Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung mit dem

zu untersuchen, wurde parallel zu den Volumenmessungen die Tyrosinphos-phorylierung mit Hilfe des Durchflusszytometers dargestellt und analysiert.

Zum Nachweis der Tyrosinphosphorylierung an Spermien im Durchflusszytometer wurde ein direkt Fluoreszenz markierter Antiphosphotyrosin-Antikörper, P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate (Oncogene Research Products, Boston), eingesetzt, bei dem es sich um einen murinen, monoklonalen Antikörper handelte.

Die mit Percoll gewaschenen Spermatozoen wurden in isoosmotischem HBS auf eine Dichte von 1,5 x 10⁷ Spermien/ml bzw. 2,5 x 10⁷ Spermien/ml in HBS eingestellt

C. Eigene Untersuchungen

wurden 10 µl Spermiensuspension der Konzentration 2,5 x 10⁷ Spermien/mlin 0,1 ml hypoosmotisches HBS überführt, je 20 µl der Spermiensuspension mit der Dichte 1,5 x 10⁷ Spermien/ml in 0,2 ml isoosmotisches bzw. hyperosmotisches HBS pipettiert. Die Spermien wurden 5 bzw. 20 Minuten in HBS bei 38°C im Wärmeschrank inkubiert, dann wurde die Reaktion durch Hinzufügen der Inhibitor-Lösung I (0,35 ml zu der hypoosmotischen und 0,25 ml zu der isoosmotischen Probe) bzw. Inhibitor-Lösung II (0,25 ml zu der hyperosmotischen Probe) beendet, Rezepte s. J. Anhang. Durch diesen Versuchsaufbau sollte eine Veränderung der osmotischen Verhältnisse verhindert werden. Anschließend wurde der Inkubationsansatz mit BSA (Bovines Serumalbumin, Merck, Darmstadt) in einer Konzentration von 5 mg/ml versetzt, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, sowie fünf Mikroliter einer Propidiumjodid-Stammlösung (0,5 mg/ml) zugegeben.

Fünf Minuten später wurde der Antikörper P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate hinzugefügt.

Nach einer Einwirkzeit bei Raumtemperatur erfolgte die Messung im Durchflusszytometer. Es wurden zunächst verschiedene Antikörperkonzentrationen (0,5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml) und unterschiedliche Einwirkungs-zeiten (1 min, 3 min, 5 min, 7 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min) des Antikörpers bei Raumtemperatur getestet. Die weiteren Versuche wurden dann mit einer Antikörperkonzentration von 2,0 µg/ml und fünfminütiger Einwirkzeit des Antikörpers durchgeführt.

Die Spezifität des bei der durchflusszytometrischen Methode eingesetzten Antikörpers, P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate, wurde in drei Versuchen überprüft. Zum Nachweis der Spezifität des Antikörpers wurden die Proben 10 Minuten bei 38°C in isoosmotischem HBS inkubiert und dann die Reaktion durch Hinzufügen der Inhibitor-Lösung I gestoppt. Fünf Minuten nach der Zugabe von BSA in der Konzentration von 5 mg/ ml und PI (Endkonzentration 5 mg/ml) wurden die Proben im ersten Ansatz mit präimmunem Serum der Maus (Maus-IgG, Serum;

Calbiochem®) einer Konzentration von 15 µg/ml für 10 Minuten bei Raumtemperatur anstelle des Antikörpers inkubiert. Anschließend wurde ein zweiter Antikörper, FITC-konjugierter Anti-Maus-IgG (FITC-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Jackson Immuno Research Laboratories, Baltimore) in der Verdünnung 1 : 1000

hinzupipettiert. Nach einer erneuten Einwirkzeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur erfolgte die Messung im Durchflusszytometer. Zusätzlich wurden unterschiedliche Konzentrationen (2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml) des präimmunen Mausserums bei fixierter Konzentration (1 : 1000) des zweiten FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG getestet.

In einem zweiten Ansatz wurde wie oben beschrieben vorgegangen, doch der Antikörper P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate wurde eine Stunde mit Ortho-Phosphotyrosin (55 mM) bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach 10minütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Proben im Durchflusszytometer gemessen.

Für die Messung dieser Proben wurden im Durchflusszytometer sechs Diagramme benötigt, da parallel zu der PI-Färbung mit FITC konjugiertem Antikörper gearbeitet wurde (s. Abb. 7).

Abb. 7: Graphik des Durchflusszytometers: Diagrammanordnung und Darstellung der Parameter, die für die Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung im Durchflusszytometer gewählt wurden (Graphiken einer nativen probe zum Einstellen des Gerätes)

Die ersten vier Darstellungen stimmen mit denen, die bereits im Abschnitt 2.2.2.2.

(Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen) beschrieben worden sind,

C. Eigene Untersuchungen

überein, zusätzlich wurden zwei Diagramme ergänzt. Oben rechts erschien ein zusätzliches Histogramm: x-Achse FL-1, y-Achse counts. Diese Graphik gab Auskunft über die Anzahl der Zellen einer bestimmten Fluoreszenzintensität. Unten rechts wurde ein weiterer Dot Plot gewählt: x-Achse FL-1, y-Achse FL-3. Es wurden somit Spermien dargestellt, die eine bestimmte Rot- und zugleich Grünfluoreszenz aufwiesen.

Bei der Eingabe der Grundeinstellung wurde für FSC und SSC eine lineare Skala (lin) gewählt, für FL-1, FL-2 und FL-3 wurde eine logarithmische Skala (log4) eingestellt.

Die Einstellung der Grundeinstellung erfolgte wie in Abschnitt 2.2.2.2. beschrieben, zusätzlich war darauf zu achten, dass im Histogramm FL-1/ counts die Fluoreszenz der unbeladenen Probe nicht über die Markierung eins der x-Achse hinausging (s. Abb. 7 und 8).

Abb. 8: Graphik des Durchflusszytometers für die Untersuchung der phosphorylierung: Beispiel für die Grundeinstellung der Parameter bei der Messung einer mit PI beladenen Probe

Bei der Auswertung der Graphiken mit Hilfe der Messfenster („Gates“) wurde zunächst ein Gate RN1 im Histogramm mit der Achsenbezeichnung FL-1/ counts gesetzt. Die erste Markierung wurde fast an den Nullpunkt gesetzt, die zweite Markierung befand sich auf der rechten Seite der Kurve, wobei darauf zu achten war,

die zweite dicht an die absteigende Kurve zu setzen. Das zweite Gate RN2 schloss in demselben Histogramm die gesamte glockenförmige Kurve ein. Diese zwei Gates beschreiben die Tyrosinphosphorylierung. Außerdem wurde der Cursor auf den Kurvengipfel gelegt. Der Wert der x-Achse konnte dann in der grauen Leiste unten links auf dem Bildschirm abgelesen werden. Der abzulesende Zahlenwert gab Auskunft über die Intensität der gemessenen Fluoreszenz. Danach wurden in dem Dot Plot unten rechts mit der Achsenbeschriftung FL-1/ FL-3 so Quadranten gesetzt, dass die senkrechte Linie dicht rechts an den linken Populationen lag. Diese Senkrechte lag ungefähr auf der gleichen Höhe wie die rechte Markierung des Gates RN1, daher wurden diese zwei Diagramme zur Kontrolle stets untereinander gestellt.

Abschließend grenzte ein neues Gate RN3 in der Graphik mit der Achsenbeschriftung FL-3/ counts (oben, Mitte) den zweiten Gipfel der Kurve ab, der dem Anteil der PI-positiven und somit toten Spermien entsprach. Diese Auswertung wurde zuerst an den Histogrammen der Probe vorgenommen, die fünf Minuten im isotonen Medium inkubiert wurde (s. Abb. 9).

Abb. 9: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Setzen der Messfenster in den Diagrammen, die bei der Messung einer Kontrollprobe, die fünf Minuten im isoosmotischen HBS-Medium inkubiert worden war, erstellt wurden.

C. Eigene Untersuchungen

Dann wurde diese Einstellung gespeichert und für die Auswertung der anderen Proben auf diese übertragen, indem sie neu geladen wurde (s. Abb. 10).

Abb. 10: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Laden gespeicherter Messfenster. Auf diese Weise wurden die Gates auf die Messkurven, die bei der Analyse einer mit einem Inhibitor behandelten Probe (Calyculin 10 nM, 180 mosm/kg, Inkubation 20 Minuten) erstellt worden waren, tragen, um dann eine evtl. Verschiebung der Populationen darstellen zu können. RN2 und RN3 wurden immer neu gesetzt.

Auf diese Weise konnte beobachtet werden, ob sich die Kurve in dem Gate RN1 verschob, wie sich also die Tyrosinphosphorylierung eventuell veränderte. Außerdem konnten Verschiebungen der vier Populationen in den vier Quadranten sichtbar gemacht werden.

RN2 und RN3 wurden dagegen bei der Auswertung jeder Probe neu gesetzt.