Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei osmotisch induzierter Volumenregulation von Spermatozoen am Ebermodell

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Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei osmotisch induzierter Volumenregulation von

Spermatozoen am Ebermodell

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Eyke Christina Jebe

aus Lübeck

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. rer. nat. Bernd Schröder

Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2003

Gefördert durch die Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Das ist der Weg zu den

Sternen.

^{Aus Irland}

In Liebe und aus ganzem Herzen für meine Eltern

Renate und Hans-Jürgen Jebe Ich danke Euch für alles.

Inhaltsverzeichnis

A. Einleitung...19

B. Literaturübersicht...21

1. Das Ejakulat...21

1.1. Das Seminalplasma...21

2. Die Morphologie des Spermatozoon...23

2.1. Grundbaustein Zelle...23

2.2. Das Spermatozoon - eine besondere Zelle...24

3. Physiologie der Samenzelle...29

3.1. Die Plasmamembran...29

3.1.1. Aufbau...29

3.1.2. Funktionen...31

3.2. Regulation von Wassergehalt und osmotischem Druck...33

3.2.1. Physiologische Grundlagen...33

3.2.2. Der hypoosmotische Schwelltest (HOST)...37

3.3. Kapazitation...38

3.4. Signalübertragung...40

3.4.1. Allgemeine Mechanismen der Signalübertragung in Zellen...40

3.4.2. Tyrosinphosphorylierung bei der Signalübertragung von Zellen...43

3.4.3. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Zellen...44

3.4.4. Signalübertragung bei Spermatozoen...47

Inhaltsverzeichnis

C. Eigene Untersuchungen...54

1. Versuchskonzeption...54

2. Material und Methoden...54

2.1. Gewinnung und Aufbereitung der Spermien...54

2.1.1. Probanden...54

2.1.2. Gewinnung der Ejakulate...54

2.1.3. Untersuchung der Ejakulatqualität...55

2.1.4. Verdünnen und Lagern des Samens...56

2.1.5. Aufbereitung der Spermien...56

2.2. Methodik und Messprinzip der Volumenmessung und Durchfluss- zytometrie...57

2.2.1. Zellvolumetrische Messung (Zellvolumetrie)...57

2.2.1.1. Messprinzip...57

2.2.1.2. Volumetrische Messung der Eberspermatozoen...59

2.2.1.3. Modifizierter hypoosmotischer Schwelltest (HOS)...60

2.2.1.4. Regulatory Volume Decrease (RVD) und Regulatory Volume Increase (RVI)………...60

2.2.1.5. Statistische Auswertung der volumetrischen Messung....60

2.2.2. Durchflusszytometrische Untersuchungen...…...62

2.2.2.1. Messprinzip...62

2.2.2.2. Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen...64

2.2.2.3. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung mit dem Durchflusszytometer...67

2.3. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylie- rung...73

2.4. Elektrophoretische Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung...74

2.4.1. Herstellung der Spermienextrakte...74

2.4.2. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Spermienextrakte...75

2.4.3. Transferieren der aufgetrennten Proteine...76

2.4.4. Durchführung der Immunreaktion...77

3. Einfluss verschiedener Inhibitoren unter unterschiedlichen osmotischen Bedingungen...79

3.1. Untersuchung des Einflusses der Lagerung auf die Volumenregulation und Membranintegrität...81 3.2. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Volumen- regulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen...81 3.3. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosin- phosphorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen im Durchflusszytometer...82 3.4. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosin- phosphorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen bei der elektrophoretischen Auftrennung…...82 4. Statistische Auswertung...83

D. Ergebnisse...84

1. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation unter

unterschiedlichen osmotischen Bedingungen...84 1.1.Einfluss der Lagerung auf die Volumenregulation und Membran-

integrität...………...84 1.2.Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation

unter verschiedenen osmotischen Bedingungen.…...85 1.2.1. Isoosmotische Bedingungen...85 1.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...85 1.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und

des Phosphodiesterase-Inhibitors...87 1.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels

und verschiedener Ionenkanäle...89 1.2.2. Hypoosmotische Bedingungen...93

Inhaltsverzeichnis

1.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...93 1.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und

des Phosphodiesterase-Inhibitors... 96 1.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und

verschiedener Ionenkanäle...98 1.2.3. Hyperosmotische Bedingungen...101

1.2.3.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...102 1.2.3.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und

des Phosphodiesterase-Inhibitors...104 1.2.3.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und

verschiedener Ionenkanäle...106 1.2.4. Einfluss der Inhibitoren auf die Membranintegrität...110 1.2.5. Ermittlung der optimalen Wirkstoffkonzentrationen der

Inhibitoren...110 2. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen

osmotischen Bedingungen...111 2.1. Überprüfung der Spezifität des bei der durchflusszytometrischen

Methode eingesetzten Antikörpers...111 2.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung im Durchflusszytometer...114

2.2.1. Isoosmotische Bedingungen...114 2.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...114 2.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und

des Phosphodiesterase-Inhibitors...115 2.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und

verschiedener Ionenkanäle...116 2.2.2. Hypoosmotische Bedingungen...118

2.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...118 2.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und

des Phosphodiesterase-Inhibitors...119

2.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und

verschiedener Ionenkanäle...122

2.2.3. Hyperosmotische Bedingungen...122

2.2.3.1. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle...123

3. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphos- phorylierung...124

4. Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen bei der elektrophoretischen Auftrennung...125

4.1. Überprüfung der Spezifität des für die Immunreaktion verwendeten Antikörpers...125

4.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung bei der elektrophoretischen Auftrennung...127

4.2.1. Isoosmotische Bedingungen...128

4.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren...128

4.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-Inhibitors...128

4.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle...128

4.2.2. Hypoosmotische Bedingungen...130

4.2.3. Hyperosmotische Bedingungen...130

E. Diskussion...132

1. Erfassung der in der Volumenregulation etablierten Mechanismen...132

1.1. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Spermien...132

1.2. Phosphorylierungen bei der Signaltransduktion...133

1.3. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter iso- osmotischen Bedingungen...134

1.4. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hypo- osmotischen Bedingungen...136

Inhaltsverzeichnis

1.5. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hyper-

osmotischen Bedingungen...138

2. Entwicklung eines Modells der Signalübertragungsmechanismen bei der Osmoregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen unter Einbeziehung der Phosphorylierung...139

3. Anwendbarkeit der durchflusszytometrischen Untersuchung für Tyrosinphosphorylierung...143

4. Zusammenfassende Abschlussbetrachtung...146

F. Zusammenfassung...147

G. Summary...150

H. Literaturverzeichnis...153

J. Anhang...177

1. Rezepturverzeichnis...177

2. Messungen des pH-Wertes und der Osmolarität...187

3. Inhibitoren...188

K. Danksagung...194

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung A. dest. Aqua destillata A. bidest. Aqua bidestillata alk. alkalische

AP Alkalische Phosphatase APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt BMW Broad Molecular Weight

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin) BTS Beltsville Thawing Solution

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

Ca ²⁺ Kalziumionen

cAMP cyclic adenosine monophosphate (zyklisches Adenosin- monophosphat)

CASY Cell Counter and Analyzer System

cGMP cyclic guanosine monophosphate (zyklisches Guanosin- monophosphat)

Cl^- Chloridionen

cm Zentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid conj. conjugated (konjugiert)

d Tag

DAG Diacycglycerol

DMF N,N,-Dimethylformamid

DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

1D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 1D-PAGE

Abkürzungsverzeichnis

1D-PAGE eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese EDTA Ethylen-N,N,N,N-tetraessigsäure

ER Endoplasmatisches Retikulum et al. et alii (und andere)

EZ Extrazellulärraum

Fa. Firma

fl Femtoliter

FL-1 Grünfluoreszenz FL-2 Orangefluoreszenz FL-3 Rotfluoreszenz

g Gramm, Erdbeschleunigung FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht) GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung h hour (Stunde)

HBS Hepes Buffered Saline (Hepesgepufferte Kochsalzlösung) HCl Salzsäure

HCO3- Hydrogencarbonat

Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N´-2-ethan

HOST Hypoosmotischer Schwelltest

I Stromstärke

Ig Immunglobulin

I hypo, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im hypoosmotischen Medium

I hypo, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation im hypoosmotischen Medium

I hyper, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im hyperosmotischen Medium

I hyper, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation im hyperosmotischen Medium

I iso, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im isoosmotischen Medium

I iso, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation

im isoosmotischen Medium

Inkub. Inkubation

IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat IVF In-vitro-Fertilisation IZ Intrazellulärraum K⁺ Kaliumionen KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton

kg Kilogramm

KH2PO4 Kaliumhydrogenphosphat KOH Kaliumhydroxid

konz. konzentriert Konz. Konzentration Lsg. Lösung

M Molar

mA Milliampere

mA/cm² Milliampere pro Quadratzentimeter

mg Milligramm

Mg²⁺ Magnesiumionen

min Minute

Mio/mm³ Millionen pro Kubikmillimeter

ml Milliliter

mmol Millimol

mM Millimolar

mosm/kg Konzentration gelöster, osmotisch wirksamer Teilchen pro ein Kilogramm Lösungsmittel

MW arithmetischer Mittelwert

µg Mikrogramm

Abkürzungsverzeichnis

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µM Mikromolar

n Anzahl der Werte

Na⁺ Natriumionen

NaCl Natriumchlorid

NaF Natriumfluorid

NaHCO3 Natriumhydrogenkarbonat

Na2HPO4 Di-Natriumhydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxid, Natronlauge NBT Nitroblautetrazoliumchlorid, Nitro-BT

neg. negativ

nM Nanomolar

p Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit

pAB p-Aminobenzamidine

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS Phosphat-Buffered-Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PDE Phosphodiesterase

pH negativer dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration

PI Propidiumjodid

PInsP2 Phosphatidyl-Inositol-bisphosphat

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PLC Phospholipase C

PP Proteinphosphatase

PPi Sodium pyrophosphate

PTK Proteintyrosinkinase

PTP Proteintyrosinphosphatase

PVA Polyvinylalkohol

PVDF Polyvinylidene Difluoride

PVP Polyvinylpyrrolidon

 eingetragenes Warenzeichen

R Widerstand

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RVD Regulatory Volume Decrease (regulative

Volumenabnahme)

RVI Regulatory Volume Increase (regulative Volumenzunahme)

s. siehe

SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate

SH2 Schwefelhydroxid

sog. so genannt

SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)

Strept. Streptavidin

Tab. Tabelle

TBS Tris-Buffered-Saline (Trisgepufferte Kochsalzlösung) TEMED N,N,N´N´-Tetramethylethylendiamin

TK Tyrosinkinase

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Spannung

u. und

u.a. unter anderem

V Volt

v.a. vor allem

verd. verdünnt

Verd. Verdünnung

vgl. vergleiche

V hyper, 5 min Modalwert des Zellvolumens in hyperosmotischer Lösung

nach fünfminütiger Inkubation

Abkürzungsverzeichnis

V hyper, 20 min Modalwert des Zellvolumens in hyperosmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation

V hypo, 5 min Modalwert des Zellvolumens in hypoosmotischer Lösung

nach fünfminütiger Inkubation

V hypo, 20 min Modalwert des Zellvolumens in hypoosmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation

V hyper (korr) korrogierter Modalwert des Zellvolumens in hyper- osmotischer Lösung

V hypo (korr) korrigierter Modalwert des Zellvolumens in hypo-

osmotischer Lösung

V iso, 5 min Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung nach fünfminütiger Inkubation

V iso, 20 min Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation

Viso Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung V mean hyper (korr) korrigiertes mittleres Spermienvolumen in

hyperosmotischer Lösung

V mean hypo (korr) korrigiertes mittleres Spermienvolumen in

hypoosmotischer Lösung

V mean iso mittleres Spermienvolumen in isoosmotischer Lösung

Vol. Volumen

Vr relative Volumenverschiebung

Vrh relative Volumenzunahme des Modalwertes in hypoosmotischer Lösung

Vrh 5 relative Volumenzunahme des Modalwertes in

hypoosmotischer Lösung nach fünfminütiger Inkubation Vrh 20 relative Volumenzunahme des Modalwertes in hypo- osmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation Vrhy 5 relative Volumenabnahme des Modalwertes in

hyperosmotischer Lösung nach fünfminütiger Inkubation

Vrhy 20 relative Volumenabnahme des Modalwertes in hyper- osmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation

v/ v volume/volume (Volumen/ Volumen)

w/ v weight/ volume (Gewicht/ Volumen)

xg x-fache der Erdbeschleunigung

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Die Begriffe Spermium, Spermatozoon und Samenzelle werden synonym verwendet.

A. Einleitung

Die Reizaufnahme und -beantwortung gilt als ein Charakteristikum der Zelle. Jede Zelle ist darauf programmiert, auf spezifische Signale zu antworten. Sie beeinflussen das Verhalten der Zelle und entscheiden, ob die Zelle leben oder sterben soll.

Die Plasmamembran einer Zelle ist dabei sehr wichtig, da die Membran die Grenze zwischen Zelle und dem sie umgebenden Milieu darstellt. Transportproteine, Ionen- kanäle und Rezeptoren der Membran sind in die Volumenregulation und Signalüber- tragung involviert (ALBERTS et al. 2002).

Signalübertragung ermöglicht dem Spermium, einer hoch spezialisierten, auf Fortpflanzung ausgerichteten Zelle, die Anpassung an die sich vom Verlassen des Hodens bis zur Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle ständig verändernden Bedingungen. Spermatozoen reagieren dabei sehr schnell auf osmotische Veränderungen in ihrer Umgebung. Die genauen Signalübertragungsmechanismen sind noch unklar und kaum erforscht. Da die Signalübertragungswege zell- und speziesspezifisch sind, können Informationen nicht ohne weiteres übertragen werden (TARDIF et al. 2003).

Da Phosphorylierungsreaktionen von Proteinen an der Regulation verschiedener Spermienfunktionen wie Motilität, Kapazitation, Erkennung der Zona pellucida und Gameteninteraktionen beteiligt sind (TARDIF et al. 2001), liegt die Vermutung nahe, dass sie auch in die Volumenregulation involviert sind.

Im Rahmen der vorliegenden Studien sollten die membranabhängigen und intrazellulären Transportmechanismen sowie eine anzunehmende Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung an osmotisch stimulierten Spermien in vitro untersucht werden. Der Eber wurde als Modelltier ausgewählt, da die porcinen Spermien als

„perfektes Osmometer“ funktionieren, d.h. die Volumenveränderung verhält sich umgekehrt proportional zur Osmolarität (PETROUNKINA u. TÖPFER-PETERSEN 2000). Es wurden die Effekte verschiedener Inhibitoren auf die möglicherweise beteiligten Signalwege der Volumenregulation unter iso-, hypo- und hyperosmotischen Bedingungen überprüft. Mittels eindimensionaler SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting wurden die tyrosin-

A. Einleitung

phosphorylierten Proteine analysiert. Der Grad der Tyrosinphosphorylierung wurde zusätzlich mit dem Durchflusszytometer unter verschiedenen osmotischen Belastungen und unter der Einwirkung verschiedener Inhibitoren, die Einfluss auf die volumenregulatorischen Mechanismen erzielten, charakterisiert.

In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, Informationen über die Signal- übertragung an der Plasmamembran porciner Spermien bei der Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen zu gewinnen. Außerdem wurde die vermutete Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung näher beleuchtet.

Das Ziel war es, ein Modell zu entwickeln, das die Zusammenhänge der in der Signaltransduktion beteiligten Mechanismen darstellt, um einen Beitrag zum Verständnis der Zellphysiologie der Spermien zu leisten.

B. Literaturübersicht

1. Das Ejakulat

Als Ejakulat oder Sperma bezeichnet man die Flüssigkeit, die von männlichen Tieren beim Deckakt abgegeben wird. Von den Spermatozoen ist das Seminalplasma zu unterscheiden, das sich aus den Sekretionsprodukten des männlichen Genitale zusammensetzt. Bei der Ejakulation kommen die Spermien mit dem flüssigen Anteil in Kontakt. Die Zusammensetzung des Ejakulates hängt vom Verhältnis der beiden genannten Bestandteile zueinander sowie von den männlichen Geschlechtsdrüsen (Größe, Lagerungskapazität, Sekretionsleistung) ab (MANN 1954). Beim Eber beträgt das Volumen etwa 150-200 ml.

Neben ausdifferenzierten Spermien, von denen ein Eberejakulat durchschnittlich 60 Milliarden enthält, weist das Ejakulat auch eine geringe Anzahl unreifer Samenzellen auf. Weitere im Sperma anzutreffende Zellen sind abgestoßene Epithelzellen, kernlose Zytoplasmatropfen und Leukozyten.

Zunächst soll auf den flüssigen Bestandteil des Ejakulates eingegangen werden.

1.1. Das Seminalplasma

Beim Seminalplasma handelt es sich um den gesamten spermienfreien Teil des Ejakulates. Dieser flüssige Bestandteil des Spermas besteht aus den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, Hoden, Nebenhoden und exkretorischen Gängen. Nicht alle gebildeten Sekrete gelangen ins Ejakulat, ein Teil wird vorher rückresorbiert, dabei handelt es sich im Wesentlichen um Material, das im Hoden, dem Nebenhoden und den Ausführungsgängen gebildet wird (MANN 1981). Wasser stellt mit 98% den Hauptbestandteil des Seminalplasmas dar (KÖNIG 1990, WEITZE u. MÜLLER 1991). Weitere Inhaltsstoffe sind Nährstoffe wie Fructose, Sorbit, Inosit und Lactat, freie Aminosäuren, Proteine, Lipide, Ionen sowie niedermolekulare Verbindungen (SCHÜLKE 1991). Die Zusammensetzung des Seminalplasmas

B. Literaturübersicht

variiert nach Tierart, Rasse, Zuchtsaison, reproduktiver Belastung. PETZOLDT u.

NEHRING (1986) berichten hinsichtlich der Ionenkonzentrationen über Speziesunterschiede, besonders die Angaben zu den Na⁺- und K⁺-Konzentrationen variieren sehr stark und zeigen tierartspezifische Unterschiede (PETZOLDT et al.

1985). Die Osmolarität des Seminalplasmas beträgt 304±7 mosm/kg (VENGUST 1983).

Das Seminalplasma hat verschiedene Funktionen: Es ist für den passiven Transport der noch unbeweglichen Spermien während der Ejakulation im weiblichen Genitale zuständig. Nach der Ejakulation regt es die Spermien zu Schwanzbewegungen an.

Da die Energiereserven der Spermatozoen nur für etwa 30 Sekunden ausreichen, stellt das Seminalplasma energiereiche Substanzen in Form von Glukose und Fruktose für die Bewegung zur Verfügung. Die Spermien wandeln diese durch Zellatmung und Glykolyse in Adenosintriphosphat (ATP) um. Seminalplasma stellt also die Energiequelle für die Motilität der Spermatozoen dar. Das Seminalplasma besitzt auch eine puffernde Wirkung und es stimuliert die Aktivität und den Stoffwechsel der Spermien. Das Seminalplasma nimmt außerdem Einfluss auf die Kapazitation. Es übt einen dekapazitierenden Effekt auf die Spermien aus (SUZUKI et al. 2002). Die Proteine des Seminalplasmas lagern sich bei der Ejakulation an die Spermien an, ummanteln die Spermienoberfläche durch Interaktionen mit cholinen Phospholipiden, stabilisieren auf diese Weise die Membran und verhindern die vorzeitige Akrosomreaktion (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996, MANJUNATH 2002).

THÉRIEN et al. (2001) beschreiben, dass es bei der Entfernung der Proteine des Seminalplasmas zur Stimulation des Lipideffluxes aus der Spermienmembran kommt, ein kapazitationsfördernder Effekt liegt vor.

2. Die Morphologie des Spermatozoon

Nachdem im vorangegangenen Abschnitt der flüssige Bestandteil des Ejakulates beschrieben worden ist, soll im Folgenden auf die Morphologie und Physiologie der Spermatozoen näher eingegangen werden.

2.1. Grundbaustein Zelle

Die Zelle stellt die kleinste, noch lebensfähige morphologische Baueinheit dar. Drei Charakteristika kennzeichnen sie: Die Zelle ist vermehrungsfähig, reizbar in Form von Reizaufnahme und –beantwortung, und sie muss ihre Struktur gemäß dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik (Entropiesatz) mit Hilfe eines Stoffwechsels aufrechterhalten.

Die Zelle ist von einem System von Membranen gekennzeichnet: Die Plasma- membran grenzt die Zelle nach außen ab und umschließt das Zytoplasma, das die Gestalt der Zelle bestimmt. Weitere Membranen teilen das Plasma in verschiedene, geschlossene, getrennt gesteuerte Reaktionsräume (Kompartimente). Gut unter- suchte Kompartimente stellen die von intrazellulären Membranen umgebenen Zellorganellen dar.

Das größte Zellorganell bildet der die genetische Information (DNA) enthaltende Zellkern. Bei somatischen Zellen besitzt er in der Regel ein Genom aus zwei einander entsprechenden Chromosomensätzen (2n), er wird als diploid bezeichnet.

Mit der äußeren Membran des Zellkerns ist das Endoplasmatische Retikulum (ER) verbunden. Es besteht aus einem in sich geschlossenen System flacher Höhlen und Röhren. Zu unterscheiden ist das rauhe (granuläre), auf der Oberfläche Ribosomen aufweisende Endoplasmatische Retikulum (rER) vom glatten (agranulären) (gER).

Während das rER eine Rolle bei der aktiven Proteinbiosynthese spielt, findet im gER die Lipid- und Phospholipidsynthese statt. Das gER dient weiterhin als Calcium- speicher, der für den Erhalt eines niedrigen Ca²⁺-Spiegels im Zytoplasma sorgt.

Im Golgi-Apparat findet die Reifung von Proteinen statt, außerdem transportiert er Membranlipide und Proteine zu ihren Zielen.

B. Literaturübersicht

Zu den Organellen gehören auch die Mitochondrien, die als Haupterzeuger des Adenosintriphosphates (ATP) durch den oxidativen Abbau von Nahrungsstoffen als

„Kraftwerke“ der Zelle fungieren. In den Mitochondrien finden der Zitrat-Zyklus, der Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation, die mit der Atmungskette gekoppelte Synthese von ATP (oxidative Phosphorylierung) und Teile des Harnstoffzyklus statt.

Lysosomen und Peroxisomen sind ebenfalls kleinere, kugelförmige Organellen mit bestimmtem Enzymbesatz, zu dem auch Hydrolasen und Katalasen gehören, die dem Abbau der in die Vesikel aufgenommenen Substanzen dienen. Die Oxidasen und Katalasen enthaltenden Peroxisomen nehmen u.a. am Fettstoffwechsel teil.

Endosomen und Exosomen stellen bläschenförmige Vesikel dar, die am Stoffaus- tausch der Zelle mit ihrer Umgebung beteiligt sind.

Trotz eines allgemeinen Grundbauplans gibt es nicht die Zelle schlechthin. Sie tritt in bestimmter Gestalt, Differenzierung und Determination auf. Trotz Spezialisierung auf unterschiedliche Aufgaben sind die Zellorganellen allen verschiedenen Zelltypen gemeinsam. Die wesentlichen, allgemeinen Aussagen dieses Abschnitts sind ALBERTS et al. (2002) entnommen.

2.2. Das Spermatozoon - eine besondere Zelle

Bei dem Spermatozoon handelt es sich um eine kleine (50-70 µm lange), kompakte, hochspezialisierte Zelle, die der Fortpflanzung dient. Das Ziel dieser besonderen Zelle besteht darin, die Gene, das väterliche Erbgut, das sie trägt, weiterzugeben. Ihr Bauplan ist auf dieses Ziel ausgerichtet und optimiert. Das Spermatozoon muss fähig sein, die zum Erlangen der Befruchtungsfähigkeit erforderlichen, als Kapazitation zusammengefassten Reifungsvorgänge im weiblichen Genitale zu durchlaufen. Die Kapazitation befähigt die Spermatozoen zur Hyperaktivierung und Akrosomreaktion.

Bei der Akrosomreaktion handelt es sich um eine von der Zona pellucida der Eizelle ausgelöste Exozytose des Akrosoms. Durch Punktfusionen der äußeren akrosomalen und der darüber befindlichen Plasmamembran entstehen Vesikel, durch die akrosomale Enzyme freigesetzt werden. Die freigesetzten Enzyme führen zur Proteolyse der Zona pellucida, die dann ein hyperaktiviertes Spermium

penetrieren kann. Daraufhin erfolgt die Befruchtung, die Verschmelzung der männlichen und weiblichen Gamete zur Zygote. Die Abb. 1 stellt die funktionellen Kompartimente des Spermatozoon und ihre Aufgaben dar.

Akrosom

Nukleus M ittelstück

Schw anz Postakrosomale Region

M otilität Energie versorgung Fusion mit der Eizelle

Penetration der Zona pellucida

Abb. 1: Schematische Darstellung des Spermiums: Funktionelle Kompartimente des Spermatozoons (blau) und ihre Aufgaben (rot)

Das Spermatozoon zählt zu den am stärksten polarisierten Zelltypen (TÖPFER- PETERSEN u. WABERSKI 2001). ALBERTS et al. (2002) bezeichnen „typische Spermien“ als „`abgespeckte` Zellen“, denen zytoplasmatische Organellen wie Ribosomen, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat fehlen, da diese für die Aufgabe der Spermien, die DNA des Vatertieres zur Eizelle zu bringen, nicht von Nutzen sind. Dieser außergewöhnliche Zelltyp ist fast plasmafrei. Statt dessen verfügt die Samenzelle über zwei charakteristische morphologisch und funktionell unterscheidbare Regionen, die von einer gemeinsamen Plasmamembran um- schlossen und nach außen abgegrenzt werden: Der Schwanz, der dem Spermium die aktive Bewegung zur Eizelle ermöglicht und ihm hilft, sich durch die Eihülle zu bohren, sowie den die DNA enthaltenden Spermienkopf.

Der Kopf des Spermiums ist annähernd oval, 7-10 µm lang, 4-5 µm breit und an den Seiten abgeflacht (DÖCKE at al. 1982). Der Zellkern nimmt den größten Teil des Spermienkopfes ein und besteht als Träger der genetischen Information aus hochgradig kondensiertem Chromatin (MONESI 1976). Ein wichtiger Unterschied zu

B. Literaturübersicht

diploiden Chromosomensatzes im Laufe der Reifeteilung nur über einen haploiden Satz (n) verfügen. Bei der Befruchtung der Oozyte entsteht durch die Vereinigung der zwei haploiden Sätze (n+n) dann wieder ein diploider Chromosomensatz (2n).

Der Zellkern weist ein deutlich kleineres Volumen auf als bei somatischen Zellen, er ist von einer äußeren und einer inneren Kernmembran umgeben. Etwa die Hälfte bis zwei Drittel des apikalen Spermienkopfes wird von der auch als Akrosom bezeichneten Kopfkappe bedeckt.

Bei dem Akrosom handelt es sich um ein modifiziertes Lysozym, das aus den Vesikeln des Golgi-Apparates entsteht. Die Kopfkappe enthält Enzyme, die für den Befruchtungsvorgang unentbehrlich sind. Bei Kontakt mit der Oozyte (Eizelle) werden diese Enzyme aktiviert. Es kommt zur Freisetzung der Enzyme, die zur kontrollierten Proteolyse der Zona pellucida führen. Das Spermium kann dann die Zona pellucida penetrieren. Schließlich ermöglicht dieser Vorgang die Verschmel- zung mit dem weiblichen Zellkern (MONESI 1976, SCHÜLKE 1991, YANAGIMACHI 1994).

Der Spermienschwanz (Geißel) enthält ein zentrales Axonem, das aus dem direkt unterhalb des Kernes gelegenen Basalkörper hervorgeht. Das Axonem besteht aus einem Filamentkomplex mit gleichartiger Struktur, einem Mikrotubulussystem mit einer 9x2 Fibrillenstruktur und ist von einer fibrinösen Hülle umschlossen. Der Schwanz gliedert sich in vier Abschnitte oder Regionen: den Hals, das Mittelstück, Haupt- und Endstück. Die Halsregion, die auch als Verbindungsstück bezeichnet wird, verbindet den Spermienkopf mit dem Mittelstück der Geißel. Dieser Teil des Spermiums ist sehr empfindlich, somit treten hier leicht Läsionen auf. Die Halsregion besteht aus einer in der Eindellung des Kernes gelegenen Basalplatte und dem peripheren, segmentierten Streifenkörper. Der Hals enthält die Zentriolen. Das Mittelstück besitzt zentral einen von einer spiraligen Mitochondrienscheide um- gebenen Achsenfaden. Die vielen Mitochondrien sind als Energielieferanten hier strategisch sehr günstig gelegen, da sie die Geißel besonders gut mit ATP versorgen können. Die Mitochondrienscheide ermöglicht die lichtmikroskopische Abgrenzung vom sich anschließenden Haupt- und Endstück. Am Übergang zum Hauptstück befindet sich der sog. Schlussring. Das Hauptstück bildet den längsten Abschnitt der

Geißel. Es setzt sich aus einem Achsenfaden und Begleitfasern zusammen, die von einer fibrillären Hülle umgeben sind. Das Endstück weist im Gegensatz zum Hauptstück weder Begleitfasern noch eine Fibrillenscheide auf. Der Achsenfaden ist nur von dem Plasmalemm umgeben (SETCHELL 1982, SCHNORR 1996). Die Morphologie des Spermatozoon ist zur Veranschaulichung in der Abb. 2 dargestellt.

Die Geißel ist für die Fortbewegung und die Penetration der Eizelle von großer Bedeutung. Die aktive Bewegung entsteht durch das Gegeneinanderschieben von zwei benachbarten Mikrotubulipaaren.

Die einzelnen Abschnitte der Plasmamembran werden nach der zu umhüllenden Region verschieden benannt.

Mit dem Eintritt in die Geschlechtsreife beginnen in den Samenkanälchen zyklisch ablaufende Samenbildungsprozesse, vorher unterliegen die männlichen Keimzellen einem Meioseblock (TÖPFER-PETERSEN u. AURICH 2000). Die Vermehrung der Spermatogonien findet in drei Phasen, der Vermehrungs-, Wachstums- und Reifungsperiode, statt. In ihrem Verlauf entstehen aus den Spermatogonien über die Stufe der Spermatozyten I. und II. Ordnung Spermatiden. In Bezug auf die morphologische Betrachtung des Spermiums ist v.a. der letzte Abschnitt der Samen- zellbildung, die Spermiogenese, interessant, da sich während dieser Differenzierungsperiode aus runden Spermatiden die Spermien entwickeln und die baulichen Besonderheiten entstehen. In der aus vier Stufen (Golgi-, Kappen-, Akrosom- und Reifephase) bestehenden Spermiogenese kommt es zur Ausbildung des Akrosoms, Umgestaltung des Zellkerns und Entwicklung der Geißel. Der Hauptteil des Zytoplasmas mit Golgi-Apparat, Lipidtropfen und Ribosomen wird eliminiert (SCHNORR 1996).

B. Literaturübersicht

Abb. 2: Schematische Darstellung der Ebersamenzelle (nach GADELLA 1994)

A. Querschnittdarstellung des Spermiums

B. Regionen der Plasmamembran der Spermienzelle (Darstellung der Oberfläche) C. Akrosomreaktion

Alle durchgezogenen Linien stellen die Membrandoppelschichten dar:

1. Plasmamembran, 2. äußere akrosomale Membran, 3. akrosomale Flüssigkeit, 4. innere akrosomale Membran, 5. Kernhülle, 6. Kern, 7. Kernring und Manschette, 8. Mitochondrien, 9. proximaler Teil des Flagellums, 10. Schlussring, 11. distaler Teil des Flagellums, 12. Fibrillen, 13.–16. bezeichnen die Segmente der Plasma- membran: 13. Apikalsegment, 14. Prääquatoriales Segment, 15. Äquatoriales Segment, 16. Postäquatoriales Segment, 17. Vesikel, die während der Akrosom- reaktion durch Fusion der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran gebildet werden

3. Physiologie der Samenzelle 3.1. Die Plasmamembran

Die Plasmamembran ist sehr wichtig für die Zelle, da die Membran als Grenze zwischen Zelle und dem sie umgebenden Milieu dafür sorgt, dass ein konstantes inneres Milieu geschaffen und erhalten wird. Auch im Hinblick auf die im Rahmen dieser Studien interessierende Volumenregulation und Signalübertragung spielt die Membran eine bedeutende Rolle. Somit soll auf diese Begrenzung der Zelle genauer eingegangen werden.

3.1.1. Aufbau

Bei der Plasmamembran handelt es sich um eine lamelläre Doppelmembranstruktur oder Lipiddoppelschicht. Man unterscheidet drei Lipidklassen: Phospholipide, Glykolipide und Cholesterol.

Phospholipide, die mit 20-25% den Hauptanteil bilden, bestehen aus einem polaren, hydrophilen Kopfstück und zwei unpolaren, hydrophoben Schwänzen. Diese zwei Bausteine der Phospholipide führen dazu, dass sich die Phospholipide in wässrigem Milieu so anordnen, dass die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten nicht mit der umgebenden Lösung in Kontakt kommen. Man beobachtet dabei zwei verschiedene Anordnungen der Phospholipide: Zum einen können Mizellen entstehen. Diese weisen eine kugelförmige Gestalt auf. Die hydrophoben Schwänze zeigen zur Mitte, die hydrophilen Köpfe sind dem wässrigen Milieu zugewandt. Zum anderen kann eine Doppelschicht auftreten. Diese ist im Gegensatz zu den Mizellen nicht kugelförmig sondern flächig. Aufgrund der amphipathischen Eigenschaften werden in wässrigen Lösungen spontan Doppelschichten mit hydrophoben Innenbereichen und einer hydrophilen Oberfläche gebildet. Dieses Phänomen wird als „fluid mosaic model“ bezeichnet (SINGER u. NICHOLSEN 1972). Die Schwänze zweier Phospho- lipide sind also einander zugewandt, mit den Nachbarmolekülen liegen die Phospholipide Kopf an Kopf. Diese Struktur der Doppelschicht findet man bei den

B. Literaturübersicht

biologischen Membranen. Auf diese Weise sind die Zellen gegen den Eintritt der meisten wasserlöslichen Moleküle undurchlässig. Innerhalb der Membran findet eine ATP-abhängige Bewegung der Phospholipide statt, die v.a. von der äußeren zur inneren Membranschicht verläuft (GADELLA et al. 1999).

Der Anteil des die zweite Lipidklasse bildenden Cholesterols ist mit bis zu zehn Prozent sehr hoch, das ist charakteristisch für die Spermienplasmamembran (ALBERTS et al. 2002).

In diese Lipiddoppelschicht sind Proteine auf verschiedene Art und Weise eingebaut:

Bei den integralen Proteinen gibt es einige, die die Membran vollständig durch- dringen (HOUSLEY u. STANLEY 1982), man spricht von sog. Tunnelproteinen, aus denen Kanäle und Poren bestehen. Andere integrale Proteine sind tief in die Lipiddoppelschicht eingebaut, ragen aber nur aus einer Membranoberfläche heraus.

Sind sie an der extrazellulären Seite der Membran in dem hydrophilen Bereich verankert, handelt es sich um Ektoproteine, befinden sie sich auf der dem Intrazellulärraum zugewandten Membranseite, sind es Endoproteine. Einige Proteine sind in der Lage, sich lateral in der Membran zu bewegen.

Insgesamt machen die Proteine 60-70% des Gewichtanteils der Membranmasse aus. Viele der peripheren und integralen Proteine weisen Kohlenhydratseitenketten mit negativen Ladungen auf, die als Glykolipide oder Glykoproteine kovalent gebunden sind. Mit Hilfe dieser Seitenketten können Moleküle aus dem umgebenden Milieu locker gebunden werden. Es entsteht auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran eine Schutzschicht, die als „surface code“ bezeichnet wird (AMANN u. PICKETT 1987).

Die Plasmamembran stellt eine zweidimensionale Flüssigkeit mit einer dynamischen und einer flexiblen Struktur dar. Transversalbewegungen einzelner Moleküle sind innerhalb der Lipidphase möglich, das ist für den Ablauf metabolischer Zellfunktionen notwendig.

Beim molekularen Bau der Spermienmembran herrschen bezüglich der Fluidität und Membrantransportmechanismen regionale Unterschiede (ROVAN 2001). Die Membranfluidität ist von der Temperatur, der Fettsäurezusammensetzung und dem Verhältnis zwischen Cholesterin und Phospholipiden abhängig (QUINN 1981).

Verschiebt sich das Verhältnis Cholesterin-Phospholipide zugunsten der Phospho- lipide, wie es während der Kapazitation (s. Abschnitt 3.3. Kapazitation) zu beobachten ist (DAVIS 1978), wird die Membran in ihrer Gesamtheit durchlässiger und flüssiger (LANGLAIS u. ROBERTS 1985). Es herrschen bezüglich des Cholesterin-Phospholipid-Verhältnisses tierartliche Unterschiede. Eberspermien weisen einen geringeren Cholesterolgehalt auf (TARDIF et al. 2003). Bei einem höheren Anteil an Cholesterin sinkt die Membranfluidität, die Resistenz gegenüber Temperaturschwankungen steigt. Bei einem höheren Anteil ungesättigter Fettsäuren dagegen steigt die Membranfluidität, die Resistenz und die Vitalität der Spermatozoen sinken (SCHILLING u. VENGUST 1985). GLAWISCHNIG (1985) und CIERESZKO et al. (2000) beschreiben saisonale Veränderungen der Membran- integrität und Spermienmorphologie, die wahrscheinlich auf dem Einfluss der erhöhten Umgebungstemperatur beruhen.

3.1.2. Funktionen

Die Funktionen der Plasmamembran der Spermatozoen hängen von ihrer selektiven Permeabilität, ihrer Fähigkeit zum aktiven Transport und ihrer elektrischen Polarisation ab, wobei die letztgenannte Eigenschaft die beiden ersten voraussetzt (WITTKE 1987). Die Plasmamembran stellt die Grenze zwischen der Spermienzelle und dem sie umgebenden äußeren Milieu dar. Ein konstantes inneres Milieu wird mit Hilfe der Plasmamembran geschaffen und erhalten. Es handelt sich um eine selektive, kontrollierende Barriere für Bewegungen von polaren Molekülen zwischen dem inneren und äußeren Zellraum. Somit ist die Unversehrtheit der Plasma- membran eine wichtige Grundlage für die Funktion der Zelle. Zu den Funktionen der Spermienmembran gehören außerdem der Schutz vor äußeren Einflüssen, Kontakt zur Umwelt und das Aufrechterhalten des Stoffwechsels. Als Kontaktstelle und Grenzschicht ist die Plasmamembran sehr empfindlich gegenüber Veränderungen des äußeren Milieus wie Änderungen der Temperatur, der Ionenkonzentrationen oder Schwankungen des pH-Wertes. Es können als Folge dieser Veränderungen Permeabilitäts- und Fluiditätsschwankungen sowie Verlust von intrazellulären Ionen

B. Literaturübersicht

auftreten (DÖCKE et al. 1982, QUINN 1985, AMANN u. PICKETT 1987). Die Sensibilität der Plasmamembran ist tierartspezifisch, vor allem Eberspermatozoen sind sehr empfindlich gegenüber Temperaturänderungen (WATSON 1981). Die Spermienplasmamembran spielt für die im Rahmen des Zellmetabolismus wichtigen Stofftransporte eine große Rolle. Selektive Transportmechanismen sind vorhanden, die Membranproteine haben eine übergeordnete Bedeutung inne. Man unterscheidet zwei Transportsysteme: das passive und das aktive. Passive Transporte sind durch Diffusion möglich. Polare Moleküle wie Wasser- oder NH4-Moleküle können auf diesem Weg die Membran passieren. Die Voraussetzung ist, dass die Moleküle klein und nicht geladen sind. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von der

„Semipermeabilität der Membran“. Der aktive Transport ist energieabhängig. Die Aufnahme und Abgabe lipidunlöslicher Stoffe wird durch Kanäle oder sog. „carrier“

(Trägerproteine) vermittelt. Dabei können Ionenkonzentrationsgradienten mittels ATP angetriebener Transportmechanismen aufrechterhalten werden. Auf die verschiedenen Formen des Wassertransportes durch die Plasmamembran wird im folgenden Abschnitt, der sich mit der Regulation von Wassergehalt und osmotischem Druck beschäftigt, näher eingegangen. Weitere Aufgaben der Plasmamembran sind elektrische Isolation und Ausbildung eines Membranpotentials.

Neben diesen allgemeinen Funktionen haben die Membranbereiche der einzelnen Spermienabschnitte weitere Aufgaben. Die Samenzellmembran besitzt definierte Bereiche, die sich durch unterschiedliche Zusammensetzungen und Funktionen definieren (EDDY u. O´BRIEN 1994). FRIEND 1982 und HOLT 1984 bezeichnen die verschiedenen Regionen als „Domänen“. Der Spermienkopf weist im akrosomalen Bereich des Apikalsegmentes einen Membranabschnitt über dem vorderen Akrosomrand auf. Dieser Abschnitt ist an der Akrosomreaktion beteiligt.

Membranabsorbierte und -integrierte Glykoproteine stabilisieren die Membran in diesem Bereich zusätzlich und verhindern eine vorzeitige Auslösung der Akrosomreaktion. Die periakrosomale Plasmamembran spielt außerdem eine Rolle bei der Interaktion zwischen Spermium und Zona pellucida. Man unterscheidet weiter die Membranabschnitte des Äquatorialsegmentes sowie des postakrosomalen Bereiches, die für die Interaktionen mit der Oozyte von Bedeutung sind

(YANAGIMACHI 1994). GADELLA et al. (1994) unterscheiden außerdem den Membranabschnitt im Bereich des Mittelstückes und im Bereich der restlichen Geißel. Im zweitgenannten Abschnitt befinden sich Moleküle, die für die Fortbewegung zuständig sind. Zudem verhindern Glykoproteine eine vorzeitige Hyperaktivierung (YANAGIMACHI 1994). Die Zusammensetzung und die Charakteristika der einzelnen Abschnitte ändern sich während der Reifungsphase der Samenzellen im Nebenhoden, während des Kontaktes mit dem Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen bei der Ejakulation sowie bei der Kapazitation im weiblichen Genitale. DACHEUX et al. (1979) untersuchen die Veränderungen während der epididymalen Reifung bei Eberspermatozoen und beobachten im Zusammenhang mit der Veränderung der Membranzusammensetzung eine zunehmende Sensibilität der Spermien gegenüber dem umgebenden Milieu.

Während der Reifung der Spermienzellen steigt die Diffusionskonstante aller Domänen, v.a. die Membran des Akrosoms wird flüssiger (FRIEND 1982, HOLT 1984).

3.2. Regulation von Wassergehalt und osmotischem Druck

3.2.1. Physiologische Grundlagen

Abhängig von Alter und Geschlecht besteht der Körper der Säugetiere bis zu zwei Dritteln aus Wasser, in dem Ionen und Moleküle gelöst sind. Viele biologische Funktionen sind mit der Aufnahme, Abgabe, Verbrauch sowie der Regulation von Wasser im Körper verbunden. Wasser spielt als Lösungs-, Dispersions- und Transportmedium eine Rolle. Ein konstanter Wasser- und Elektrolytgehalt ist daher sehr wichtig (GROSS et al. 1989). Im Vergleich zu vielen somatischen Zellen, die einen Wassergehalt von bis zu 70% aufweisen (KARLSON et al. 1994), verfügen Samenzellen speziesabhängig über einen geringeren Wasseranteil. Der Wasser- gehalt in Eberspermatozoen wird bei GILMORE et al. (1995) mit 30-40% angegeben.

Außerdem besitzen die Spermien einen geringeren Zytoplasmaanteil im Vergleich zu

B. Literaturübersicht

somatischen Zellen (PETZOLDT u. NEHRING 1992). Der zelluläre Stoffwechsel der Spermatozoen ist vereinfacht, er beschränkt sich auf den Energiestoffwechsel und regulatorische Vorgänge, die zur Aufrechterhaltung des intrazellulären Milieus beitragen. Das zelluläre Volumen reagiert sehr empfindlich auf Veränderungen des extrazellulären Milieus wie Verschiebungen der Zusammensetzung der Elektrolyt- und Nichtelektrolytkomponenten, der Temperatur und der Spermiendichte. Wasser- permeation ist für die Aufrechterhaltung der osmotischen Verhältnisse von großer Bedeutung. Spermien weisen eine hohe Wasserpermeabilität auf. Aktive und passive Transportprozesse des Wassers über die Zellmembran ermöglichen die Regulation des Zellvolumens und der optimalen Ionenverhältnisse im Inneren der Zelle (PETZOLDT 1988). Unter passivem Wassertransport versteht man einerseits die Diffusion des Wassers durch die Zellmembran. Zum anderen fällt darunter der Transport von Wassermolekülen, die nicht einzeln, sondern als sog. „cluster“

vorliegen und durch die Lipidfluidität die Membran passieren können. Das ist möglich durch Konformationsänderungen der Anordnung der Kohlenwasserstoffketten, die man sich als höhlenartige „Störstellen“ vorstellen kann, in denen Wasserpakete Platz finden (KARLSON et al. 1994). Zusätzlich kann Wasser als „Flüssigkeitsfaden“ (bulk flow) die Poren durchströmen und dabei Ionen mittransportieren. Man spricht dabei vom „solvant drag“ (GROSS et al. 1989).

Die hohe Wasserpermeabilität der Spermienmembran ist vermutlich durch die Existenz spezieller Proteine bedingt, die als Wasserkanäle fungieren. Man geht davon aus, dass diese Proteine demselben Typ entsprechen wie spezielle integrale Proteine („CHIP 28“), die bei menschlichen Erythrozyten beschrieben werden. LIU et al. (1995) widerlegen diese Annahme, danach handelt es sich um ein besonderes, noch nicht isoliertes Protein.

Es findet meist ein osmotischer Wasserfluss statt, der an den Ionenfluss gekoppelt bzw. von diesem bedingt wird. Der osmotische Druck ist von der Anzahl der im Lösungsmittel gelösten Teilchen abhängig. Man definiert 6,06 x 10²³ Teilchen (= 1 mol einer nicht dissoziierten Substanz) als Messeinheit ein „Osmol“. Schon geringe Differenzen der Ionenkonzentrationen zwischen dem Intra- und Extrazellulärraum führen zu einem osmotischen Gradienten. Die Membran kann dem

osmotischen Druck nicht standhalten. Je nach Richtung des Konzentrationsgefälles kommt es aufgrund des Strebens der Zelle nach einem osmotischen Gleichgewicht mit dem umgebenden Medium zur Zellschrumpfung oder -schwellung (NILIUS 1993).

Im Falle einer hypertonen (die Osmolarität des Milieus ist größer als die des Spermiums) oder hypotonen (die Osmolarität ist extrazellulär kleiner als intrazellulär) Situation liegt ein osmotischer Druckgradient vor (∆p). Der daraus resultierende Wasserein- bzw. -ausstrom unterliegt der folgenden Gleichung: ∆p=∆[s]*R*T. Bei R handelt es sich um die allgemeine Gaskonstante, T steht für die absolute Temperatur. Der Konzentrationsgradient wird in der Gleichung durch ∆[s] dargestellt.

Sie ist proportional zum osmotischen Druck. Diese Gleichung spiegelt somit den Einfluss der Temperatur, der Elektrolytverteilung und der Osmolaritätsschwankung auf die Intensität des Transportes wieder (SCHMIDT u. THEWS 1993). Nach der Van’t Hoffschen Theorie der Lösungen ist bei konstanter Temperatur der osmotische Druck proportional der Konzentration gelöster Teilchen und wiederum bei konstanter Konzentration proportional der absoluten Temperatur (NULTSCH 1991). Kommt es zum Wasserinflux, schwillt die Zelle an, findet dagegen ein Wasserefflux statt, schrumpft die Samenzelle in Folge dessen. Nach DREVIS und ERIKSSON (1966) sind Veränderungen des Zellvolumens daher ein Ausdruck von zellulären Regulationsleistungen bei osmotischen Belastungen.

Veränderungen der Membraneigenschaften wirken sich auf die Regulation des Spermienvolumens aus. Die Zellmembran kann durch die osmotische Reaktion beurteilt werden (PETZOLDT 1988). Eine intakte Membran kann Schwankungen der Ionenverhältnisse in gewissem Rahmen ausgleichen. Überführt man die osmotisch belasteten Spermatozoen danach in ein isotones Medium, stellt die Zelle ihren Ausgangszustand wieder her. Der Vorgang ist somit bei Zellen mit funktionsfähiger Plasmamembran reversibel. Werden bestimmte Konzentrationen in der Zellumgebung über- oder unterschritten, kommt es zu irreversiblen Membran- schäden, die eine Volumenregulation verhindern. Als Folge treten Lysis und Zelltod ein. Bei hypotoner Belastung spricht man von der sog. kritischen Osmolarität, wenn 50% der Zellen platzen. Dieser Wert ist speziesabhängig. Beim Hahn und beim Ganter liegt die kritische Osmolarität bei 17 mOsm, die Zellen sind bis kurz vor

B. Literaturübersicht

diesem Wert völlig intakt. Bei dem Spermatozoen der Bullen ist ein kontinuierlicher Abfall der Vitalität zu beobachten, die kritische Osmolarität beträgt 36 mOsm (WATSON et al. 1992). Beim Schwein liegt ebenfalls ein stetiger und sehr deutlicher Verlust der Lebensfähigkeit vor. Mit einer kritischen Osmolarität von 150 mosm/kg ist es am empfindlichsten. Die Osmolarität liegt im nativen Ejakulat der Eber bei 304±7 mosm/kg, dabei können Schwankungen zwischen 286-324 mosm/kg auftreten (VENGUST 1983).

Bei hypertoner Belastung hat man ein minimal tolerierbares Zellvolumen festgestellt, unter das die Zellen nicht mehr schrumpfen können. Eine weitere Dehydration führt zu irreversiblen Schäden. MERYMAN (1979) erklärt dieses Phänomen durch die

„Minimum Cell Volume“ Hypothese, nach der es zu einer Kompression des Zellinhaltes kommt. Die Zelle reagiert mit Widerstand auf den Schrumpfungsvorgang, ein osmotischer Druckunterschied baut sich an der Zellmembran auf, durch den es schließlich zu Membranschäden kommt. Die komplexe und starre Struktur sowie der geringe Plasmaanteil sprechen für diese Theorie (WATSON u. DUNCAN 1988).

An der Volumenregulation der Zellen soll eine Na⁺-/K⁺-ATPase beteiligt sein (ALBERTS et al. 2002). Die Volumenabnahme scheint bei Überführung der Zellen aus einem hypo- in ein isotones Milieu an die Aktivität dieses Enzyms gebunden zu sein, da bei der Hemmung der ATPase eine Rückregulation ausbleibt, wie es bei Astrozyten der Ratte festgestellt worden ist (FRASER u. SWANSON 1994).

Entsprechende Untersuchungen sind auch schon bei Spermien von Hund, Schaf und Schwein durchgeführt worden (RODRIGUEZ-GIL u. RIGAU 1996, PETROUNKINA 1998).

Bemerkenswert ist, dass die osmotischen Verhältnisse sich nicht nur auf die Volumenregulation auswirken, sondern auch Einfluss auf die Motilität der Samenzellen nehmen. DACHEUX et al. (1979) beschreiben, dass reife Eber- spermien unter hypotoner Belastung ihren Stoffwechsel verändern: Die Zellen produzieren vermehrt CO2, während die ATP-Produktion sinkt. Es folgt eine verminderte Motilität. FRASER et al. (2001) bestätigen einen verringerten, zu einer Motilitätsreduktion führenden ATP-Gehalt in Spermien unter hypo- und hyperosmotischen Belastungen. Sowohl die Fähigkeit der Volumenregulation als

auch der Motilität entwickelt sich bei Spermien während der Nebenhodenreifung (YEUNG et al. 2002).

3.2.2. Der hypoosmotische Schwelltest (HOST)

Das Phänomen der Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen ist mit Hilfe verschiedener Testverfahren der Spermatologie zu erfassen. Der Hypoosmotische Schwelltest (HOST) spielt dabei eine wichtige Rolle, auf dessen Messtechnik auch im Abschnitt C. (Eigene Untersuchungen) näher eingegangen wird. Dieses Testverfahren beruht darauf, dass unter hypoosmotischen Bedingungen ein Flüssigkeitstransport über eine intakte Zellmembran abläuft, bis ein Konzentrationsausgleich geschaffen ist (JEYENDRAN et al. 1992). Die Zelle schwillt zunächst an, dann erfolgt eine regulative Volumenabnahme (RVD = Regulative Volume Decrease). Unter hyperosmotischen Belastungen folgt nach einem anfänglichen Schrumpfen ein regulativer Volumenanstieg (RVI = Regulative Volume Increase). Mit Hilfe des HOST kann die osmotische Belastungsfähigkeit (Resistenz) der Spermatozoen untersucht (JEYENDRAN et al. 1984) und auf die Integrität sowie Funktionalität der Zellmembran geschlossen werden (JEYENDRAN et al. 1992, CABRITA et al. 1999). Auf der Grundlage des HOST ist auch versucht worden, Voraussagen in Bezug auf die Lebensfähigkeit von Spermien zu treffen, indem sie mit Vitalfärbungen kombiniert worden sind (NEILD et al. 1999, MUNUCE et al. 2000).

Aufgrund der speziesabhängigen, unterschiedlichen Sensitivität der Plasmamembran hinsichtlich des Wassertransportes können verschiedene Schwellungsmuster beobachtet werden (CURRY u. WATSON 1994). Bei Spermien des Bullen, der Maus und des Ebers stellt man fest, dass die Volumenveränderung umgekehrt linear zur Osmolarität erfolgt. Die Samenzellen dieser Spezies verhalten sich wie sog.

„perfekte Osmometer“ (DREVIUS 1972, DU et al. 1994, GILMORE et al. 1996, PETROUNKINA 1998, PETROUNKINA u. TÖPFER-PETERSEN 2000) im Gegen- satz zu den Spermien von Kaninchen und Schafböcken (HAMMERSTEDT et al.

1978).

B. Literaturübersicht

PETROUNKINA et al. (2000) weisen bei iso- und hypoosmotischen Volumen von Eberspermien zyklische Veränderungen unter Kapazitationsbedingungen nach, die einer mathematischen Periodizität folgen.

Die Korrelationen von Ergebnissen des HOST und denen der In-vitro-Fertilisation (IVF) fallen sehr unterschiedlich aus, der HOST als Untersuchungsmethode männlicher Infertilität ist umstritten. Während einige Autoren zeigen, dass der HOST Voraussagen zur Befruchtungsfähigkeit zulässt (JEYENDRAN et al. 1984, VAN DER VEN et al. 1986, CHECK et al. 1989, OKADA et al. 1990, CHAN et al. 1991), tragen bei anderen die Ergebnisse des HOST nicht zur Vorhersage der Befruchtungs- fähigkeit bei (CHAN et al. 1988, AVERY et al. 1990, ROTA et al. 2000).

Die Regulation des Wasserhaushaltes und das Zellverhalten bei Dehydration ist für die Tiefgefrier- und Flüssigkonservierung von elementarer Bedeutung, da die Dynamik des Wasserverlustes und ihre Folgen die Lebensfähigkeit, Motilität und Befruchtungsfähigkeit kryokonservierter Spermien beeinflussen (KAPP 1995).

3.3. Kapazitation

Um fertil zu werden, müssen die Spermien nach der epididymalen Reifung in einer komplexen Reihe molekularer Ereignisse, die in unteren Oviduktregionen stattfindet, von einem geschützten in einen funktionsaktivierten Zustand übertreten (TÖPFER- PETERSEN 1996). Dieses Phänomen haben zuerst AUSTIN (1951) und CHANG (1951) entdeckt, AUSTIN (1952) führt den Begriff der „Kapazitation“ ein. HARRISON (1996) definiert die Kapazitation als Serie positiv destabilisierender Ereignisse, die den Spermien erlaubt, die Zona-induzierte Akrosomreaktion und hyperaktivierte Motilität innerhalb eines kleinen Zeitfensters durchzuführen und danach zum Zelltod führt.

Bikarbonat-induzierte Phospholipidänderungen der Membran stellen ein frühes Ereignis während des Kapazitationsprozesses dar (HARRISON et al. 1996, GADELLA u. HARRISON 2002). Kapazitation ist mit einem Cholesterinausstrom aus der Plasmamembran verbunden, der zu einem Anstieg der Membranfluidität,

Modulation der intrazellulären Ionenkonzentrationen (z.B. Ca²⁺-Konzentration steigt an), Hyperpolarisation der Membran und einer Zunahme der Proteintyrosinphos- phorylierung führt. Der Kapazitationsvorgang ist außerdem mit Veränderungen des Metabolismus und der volumenregulatorischen Leistung verbunden. Die Ereignisse induzieren die Hyperaktivierung, die als Akrosomreaktion bezeichnete Vesikulation und Verschmelzung der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran am Äquatorialsegment (VISCONTI et al. 2002). PETROUNKINA et al. (2001b) stellen bei ihren Untersuchungen an Eberspermien verschiedene Muster der Tyrosinphos- phorylierung im Bereich der akrosomalen Region im Laufe der Kapazitation fest.

Die an die Spermienoberfläche assoziierten Proteine wie beispielsweise die Spermadhäsine beim Schwein sind an den Regulationsprozessen der Kapazitation beteiligt (SANZ et al. 1993), zusätzlich spielen Sekrete des weiblichen Genitaltraktes, Enzyme und Hormone eine Rolle.

In vitro werden die Kapazitationsbedingungen mit Hilfe spezieller, definierter Medien nachempfunden, um die In-vivo-Situation nachzustellen und die komplexen Ereignisse untersuchen zu können. Serumalbumin, Ca²⁺ und HCO3- spielen in diesen Medien eine wichtige Rolle (VISCONTI u. KOPF 1998).

Da nur kapazitierte Spermien auf die Signale der Eizelle antworten können, scheinen die entsprechenden Signal übertragenden, regulierenden und auch osmosensitiven Mechanismen erst während der Kapazitation vorbereitet zu werden (TÖPFER- PETERSEN et al. 2000).

Es werden potentielle Ähnlichkeiten zwischen der Kapazitation der Spermien und frühen, Ca²⁺-vermittelten Ereignissen während der Membranfusion bei Eukaryonten sowie bei verschiedenen Schritten der sekretorischen und endozytotischen Signalwege diskutiert (ABOU-HAILA u. TULSIANI 2003). Mit Hilfe von Modulatoren der Kapazitation wie Serumalbumin, Ca²⁺ und NaHCO3 hat gezeigt werden können, dass es transmembrane und intrazelluläre Signalwege geben muss, die die Kapazitation regeln (JHA u. SHIVAJI 2002).

B. Literaturübersicht

3.4. Signalübertragung

Wie im Abschnitt 2. „Morphologie des Spermatozoon“ bereits erwähnt, ist ein Charakteristikum einer Zelle die Reizbarkeit in Form von Reizaufnahme und -beantwortung. Dieses Kennzeichen hängt somit eng mit dem Thema dieses Kapitels zusammen, da für die Aufnahme und Beantwortung von Reizen eine Signal- übertragung in Zellen notwendig ist.

3.4.1. Allgemeine Mechanismen der Signalübertragung in Zellen

Jede Zelle ist programmiert, auf spezifische Signale zu antworten, die einzeln oder in Kombination auftreten und wirken können. Sie beeinflussen das Verhalten der Zelle und entscheiden, ob die Zelle leben oder sterben soll, außerdem ist die Signal- übertragung für die Koordination des Stoffwechsels essentiell.

Die Zelle steht über ihre Plasmamembran mit anderen Zellen und der umgebenden Flüssigkeit, in der Nährstoffe, Hormone, Neurotransmitter und Antigene vorhanden sind, in Kontakt. Allosterische Enzyme, Hormon- und Nervensignale spielen bei der Signalübertragung von Zellen eine Rolle. Hormon- und Nervensystem sind der chemischen Signalübertragung zuzuordnen, ihre Mechanismen sind sehr ähnlich.

Sie nutzen einige Botenstoffe wie Noradrenalin und Adrenalin gemeinsam und werden als neuroendokrines System zusammengefasst. Während Hormone von endokrinen Zellen sezerniert, durch das Blut zu entfernten Zellen transportiert werden und durch das Anbinden an einen Rezeptor an der Zelle eine Aktivitäts- änderung der Zelle bewirken, werden Neurotransmitter von Neuronen freigesetzt und müssen nur den synaptischen Spalt überwinden, um das nächste Neuron der Übertragungskette zu erreichen.

Transportproteine und Rezeptoren der Membran spielen eine bedeutende Rolle bei der Signalübertragung. Die Erstgenannten befördern Nährstoffe in und Abfallstoffe aus der Zelle, dabei findet keine Verstärkung der Signale statt. Bei Signalrezeptoren handelt es sich dagegen um Membranproteine, die hochspezifische Bindungsstellen für von außen ankommende Signalmoleküle (Rezeptorliganden) darstellen.

Nur wenige kleine, hydrophobe Signalmoleküle (beispielsweise Steroid- oder Thyreoidhormone) und einige lösliche Gase wie Stickstoffmonoxid und Kohlenmonoxid können durch die Membran der Zielzelle hindurchdiffundieren, um intrazellulär Rezeptorproteine zu aktivieren. Die meisten extrazellulären Signal- moleküle sind jedoch hydrophil, so dass sie nicht problemlos die lipophile Zellmembran durchdringen können. Sie können nur an der Oberfläche der Zielzelle Rezeptorproteine aktivieren. Ihr Signal muss über diese membranständigen Rezeptoren ins Zellinnere übertragen werden. Der Fachbegriff für dieses Phänomen lautet Signaltransduktion. Die Rezeptorproteine wirken als Signalüberträger, die das extrazelluläre Ereignis der Ligandenbindung, die eine Änderung der Raumstruktur des Rezeptors nach sich zieht, in ein intrazelluläres Signal umwandeln, das das Zellverhalten beeinflusst.

Entsprechend der Signalübertragungsmechanismen lassen sich die Zelloberflächen- rezeptoren in drei große Gruppen unterteilen: Ionenkanal-gekoppelte Rezeptoren, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und katalytische Rezeptoren.

Bei den Ionenkanal-gekoppelten Rezeptoren, die auch als Transmitter-abhängige Ionenkanäle bezeichnet werden, bindet ein Ligand an Proteine des Ionenkanals. Der Kanal wird daraufhin vorübergehend geöffnet oder geschlossen, die Permeabilität der Membran für bestimmte Ionen, beispielsweise Na⁺-, K⁺- oder Cl ^--Ionen, ändert sich.

Da die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu einer Familie homologer Proteine gehören, die die Plasmamembran siebenfach durchspannen, werden sie auch 7-Helix-Rezeptoren genannt. Diese Rezeptoren übertragen mit Hilfe eines trimeren GTP-bindenden Regulatorproteins (G-Protein) Signale auf Effektorproteine (nachgeschaltete Enzyme oder Ionenkanäle). Handelt es sich bei dem aktivierten Zielprotein um ein Enzym, wird die intrazelluläre Konzentration von Mediatoren oder second messenger („zweite Botenstoffe“) geändert. Liegt bei dem Zielprotein ein Ionenkanalprotein vor, kommt es zu einer Veränderung der Ionenpermeabilität der Plasmamembran.

Katalytische Rezeptoren wirken selbst als Enzyme oder sind mit einem Enzym assoziiert. Sie durchspannen die Membran mit nur einer Helix und werden folglich

B. Literaturübersicht

auch 1-Helix-Rezeptoren genannt. Die Bindungsstelle für den Liganden befindet sich außerhalb, das katalytische Zentrum liegt innerhalb der Zelle. Der Signalstoff wird gebunden, es kommt zu einer Dimerisierung des Rezeptors, die eine Aktivierung eines Enzyms nach sich zieht. Im Gegensatz zu den zwei zuerst vorgestellten Rezeptoren handelt es sich bei den enzymgekoppelten Rezeptoren um eine heterogene Gruppe, die sich in fünf Untergruppen unterteilen lässt: Transmembran- Guanylylcyclasen stellen cGMP her. Während Rezeptor-Tyrosinphosphatasen Phosphate von Tyrosin-Resten spezifischer Proteine abspalten, übertragen Transmembran-Rezeptor-Serin/ Threoninkinasen Phosphatgruppen auf Serin- und Threoninseitenketten von Zielproteinen. Am häufigsten treten Rezeptor- Tyrosinkinasen und Tyrosinkinasen-gekoppelte Rezeptoren auf, die vermutlich auf die gleiche Weise arbeiten. Bei ihnen kommt es nach der Ligandenbindung und Dimerisierung des Rezeptors zu der Aktivierung der Kinase, die einen Teil des Rezeptors bildet oder als Nicht-Rezeptorkinase mit diesem assoziiert ist. Die aktivierte Rezeptor-Tyrosinkinase überträgt Phosphatgruppen auf verschiedene Tyrosin-Reste, an die spezifische Proteine über ihre SH2-Domäne binden. Auf diese Weise wird ein Multi-Protein-Signalkomplex aktiviert, von dem sich das Signal im Zellinneren ausbreitet.

Der Oberflächenrezeptor besitzt die Funktion eines Signalverstärkers: Ein Ligandenmolekül bindet an den Rezeptor, durch den geöffneten Kanal können dann viele Ionen hindurchtreten, oder es erfolgt durch die Aktivierung eines Enzyms die Synthese vieler Moleküle eines Botenstoffes.

Im Rahmen der Signaltransduktion spielen zusätzlich innerhalb der Zelle die second messenger eine Rolle. Dabei handelt es sich um intrazelluläre, chemische Signale, deren Konzentration von extrazellulären, über Membranrezeptoren in die Zelle übertragenen Signale streng kontrolliert werden. Zu den wichtigsten Second messenger zählen cAMP (3´,5´-cyclo-Adenosin-monophosphat), cGMP, Ca²⁺, IP3

(Inositol-1,4,5-triphosphat) und DAG (Diacylglycerol).

Das Nukleotid cAMP wird von membrangebundener Adenylatcyclase gebildet. Die Aktivität dieses Botenstoffes wird über G-Proteine gesteuert, meist stimulieren sie die Adenylatcyclase (Typ Gs), einige hemmen sie (Typ Gi). Ca²⁺ und Calmodulin

aktivieren ebenfalls die Adenylatcyclase. Das cAMP stellt einen allosterischen Effektor der Proteinkinase A (PKA) und von Ionenkanälen dar. Die enzymatisch aktivierte PKA kann dann bestimmte Serin- und Threonin-Reste von verschiedenen Proteinen phosphorylieren und damit den Funktionszustand dieser Proteine ändern.

Innerhalb der Zellen herrscht eine geringe cytosolisch freie Ca²⁺-Konzentration, die mit Hilfe von Ca²⁺-ATPasen in der Plasmamembran, ATP-getriebenen Ca²⁺-Pumpen im Endoplasmatischen Retikulum und in der inneren Mitochondrien-Membran sowie Na⁺/ Ca²⁺-Austauscher niedrig gehalten wird, so dass Ca²⁺-Ionen intrazellulär als Signalmolekül genutzt werden können. Da extrazellulär ein hoher Ca²⁺-Spiegel herrscht, besteht an der Plasmamembran ein Konzentrationsgefälle. Kommt es durch ein Signal vorübergehend zu einem Öffnen der Ca²⁺-Kanäle in der Membran, steigt die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration sehr stark an und aktiviert Ca²⁺-abhängige Proteine in der Zelle, u.a. Calmodulin.

Aus dem zweifach phosphorylierten Membranlipid Phosphatidyl-Inositol-bisphosphat (PInsP2) entstehen unter der Enzymwirkung der Phospholipase C (PLC) das hydrophile IP3 und das lipophile DAG. Der erstgenannte Botenstoff wandert zum ER und setzt dort Ca²⁺ aus den Speichern frei, der zweitgenannte bleibt in der Membran, aktiviert die Proteinkinase C (PKC), die dann in Gegenwart von den vom IP3

freigesetzten Ca²⁺ Proteine phosphoryliert und damit den Funktionszustand der Proteine verändert.

Wichtig ist, dass diese verschiedenen Systeme miteinander vernetzt sind und sich gegenseitig beeinflussen. Das Zusammenspiel verschiedener Signalkaskaden ermöglicht der Zelle, die Informationen vieler Signale aufeinander abzustimmen.

Die wesentlichen Aussagen dieses Abschnittes sind ALBERTS et al. (2002) ent- nommen.

3.4.2. Tyrosinphosporylierung bei der Signalübertragung von Zellen

Unter Phosphorylierung versteht man die Übertragung eines Phosphorsäureesters auf organische Verbindungen durch Ester- oder Säureanhydridbildung. Die Konformationsänderung resultiert in einer Aktivierung bzw. Inaktivierung der

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Proteine. In vielen Stoffwechselwegen müssen Metaboliten erst durch Phosphorylierung, die durch Kinasen enzymatisch katalysiert werden, aktiviert werden, bevor sie umgesetzt werden können. Proteinkinasen und -phosphatasen regulieren den Phosphorylierungsstatus. Phosphorylierte Verbindungen sind sehr energiereich. Bei der Proteinphosphorylierung handelt es sich um post-translationale Modifikationen von Proteinen, die es der Zelle erlauben, verschiedene zelluläre Prozesse zu kontrollieren (URNER u. SAKKAS 2003). Die Proteinphosphorylierung und –dephosphorylierung zählt zu den wichtigsten Regulationsmechanismen, die einer Zelle zur Verfügung stehen. Wie bereits im Abschnitt 3.4.1. (Allgemeine Mechanismen der Signalübertragung in Zellen) angedeutet, ist die Tyrosinphos- phorylierung bei verschiedenen Zellen in die Signalübertragung involviert. Da reife Spermien transkriptional inaktiv sind und ihnen die Fähigkeit zur Synthese neuer Proteine fehlt, ist es denkbar, dass reife Spermatozoen im Vergleich zu anderen Zelltypen von diesem Mechanismus der Funktionsänderung in viel größerem Maße abhängig sind (URNER u. SAKKAS 2003). Im nächsten Abschnitt soll die Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung neben anderen Mechanismen bei der Volumen- regulation näher beleuchtet werden.

3.4.3. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Zellen

Zellen antworten auf physiologischen Stress (Han et al. 1994). Sie reagieren auf osmotische Belastungen aus ihrer Umgebung. Verschiedene Mechanismen sind in die damit verbundene Volumenregulation involviert.

BREWSTER et al. (1993) beobachten einen durch die Änderung der extrazellulären Osmolarität aktivierten Signalübertragungsweg schon bei Hefen. Die Autoren vermuten, dass der Anstieg des Turgordruckes durch den Zusammenbruch des osmotischen Gradienten an der Plasmamembran das initiale Signal sein könnte, da die Hefen über mechanosensitive Ionenkanäle in ihrer Membran verfügen.

Bei hypoosmotischer Stimulation werden schnell aktivierte, kompensatorische Cl^-- und K⁺-Ströme diskutiert, die ein übermäßiges Anschwellen der Zelle verhindern und das Ausgangszellvolumen wiederherstellen (OKADA u. HAZAMA 1989,