuten Isopropanol 2 Minuten Xylol I 5 Minuten Xylol II 5 Minuten
Danach erfolgte das Eindecken der Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
37 3.2.3.2 Histologische Färbungen
Für die Überprüfung der Qualität und Intaktheit der Schnitte sowie zur Beurteilung der Gewebemorphologie wurde die HE-Färbung genutzt. Die Zusammensetzung der Lösungen für die HE-Färbung ist im Anhang aufgelistet (s. Abschnitt Nr. 13.1.2).
Hämatoxylin-Eosin Färbung
Für die HE-Färbung wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Entparaffinierung und Rehydratation s. Abschnitt 3.2.3.1.
Färbung:
Aqua dest. 2 Minuten Hämalaun nach Delafield 8 Minuten 0,1% HCl (in Aqua dest.) 3-4 x spülen fließendes Leitungswasser 15 Minuten 0,1% Eosin in Aqua dest. + 3-4 Tropfen Eisessig 5 Minuten Aqua dest. 2 Minuten
Nach anschließender Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) wurden die Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg) eingedeckt.
3.2.3.3 Immunhistochemische Färbungen
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
Für die immunhistochemische Darstellung des Polypeptides PCNA wurden Gewebeschnitte von formalinfixierten Gewebeproben verwendet. Nach Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase mit Hilfe von 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über die Dauer von je fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Danach erfolgte eine 20-minütige Inkubation der Gewebeschnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A- 6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer, um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Human Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Klon PC10, Maus IgG2a, monoklonal, BioGenex, Fremont California, USA) in einer
38
Verdünnung von 1:6000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Spülen in PBS der Sekundärantikörper (Envision Mouse, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung zugegeben und für 30 Minuten belassen (feuchte Kammer bei Raumtemperatur). Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle bis zu einem adäquaten Farbumschlag behandelt und direkt danach in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Danach erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (s. Abschnitt 3.2.3.1) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus der Maus stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
Chromogranin A
Die Darstellung des Proteins Chromogranin A mit spezifischen Antikörpern erfolgte an Gewebeschnitten von formalinfixierten Gewebeproben. Nach der Entparaffinierung, Überführung in das wässrige Milieu sowie Blockierung der endogenen Peroxidase durch eine Behandlung mit 3%igem Hydrogenperoxid (H2O2) wurden die Schnitte dreimalig über jeweils fünf Minuten in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus Tween (TBS-T) gewaschen. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte bei 96-99°C in einem Citratpuffer (eigene Rezeptur des Anatomischen Institutes der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; beschrieben u.a. FRANZ 2013) 20 Minuten gekocht. Nach Abkühlung auf 60°C und einmaligem Spülen in TBS-T erfolgte eine 20- minütige Inkubation der Schnitte mit 3%igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma A- 6793) in gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT in einer feuchten Kammer um unspezifische Antikörperbindungen zu unterbinden. Daran schloss sich die Inkubation mit dem Primärantikörper (Anti-Chromogranin A; synthetisches Peptid, entspricht humanem Chromogranin A aa 1-100, N-terminal; Kaninchen IgG, polyklonal, Abcam
39
plc, Cambridge, UK) in einer Verdünnung von 1:16000 über Nacht im Kühlschrank (4°C) an. Am nächsten Tag wurde, nach dreimaligem Spülen in PBS, der Sekundärantikörper (Envision Rabbit, DAKO North America, Kalifornien, USA) in einer nach Herstellerangaben hergestellten Verdünnung aufgetragen und für 30 Minuten inkubiert (feuchte Kammer bei RT). Anschließend wurden die Schnitte mit dem chromogenen System DAB (DAKO North America, Kalifornien, USA) unter mikroskopischer Kontrolle entwickelt und direkt im Anschluss erst in PBS gewaschen und nachfolgend über eine Dauer von zehn Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült. Abschließend erfolgten das Gegenfärben mit Hämalaun, die Dehydratation (siehe oben) und das Eindecken mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg).
Die Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers mit 1%igem BSA in PBS inkubiert. Um die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen, wurde der Antikörper durch ein aus dem Kaninchen stammendes IgG als Isotypenkontrolle ersetzt. Die Spezifität des Antikörpers konnte durch ein Ausbleiben der Farbreaktion in der Isotypenkontrolle bestätigt werden.
3.2.3.4 Lichtmikroskopische Untersuchung
Zunächst wurden von den Gewebeproben jeder Entnahmelokalisation HE-gefärbte Paraffinschnitte erstellt und diese anhand histologischer Merkmale den jeweiligen Darmabschnitten (Duodenum, Jejunum, Ileum) zugeordnet. Gleichzeitig wurde dabei auf die Intaktheit des Gewebes und auf den Anschnitt im richtigen Winkel (möglichst 90°) geachtet. Konnte ein Schnitt diese Anforderungen nicht erfüllen, wurde bei der weiteren Auswertung (Bestimmung der Schichtdicken) auf einen Schnitt aus einer angrenzenden Gewebeprobe zurückgegeriffen. Die Schichtdicken der Tunica mucosa und Tunica muscularis des Jejunums wurden in den HE-gefärbten Schnitten bestimmt.
Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen wurde von insgesamt drei Personen unabhängig voneinander vorgenommen. Dabei lagen die Proben verblindet vor. Die Auswertungen der HE-gefärbten Schnitte sowie die Schnitte der immunhistochemischen Färbungen wurden mit Hilfe des Axioskops (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena) und der Mikroskopkamera DP-70 inklusive Software DP-Soft (Olympus Europa GmbH, Hamburg) durchgeführt.
40 Beurteilung der Gewebearchitektur
Um eine Übersicht über das gesamte Jejunum zu bekommen, wurden für jedes Tier Gewebeschnitte von jeweils 3 Gewebeproben aus dem vorderen (0-25% der Länge), mittleren (40-60% der Länge) und hinteren Abschnitt (75-100% der Länge) des Jejunums ausgewertet. Pro Gewebeschnitt wurden mindestens zehn möglichst in einem 90° Winkel angeschnittene Zotten vermessen. Es wurde die Zottenlänge, die Kryptentiefe, die Höhe der gesamten Tunica mucosa (Zotten + Krypten) sowie die Dicke des Stratum circulare, des Stratum longitudinale und die Gesamtdicke der Tunica muscularis in Anlehnung an (DRUCKER et al. (1996); MARTIN et al. (2005);
SIGALET et al. (2014)) ermittelt. Die Messungen wurden in der 25-fachen Vergrößerung durchgeführt.
Bestimmung der PCNA-positiver Zellkerne
Die Auswertung der PCNA-Färbung gliederte sich in 2 Teile und wurden in Anlehnung an SIGALET et al. (2014) durchgeführt:
1. Bestimmung des Anteils PCNA-positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa
Es wurde für jedes Tier jeweils ein Gewebeschnitt aus einer Gewebeschnittserie aus dem vorderen (0-25% der Länge), mittleren (40-60% der Länge) und hinteren Bereich (75-100% der Länge) des Jejunums ausgewertet, sodass sich eine Anzahl von 3 Gewebeschnitten pro Tier ergab. Pro Schnitt wurden 10 longitudinal angeschnittene Krypten ausgewertet und die Anzahl an positiven Zellkernen im Verhältnis zur Gesamtzahl an Zellkernen in den Krypten bestimmt. Die Auswertung wurde in der 200- fachen Vergrößerung vorgenommen.
2. Bestimmung der PCNA positiven Zellkerne in der Tunica muscularis
Für die Bestimmung PCNA-positiver Zellkerne in der Tunica muscularis wurde jeweils ein Gewebeschnitt aus der gleichen Schnittserie wie für die Bestimmung des Anteils PCNA-positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa genutzt. Dadurch ergaben sich identische Lokalisationen und Anzahl von Schnitten je Tier. Pro
41
Gewebeschnitt wurden zehn Gesichtsfelder ausgewertet und die Anzahl an positiven Zellkernen im Stratum circulare und Stratum longitudinale je Gesichtsfeld bestimmt.
Die Auswertung wurde in der 200-fachen Vergrößerung vorgenommen.
Bestimmung der Anzahl Chromogranin A-positiv gefärbter Zellen je Gesichtsfeld in der Tunica mucosa
Die Anzahl Chromogranin A-positiv gefärbter Zellen je Gesichtsfeld in der Tunica mucosa wurde für jedes Tier jeweils an einem Gewebeschnitt aus der gleichen Serie der Gewebeschnitte durchgeführt, die auch für die Bestimmung des Anteils PCNA- positiven Zellkerne in den Krypten der Tunica mucosa zum Einsatz kam. Dadurch ergaben sich eine identische Lokalisation und Anzahl von Schnitten je Tier. Pro Schnitt wurden ebenfalls zehn Gesichtsfelder durchgemustert und die Anzahl an positiven Zellkernen in der Tunica mucosa je Gesichtsfeld bestimmt. Die Auswertung wurde in der 200-fachen Vergrößerung vorgenommen.
3.3 Zweiter Teil: Untersuchungen an Schweinen mit einer experimentell induzierten PEI (eigener Fütterungsversuch)
3.3.1 Zielsetzung und Versuchsaufbau
Ziel der Durchführung war, die makroskopische Bestimmung der verschiedenen Darmabschnitte anhand anatomischer Strukturen (z.B. Plica duodenocolica, Plica ileocaecalis) zur Klärung der Frage, welche Darmabschnitte bei Vorliegen einer PEI verlängert ist. Die Untersuchungen erfolgten vergleichend an gesunden Kontrolltieren und an pankreasgangligierten Tieren. Im Versuchsverlauf wurden sowohl Köpermasse als auch Körpermaße kontinuierlich ermittelt. In der 26. Lebenswoche wurden die Tiere euthanasiert und einer Sektion unterzogen. Dabei wurden neben der Länge der einzelnen Darmabschnitte auch die Organgewichte und deren Inhalt bestimmt sowie Gewebeproben aus Duodenum, Jejunum, Ileum und Caecum entnommen.
