J. Anhang
1. Rezepturverzeichnis
Alle Chemikalien stammen, soweit nichts anderes angegeben ist, von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim.
1. Medien
1.1. BTS ( Beltsville Thawing Solution)
Glukose 204,9 mMol 37,0 g
Natriumzitrat 20,4 mMol 6,0 g Natriumbikarbonat 15,5 mMol 1,3 g
EDTA 3,5 mMol 1,3 g
Kaliumchlorid 10,7 mMol 0,8 g
A. dest. 1000 ml
pH=7,2 (einstellen mit NaOH/ HCl) Osmolarität 300 ± 5 mosm/kg
1.2. Waschmedium Percoll (Amersham Biosciences AB, Schweden) a. 10fach salines Hepes-Medium
NaCl 8,00 g Hepes 4,77 g Glukose 1,80 g KOH 1M 2,50 ml A.dest. 100,00 ml pH= 7,6 (einstellen mit NaOH/ HCl)
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b. Lösung M
10fach salines Hepes-Medium 10,80 g
A. dest. 100,00 ml
pH= 7,4 (einstellen mit NaOH/ HCl) Osmolarität m ~ 295 mosm/kg
c. Lösung 1+ 9 P
10fach salines Hepes-Medium 5,40 g Percoll, unverdünnt 50,90 g A. dest. 100,00 ml pH= 7,4 (einstellen mit NaOH/ HCl)
Osmolarität dp ~ 350 mosm/kg d. Percoll, unverdünnt
Osmolarität p ~ 15 mosm/kg Rechnung: Oa = (10m + 9p)
R = Oa ( 0,1 x dp) / 0,9 x dp (~ 0,85)
Vp = 10m – 295 / R (295 – p) (~ 11) e. 100%iges Percoll
Lösung 1 + 9 P
Percoll, unverdünnt [(Vp – 9) x 1,130 x 5] g Osmolarität ~ 295 mosm/kg
f. 70%iges Percoll
1/2 100%iges Percoll = V
Lösung M ad V x 100 / 70
Gentamycin (70%iges Percoll / 500) ml g. 35%iges Percoll
1/2 100%iges Percoll = V
Lösung M ad V x 100 / 35
Gentamycin (35%iges Percoll / 500) ml
1.3. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) isoosmotisch
NaCl 137,0 mMol 27,4 ml 0,5 M NaCl Glukose 10,0 mMol 1,80 g
Hepes 20,0 mMol 4,77 g
KOH 2,5 mMol 2,50 ml 1,0 M KOH
A. dest. 1000 ml
pH=7,5 (einstellen mit NaOH) Osmolarität 300 ± 5 mosm/kg
1.4. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) hypoosmotisch
Die Zusammensetzung entspricht der isotonen HBS-Lösung, die Osmolarität wird durch die Veränderung des NaCl-Gehaltes variiert. Von einer NaCl-Lösung 5,30 g/
300 ml wurden 27,4 ml eingesetzt.
pH=7,5 (einstellen mit NaOH) Osmolarität 180 ± 5 mosm/kg
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1.5. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) hyperosmotisch
Die Zusammensetzung entspricht der isotonen HBS-Lösung, die Osmolarität wird durch die Veränderung des NaCl-Gehaltes variiert. Von einer NaCl-Lösung 13,20 g/
300 ml wurden 27,4 ml eingesetzt.
pH=7,5 (einstellen mit NaOH) Osmolarität 450 ± 5 mosm/kg 1.6. Inhibitor-Lösung I
NaF 200 mM 7,50 ml
Hepes 200 mM 0,75 ml
EDTA 200 mM 0,75 ml
PPi 100 mM 1,50 ml
NaCl 500 mM 0,30 ml
A. dest. 2,37 ml
Vanadate 20 mM 1,50 ml
AEBSF 200 mM 150 µl
pAB 200 mM 150 µl
E64 10 mM 30 µl
Die Stammlösungen werden alle mit DMSO hergestellt und in mit Silica-Gel gefüllten Plastiktüten bei –20°C eingefroren. Ausnahme bilden E64, das in A. dest. gelöst wird und Vanadate, das am Tag des Versuches frisch mit A. dest. angesetzt wird.
Die Inhibitor-Lösung wird stets erst am Tag des Versuches angefertigt, AEBSF, pAB und E64 werden erst eine halbe Stunde vor Gebrauch der Inhibitor-Lösung zugesetzt.
Die Inhibitor-Lösung I dient der Blockierung der Reaktion in isoosmotischen und hypoosmotischen Medien.
1.6. Inhibitor-Lösung II
Die Inhibitor-Lösung II dient der Blockierung der Reaktion in hyperosmotischen Medien.
Die Herstellung der Lösung II entspricht daher der Anfertigung der Inhibitor-Lösung I, außer das zum Anpassen der Osmolarität 750 mM NaCl in einer Menge von 2,67 ml zugesetzt und kein A.dest. zugegeben wird.
1.7. Stacking buffer
HCl 5 M 4,80 ml
Tris 2,80 g
TEMED 0,23 ml A.dest. ad 50,00 ml
pH-Wert = 6,7- 6,9 (einstellen mit NaOH/ HCl) 1.8. NRconc.-Lösung
SDS (w/v) 10,0 % 90 µl
Stacking buffer 90 µl
Bromphenolblau 0,5 % 3 µl Saccarose 70,0 % 117 µl 1.9. reduzierter LAP-Puffer
Tris pH 6,8 50 mM SDS (w/v) 2,0 % Glyzerin 10,0 %
Bromphenolblau eine Spatelspitze β-Mercaptoethanol
1.10. BMW-Standard Stock sample buffer
A. dest. 4,8 ml
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Glyzerin 1,0 ml
SDS (w/v) 2,0 ml
Bromphenolblau (w/v) 0,5 ml SDS (reduzierender sample buffer) Stock sample buffer 500 µl β-Mercaptoethanol 25 µl
Stock sample buffer für biotinylierte Standards
A. dest. 4,0 ml
Tris 0,5 M pH 6,8 1,0 ml
Glyzerin 0,8 ml
SDS (w/v) 1,6 ml
Bromphenolblau (w/v) 0,2 ml β-Mercaptoethanol 0,4 ml
Der Standard BMW (nicht biotinyliert oder biotinyliert) wird 1:20 in dem gewünschten Sample buffer verdünnt und bei -20°C eingefroren.
1.11. Elektrodenlauf-Puffer Tris 25 mM Glyzin 192 mM SDS (w/v) 0,1 % 1.12. Blotting-Puffer Glyzin 39 mM Tris 48 mM SDS (w/v) 0,0375 % Methanol (v/v) 20,000 %
1.13. Ponceaurotfärbelösung
Ponceau Rot (Roth, Karlsruhe) 0,5 % Essigsäure 1,0 % 1.14. Maleinsäurepuffer
Maleinsäure 100 mM 5,8 g
NaCl 150 mM 4,3 g
A. dest. ad 500 ml
pH-Wert = 7,5 ( einstellen mit konz. NaOH) Pufferlösung anschließend autoklavieren.
1.15. Blocking-Stammlösung
Blockingreagenz (Boehringer, Mannheim) 10 g
Maleinsäurepuffer 100 ml
Vor dem Gebrauch werden 10 ml der Stammlösung mit einfacher TBS-Lösung auf 100 ml aufgefüllt. Nachdem die Reagenzien bei 50°C im Wasserbad gelöst worden sind, wird die Lösung autoklaviert und dann bei 4°C im Kühlschrank gelagert.
1.16. Coomassie-Färbelösung
Coomassie Brillant Blue R 0,25 %
Methanol 40,00 %
Eisessig 10,00 %
1.17. Entfärbelösung für Coomassie-Färbung
Methanol 20,00 %
Eisessig 10,00 %
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1.18. TBS (Tris buffered saline) (10fach konz.) Tris 50 mM NaCl 150 mM
A. dest. 1000 ml
pH-Wert 7,5 (einstellen mit HCl)
Zur Herstellung von einfacher TBS-Lösung werden 100 ml 10fach konz. TBS mit A. dest. auf 1000ml aufgefüllt.
1.19. TBS + 1%Tween
TBS (1fach) 990,0 ml
Tween 10,0 ml
1.20. Detektionslösung
Tris 100 mM 12,114 g
NaCl 100 mM 5,844 g
A. dest. 1000 ml 1.21. NBT
NBT (Appli Chem GmbH, Darmstadt) 75 mg DMF 700 µl A. dest. 300 µl 1.22. BCIP
BCIP (Appli Chem GmbH, Darmstadt) 50 mg DMF 100 % 1,0 ml
1.23. Detektionslösung + NBT/BCIP Detektionslösung 20 ml
NBT 40 µl
1.24. Propidiumjodid-Stammlösung
Propidiumjodid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) 0,5 mg
A. bidest. 1,0 ml
Die hergestellte PI-Stammlösung wird bis zum Gebrauch in Eppendorfgefäßen bei –20°C lichtgeschützt eingefroren (HARRISON u. VICKERS 1990).
1.25. PBS (Phosphat buffered saline)
NaCl 154,00 mM
Na2HPO4 9,10 mM KH2PO4 2,71 mM
pH-Wert = 7,4 (einstellen mit NaOH / HCl) 1.26. Blockierungslösung
BSA 50,0 %
PBS 50,0 %
Triton 0,1 %
2. Polyacrylamidgele
2.1. 15%iges Trenngel (10 ml)
A. bidest 2,300 ml
30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe) 5,000 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8,8 2,500 ml
10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe) 0,100 ml 10% APS ( Serva, Heidelberg) 0,100 ml
TEMED (Serva, Heidelberg) 0,004 ml
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2.2. 4,5%iges Sammelgel (3 ml)
A. bidest. 2,100 ml
30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe) 0,500 ml
1,0 M Tris/HCl pH 6,8 0,380 ml
10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe) 0,030 ml 10% APS ( Serva, Heidelberg) 0,030 ml
TEMED (Serva, Heidelberg) 0,003 ml
Ammoniumpersulfat und TEMED werden erst nach vierminütiger Behandlung im Ultraschallbad zugefügt, kurz bevor das jeweilige Gel gegossen wird.
2. Messung des pH-Wertes und der Osmolarität
1. Messung des pH-Wertes
Die Messung und Einstellung des pH-Wertes der verwendeten Medien, der definiert ist als der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration, erfolgte mit Hilfe des pH-Meters (microprocessor pH/ION Meter pMX 3000 WTW GmbH) bei gleichzeitiger Überprüfung der Temperatur. Das Gerät muss täglich geeicht werden, dazu werden zwei Pufferlösungen nach DIN 19266 verwendet, z.B.
pH = 9,180 (25°C) und pH = 4,006 (25°C).
2. Messung der Osmolarität
Für die Messung und Einstellung der Osmolarität der verwendeten Medien wurde ein Kryoosmometer (Osmomat 030, Gonotec GmbH) eingesetzt, das nach dem Prinzip der Gefrierpunktserniedrigung funktioniert. Das Gerät verfügt über ein Kühlsystem, in das die Proben mit einem Volumen von 50 µl abgesenkt und auf -6,8°C gekühlt werden. Eine mit Eiskristallen behaftete Edelstahlnadel bewirkt die Kristallisation der Probe. Das Gerät berechnet dann automatisch aus der Kristallisationstemperatur die Osmolarität, da Lösungen mit verschiedenen Salzkonzentrationen verschiedene Gefrierpunkte aufweisen. Die Digitalanzeige zeigt die berechnete Osmolarität in der Einheit osmol/kg an. Vor jedem Gebrauch wird das Gerät mit Hilfe einer NaCl-Eichlösung (Gonotec GmbH) der Osmolarität 300 mosm/kg und A. dest. (0 mosm/kg) kalibriert.
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3. Inhibitoren
Stauroporin
Das Alkaloid Stauroporin (Alexis® Deutschland, Grünberg) wird aus dem Streptomyces staurosporeus isoliert und stellt einen wirksamen Inhibitor verschiedener Proteinkinasen dar. Besonders stark werden CDK2 und Cyclin A gehemmt.
Summen- und Strukturformel: C28H26N4O3
-Lavendustin A
Lavendustin A (Alexis® Deutschland, Grünberg) kann sowohl synthetisch als auch natürlich aus dem Streptomyces griseolavendus gewonnen werden. Es handelt sich bei diesem Stoff v.a. um einen Inhibitor der Tyrosinkinase, außerdem ist ein geringer Einfluss auf die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) und Proteinkinase C (PKC) festzustellen.
Summen- und Strukturformel: C21H19NO6
H-89
H-89 . dihydrochloride (Alexis ® Deutschland, Grünberg)
Bei H-89 ist ein Inhibitor der Proteinkinase A. Dieses Reagenz hemmt wirksam und selektiv cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasen und die Proteinkinase Cµ (PKCµ), die meisten anderen Isotypen der Proteinkinase C werden nur schwach gehemmt.
Summen- und Strukturformel: C20H20BrN3O2S . 2HCl
Bisindolylmaleimide I . hydrochloride
GF-109203X . HCl, Gö 6850 . HCl (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Es handelt sich bei dieser Chemikalie um einen sehr wirksamen Inhibitor der Proteinkinase C (PKC).
Summen- und Strukturformel: C25H24N4O2 . HCl
Okadainsäure
Ocadaic acid (high purity) (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieses aus dem Prorocentrum concavum gewonnene Reagenz ist ein Inhibitor der Proteinphosphatasen 1 und 2A in verschiedenen Zelltypen. Es besteht dagegen kein Einfluss auf die acid Phosphatase, die alkaline Phosphatase sowie die Tyrosinphosphatase.
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Summen- und Strukturformel: C44H68O13
Calyculin A (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser hochspezifische Inhibitor der Proteinphosphatase 1 und 2A wird aus der Discodermia calyx isoliert.
Summen- und Strukturformel: C50H81N4O15P
Papaverin
Papaverine . hydrochloride (Alexis® Deutschland, Grünberg) Papaverin hemmt die Phosphodiesterase.
Summen- und Strukturformel: C20H21NO4 . HCl
Forskolin
Colforsin (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Aus dem Coleus forskohlii wird dieser Aktivator der Adenylatcyclase gewonnen, der einen Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels bewirkt.
Summen- und Srukturformel: C22H34O7
Dedoxy-Forskolin (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieses Reagenz, bei dem es sich um ein biologisch inaktives Analogon des Forskolin dreht, hat keinen Einfluss auf den intrazellulären cAMP-Spiegel und ist als negative Kontrolle eingesetzt worden.
Summen- und Strukturformel: C22H34O7
Tamoxifen
Tamoxifen . citrate (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Tamoxifen ist ein Inhibitor der Chloridkanäle, es wird auch eine Hemmung der Proteinkinase C beschrieben.
Summen- und Strukturformel: C26 H29NO. C6H8O7
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Hydroxytamoxifen
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser Metabolit des Tamoxifen hemmt Cl--Kanäle, es ist außerdem ein Inhibitor der Lipidperoxidase.
Summen- und Strukturformel: C26 H29NO2
Quinin
Quinine . hemisulfate (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) Quinin ist ein Inhibitor der K+-Kanäle.
Summen- und Strukturformel: C20 H24N2O2 . 1/2 H2SO4
Quinidin Syn. Chinidine
Quinidine . sulfate . dihydrate (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)
Bei diesem Reagenz handelt es sich um ein Alkaloid der Chinarinde, das einen Inhibitor der Na+- und K+-Kanäle darstellt. Dieses Stereoisomer des Quinin hemmt Natriumkanäle effektiver als Quinin.
Summen- und Strukturformel: (C20 H24N2O2)2 . H2SO4 . 2H2O
AEBSF
AEBSF . hydrochloride (Alexis ® Deutschland, Grünberg)
Dieses Reagenz hemmt Serinproteasen einschließlich Trypsin, Chymotypsin, Plasmakallikrein und Thrombin irreversibel.
Summen- und Strukturformel: C8 H10FNO2S. HCl
E-64
E-64 (Alexis® Deutschland, Grünberg) wird synthetisch hergestellt. Es stellt einen irreversiblen Inhibitor der Cysteinproteinasen dar, indem es eine Thioetherbindung mit dem Thiol des Cysteins eingeht. Auf Serinproteinasen besteht kein Einfluss.
Summen- und Strukturformel: C15 H27N5O5
Vanadate
Sodium orthovanadate (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser Inhibitor hemmt die ATPase, die alkalische Phosphatase sowie die Tyrosinphosphatase.
Summenformel: Na3.VO4
K. Danksagung
K. Danksagung
Ich möchte mich bei Frau Dr. Dr. E. Töpfer-Petersen für das Überlassen des interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie die nette Betreuung, Korrekturen, viele Anregungen, Gedankenanstöße und freundliche Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit bedanken.
Frau Dr. Dipl.-Phys. A. M. Petrounkina danke ich für die Übernahme der Betreuung der praktischen und statistischen Arbeit.
Herrn Prof. Dr. K. F. Weitze vielen Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes in seinem Labor.
Der Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover bin ich für die finanzielle Unterstützung dieser Dissertation zu besonderem Dank verpflichtet.
Der Frauenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover möchte ich für die finanzielle Unterstützung der Teilnahme an der 36. Jahrestagung Physiologie und Pathologie in Wien danken.
Außerdem danke ich den Mitarbeitern und (Ex-)Doktoranden aus „Werk II“:
Christiane (Christel) Hettel, Dr. Mahnaz (Nasi) Ekhlasi-Hundrieser, Dr. Katrin Gohr, Bianca Oldendorf, Christine Kochel, Dr. Silja Ebeling, Dorothee (Doro) von Witzendorff und Erik Olaf Piehler, die mich so nett in ihrem Kreis aufgenommen haben, jederzeit sehr hilfsbereit waren, mir mit Rat, Tat und hilfreichen Tipps zur Seite standen, immer wieder Membranen begutachteten, die „richtige“ Pipettenspitze BPB für eine „hübsche“ Farbe zufügten, meine Präsentationen begutachteten, Drucker am CASY anschlossen, eifrig Korrektur lasen ...
Recht herzlich danke ich Frau Magret Schäfer für ihr „Schlüssel-Vertrauen“, zahlreiche Durchschreibbüchlein und ihre nette Art.
Danken möchte ich ebenfalls aus „Werk I“ Petra Hasenleder, Inga Reinhardt, Erika Schröder und Christiane Bode für die zahlreichen „Pipettenspitzen-Karton- und Flow-Messgefäß-Spenden“.
Vielen Dank auch meinen „Mitstreitern im Schweinelabor“:
Gabi Volker für den unschlagbaren Teamgeist (EG lässt grüßen), nicht nur bei gemeinsamer Wärmeschrank-Nutzung, optimalem Inkubations-Timing oder gemeinsamen Sheath-Kanister-Schleppen, Zusammenhalt, Zusammenarbeit und zahlreiche Gegenseitig-Mitleid-Spende-Telefonate.
Anke Döhring und Florenzia (Flor) Ardón, die jederzeit die Eberejakulate gewonnen haben. Dr. Frank Magnus und Dr. Katrin Simon für die Einführung im Schweinelabor und den Kurzlehrgang „Nachweis der Tyrosinphosphorylierung“.
Ein besonderes Dankeschön geht an Natalia, die leider viel zu kurz mit uns das Schweinelabor bevölkert hat, bevor sie wieder zu ihren „mings“ nach Moskau zurückgekehrt ist.
Ein herzliches Dankeschön meinen mich liebenden Eltern, die mir immer zur Seite gestanden haben, mir unermüdlich zugehört, mich ermuntert, getröstet, moralisch und auf jede erdenkliche Weise unterstützt, mir stets den Rücken gestärkt und mir das alles ermöglicht haben. Ohne Eure Hilfe hätte ich es nicht geschafft. Vielen Dank für alles!
Mein herzlicher Dank geht an die 1. HÜX-Maus Tissi, die meinen Alltag mit vielen lieben Postkarten, Aufmunterungspäckchen, zahlreichen HL-Abenden mit Quatschen, Pizza-Funghi, ... bis zum Morgengrauen sowie HÜX-Mäuse–Mix erhellt hat, Danke!
Danke Barbara, dass Du immer so geduldig zugehört hast in den zahlreichen kleinen
K. Danksagung
Arbeitsstresses Korrekturlesen und eine schöne gemeinsame Zeit hier – Ruthe sei Dank!
Hannah danke ich herzlich für den sportlichen Ausgleich, nette Abende in Biergarten und Kino. Nicht zu vergessen die hervorragende Betreuung meiner Balkonpflanzen.
Ein herzliches Dankeschön an Wiebke, die so viel Zeit für das so gründliche, spitzenmäßige Korrekturlesen meiner Arbeit geopfert hat und mir noch so diesen oder jenen guten Tipp gab.
Ein Dankeschön auch an meine zwei Lieblingscousins Alex und Thomas, v.a. Alex für die vielen erhörten SOS-Anrufe und telefonische Erste Hilfe, wenn der PC unerklärlicherweise wieder einmal ein Eigenleben entwickelte.
Außerdem möchte ich allen (2- und 4beinigen) holsteinischen Nordlichtern danken, die an mich geglaubt haben und jeder auf seine eigene Art zum Gelingen der Arbeit beigetragen hat. Danke vor allem für die (telefonischen) Ablenkungs-, Aufmunterungs- und Motivationsversuche.
Nicht zu vergessen ein Dankeschön den vierbeinigen, grunzenden Probanden, allen voran Nautilus, Frank, Sven und Ron, die immer bemüht waren, ihr Bestes zu geben.
Tief, tief in unserer Seele
tänzelt das Pferd .... Das Pferd, das Pferd!
Das Sinnbild
der überschäumenden Kraft und der machtvollen Bewegung, der Energie ...
D.H. Lawrence