Zellvolumetrische Messung (Zellvolumetrie)

Zur Bestimmung der Volumina wurde das Cell Counter and Analyse System (CASY 1, Schärfe System GmbH) eingesetzt (Abb. 3). Dieser Methode liegt das Prinzip der Widerstandsmessung im hochfrequenten elektrischen Feld zugrunde. Die angeschlossene Signalauswertung erfolgt mit Hilfe einer Pulsflächenanalyse.

Das Gerät verfügt über eine Präzisionsmesspore, bei der es sich um eine Bohrung in einem Rubin handelt, der in einen Kapillarkörper eingegossen ist. Diese Messkapillare weist bei definiertem Querschnitt und definierter Länge eine zylindrische Form auf. An dem Messwandler liegen außen und innen zwei Platinelektroden an, zwischen denen durch das Anlegen einer Spannung an der Kapillarstrecke während der Messung ein konstanter Strom fließt. Die elektrolytgefüllte Kapillare stellt einen definierten elektrischen Widerstand dar. Bei der Messung werden 200 µl der leitfähigen Probenflüssigkeit durch die Präzisions-kapillare aufgrund eines von dem Gerät erzeugten Unterdruckes bis zum Erreichen einer Lichtschranke angezogen. Die Flüssigkeit tritt durch die Kapillaröffnung des Messwandlers in den Stromkreis ein. Da die Zellen eine ihrem Volumen entsprechende Menge Elektrolytlösung verdrängen, unterscheidet sich der Widerstand der Partikel von dem der umgebenden Lösung. Somit kommt es beim Durchtritt jeden Spermiums zu einer Vergrößerung des Widerstandes entlang der Kapillarstrecke, da intakte Zellen in erster Linie als Isolatoren betrachtet werden

C. Eigene Untersuchungen

können. Der Anstieg des Widerstandes entspricht daher einem Maß des Volumens der Zellen. Die daraus resultierende Spannungsänderung kann dann gemessen werden.

Mit Hilfe der Grundlagen der Physik lässt sich das Messprinzip folgendermaßen herleiten: Nach dem Ohmschen Gesetz (U = R x I) ergibt sich die elektrische Spannung (U) aus dem Produkt von Widerstand (R) und Stromstärke (I). Da bei diesem Meßsystem eine konstante Stromstärke vorliegt, kann die Spannung als Funktion des Widerstandes aufgefasst werden. Die Gleichung I lautet dann U = f (R).

Zusätzlich gilt, dass die Widerstandsänderung dem Volumen der Elektrolytlösung, das die Zelle verdrängt, proportional ist. In einer Gleichung II ausgedrückt bedeutet das R = f (V). Setzt man dann die Gleichung I in die Gleichung II ein, ergibt sich die Formel U = f (V). Diese Formel sagt aus, dass die gemessene Spannung U eine Funktion des Volumens V der Zelle ist.

In jeder einzelnen Messung werden mehrere tausend Zellen gleichzeitig erfasst.

Jeder Messkanal addiert die Anzahl der Partikel, die beim Durchtritt durch die Messpore eine bestimmte Widerstandsänderung zur Folge hat. Aus den Originalvolumen der Einzelmessungen der 1024 Messkanäle ergibt sich die Durchschnittsverteilung der Volumen. Dieses hochempfindliche Analysesystem der Pulsflächenanalyse ermöglicht außerdem, dass nicht nur die Amplitude sondern der gesamte Messverlauf erfasst wird. Das Gerät berechnet aus den Einzelmessungen mit Hilfe der Pulsflächenanalyse ein Integral des Messsignals.

Die ermittelten Volumina werden im Anschluss an die Messung automatisch auf dem Bildschirm des CASY1 in einem Histogramm dargestellt. Die Verteilung der Durchmesser wird im CASY-Datei-Format (CASYstat-software, Schärfe System GmbH) ausgegeben. Abbildung 3 zeigt eine solche Verteilung zur Verdeutlichung.

Abb. 3: CASY-Datei-Format: Beispiel für die beim Einsatz des Cell Systems gemessenen Volumenverteilungen von Eberspermien (unter

isoosmotischen Bedingungen)

Auf der x-Achse stehen die Größen gemessen in µm, auf der y-Achse sind die Partikelanzahlen aufgetragen. Der Messbereich ist variabel, durch das Setzen der Cursor erfolgt eine Auswertung der Messergebnisse durch das Gerät. Als untere Grenze wurde 2,24 µm gewählt, um auszuschließen, dass Schmutzpartikel und Zellfragmente in die Messung mit eingehen, als obere Grenze wurden unter Berücksichtigung des mittleren Spermiendurchmessers 6,00 µm eingestellt.

Abhängig von der Dichte wurden bei jeder Messung 18.000 bis 30.000 Spermien erfasst.

2.2.1.2. Volumetrische Messung der Eberspermatozoen

Es erfolgten volumetrische Messungen der Eberspermien bei verschiedenen Osmolaritäten (isoosmotisch, hypoosmotisch, hyperosmotisch) in HBS (s. J. Anhang) nach fünf und zwanzig Minuten. Beim Wechsel der Osmolarität des Messmediums wurde das System vorher zweimal mit der entsprechenden Messlösung gespült.

Dann wurde eine Leermessung mit der entsprechenden Osmolarität der eigentlichen

C. Eigene Untersuchungen

flüssigkeiten wurden mit Hilfe einer Einwegspritze durch einen Filtrationsvorsatz (Millex^TM GP Filter Unit, 0,22 µm von Millipore Express® PES membrane) gegeben, um einen möglichst geringen Messhintergrund zu erzielen, der die Messung nicht durch Überlagerungen von Schmutzpartikeln beeinträchtigt.

2.2.1.3. Modifizierter hypoosmotischer Schwelltest (HOST)

Bei den volumetrischen Untersuchungen der Spermien mit Hilfe des CASY1 wurde der modifizierte HOST angewendet. Die mit Percoll gewaschenen Spermatozoen wurden auf eine Dichte von 5x10⁶ Spermien/ml in isoosmotischem HBS eingestellt und für 10 Minuten bei 38°C im Wärmeschrank vorinkubiert. Dann wurden 80 µl der Spermiensuspension in Messgläser mit vier Milliliter isoosmotischem (300 ± 5 mosm/kg), hypoosmotischem (180 ± 5 mosm/kg) oder hyperosmotischem (450 ± 5 mosm/kg) HBS überführt. Nach einer Inkubation von fünf Minuten bei 38°C im Wärmeschrank erfolgte die Messung von 200 µl der Probe im einfachen Messzyklus.

2.2.1.4. Regulatory Volume Decrease (RVD) und Regulatory Volume Increase (RVI) Für die Erfassung der regulativen Volumenverminderung (RVD) unter hypoosmotischer Belastung und des regulativen Volumenanstieges (RVI) im hyperosmotischen Medium wurde genauso vorgegangen wie bei dem HOST, inkubierte aber zusätzlich Proben 20 Minuten in HBS drei verschiedener Osmolaritäten (300, 180, 450 mosm/kg) bei 38°C. Dann erfolgte die Messung mit dem CASY1.

2.2.1.5. Statistische Auswertung der volumetrischen Messungen

Für die statistische Bearbeitung der Messergebnisse der volumetrischen Untersuchung wurden die unter hypoosmotischen und hyperosmotischen Belastungen gemessenen mittleren Spermienvolumen und Modalwerte der

Spermienvolumenverteilung mit Hilfe von in Latexeichungen ermittelten Korrektur-faktoren, mit denen die gemessenen Werte multipliziert wurden, korrigiert. Die Korrekturfaktoren wurden nach den folgenden Formeln berechnet, wobei für die Variable y die genaue Osmolarität des isoosmotischen Mediums eingesetzt wird, für z die des hypoosmotischen und für w die des hyperosmotischen Mediums.

Korrektur des mittleren Spermienvolumens ( Mean Volume in fl ):

Korrekturfaktor für Vhypo (korr) = (0,0103 x y + 22,705)/(0,0103 x z + 22,705) Korrekturfaktor für Vhyper (korr) = (0,0103 x y + 22,705)/(0,0103 x w + 22,705) Korrektur des Modalvolumens ( Volume in fl ):

Korrekturfaktor für Vhypo (korr) = (0,0113 x y + 14,546)/(0,0113 x z + 14,546) Korrekturfaktor für Vhyper (korr) = (0,0113 x y + 14,546)/(0,0113 x w + 14,546)

Die folgenden Parameter wurden bei der statistischen Auswertung berücksichtigt:

• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in isoosmotischer Lsg.

= V mean iso

• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in hypoosmotischer Lsg.

= V mean hypo (korr)

• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in hyperosmotischer Lsg.

= V mean hyper (korr)

• Quotient aus V mean hypo (korr) und V mean iso

• Quotient aus V mean hyper (korr) und V mean iso

• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in isoosmotischer Lsg. = V iso

• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in hypoosmotischer Lsg. = V hypo (korr)

• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in hyperosmotischer Lsg. = V hyper (korr)

• Quotient aus V hypo (korr ) und V iso

• Quotient aus V und V

C. Eigene Untersuchungen

Die Quotienten wurden gebildet, um von den absoluten Messwerten abgeleitete Größen zu erhalten, die die Reaktion der Spermien verschiedener Eber vergleichbar machten.