Entwicklung eines Modells der Signalübertragungsmechanismen bei

Einbeziehung der Phosphorylierung

Die zuvor diskutierten Ergebnisse lassen sich zu einem Arbeitsmodell zusammenfassen.

Abb. 60: Schematische Darstellung der Arbeitshypothese zur Signaltransduktion bei der Osmoregulation porciner Spermatozoen unter Einbeziehung der

Ionenkanäle, Teil A (PP: Phosphatase, Erläuterungen im Text)

Durch den Zusatz von Kanalblockern kann bei Eberspermien der Chloridstrom um 60-80% gesenkt werden. Das ist als Hinweis auf das Vorkommen entsprechender Kanäle zu werten (FORSTREUTER 1997). MORALES et al. (1993) haben bei Spermien des Seeigels das Vorkommen von Ionenkanälen gezeigt, die für den Transport von Cl^--Ionen zuständig sind.

K⁺ Cl^- K⁺ Cl^- Cl

-AMP IZ

PP1

PP2A

Dedoxy-

Forskolin-insensitiv

EZ

Dedoxy- Forsklin-sensitiv

Tamoxifen-sensitiv

E. Diskussion

Aus den diskutierten Versuchsergebnissen ist zu schließen, dass an der Volumenregulation verschiedene Arten von Tamoxifen- und Dedoxy-Forskolin-sensitiven Mechanismen beteiligt sind, bei denen es sich wahrscheinlich ebenfalls um Chloridkanäle handelt, doch auch das Vorkommen von Kaliumkanälen wäre möglich. In die Regulation der Dedoxy-Forskolin-empfindlichen Kanäle ist vermutlich PP1 involviert, dieser Signalweg scheint nicht direkt auf cAMP angewiesen zu sein.

Zusätzlich ist das Vorhandensein Dedoxy-Forskolin-unempfindlicher Cl^-- und K⁺-Kanäle nicht auszuschließen. Dieser Regulationsmechanismus könnte von abhängiger PP2A beeinflusst zu werden oder direkt durch Forskolin-bedingte cAMP-Aktivierung stimuliert werden (s. Abb. 60). Innerhalb dieser Versuche war keine genaue Identifizierung der Chlorid- und Kaliumkanäle vorgenommen worden.

Bei anderen Zelltypen sind verschiedene, an der Volumenregulation beteiligte Ionentransportmechanismen nachgewiesen worden, bei Kardiomyozyten neuge-borener Ratten sind K⁺-und Cl^--Kanäle, K⁺-Cl^--Cotransporter und Na⁺-K⁺-Cl^- -Cotransporter involviert (TAQUIL u. HANNAERT 1999).

SATO et al. (2000) haben bei der Membran von Mäusespermien die elementare Rolle eines Glyzin Rezeptor/ Cl^--Kanals im Rahmen der zonainitiierten Akrosom-reaktion mit Hilfe von Mutanten des Rezeptors herausgefunden.

Diese verschiedenen Transportsysteme für Cl^--Ionen zeigen, dass es wünschenswert wäre, die genauen Mechanismen des Cl^--Transportes bei Eberspermien zu analysieren.

Die vermutete Involvierung von K⁺-Kanälen (KULKARNI et al. 1997) wäre auch in der Volumenregulation der Eberspermien zu klären, da die Effekte von Quinidin und Quinin auf eine eventuelle Beteiligung dieser Ionenkanäle hinweisen. Als Regulator des intrazellulären Kaliumionengehaltes wird v.a. eine Na⁺-/K⁺-ATPase im Rahmen der Kapazitation diskutiert (FRASER 1995), ihre Rolle in der Volumenregulation ist nicht auszuschließen und bedarf der Klärung.

Der in der elektrophoretischen Auftrennung und anschließendem Immunoblot sowie der Durchflusszytometrie erfolgte Nachweis der Tyrosinphosphorylierung und die beschriebenen Einflüsse der Inhibitoren mit Wirkung auf die Volumen-regulationsmechanismen auf die Phosphorylierungsreaktionen führen zu der

Annahme, dass die In-/ Aktivierung der beschriebenen Ionenkanäle von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen gesteuert wird. Die nach-folgende Abb. 61 verdeutlicht diesen zweiten Teil der Arbeitshypothese.

Abb. 61: Schematische Darstellung der Arbeitshypothese zur Signaltransduktion bei der Osmoregulation porciner Spermatozoen unter Einbeziehung der De-/

Phosphorylierungsreaktionen, Teil B (PP: Phosphatase, PKA: nase A, PKC: Proteinkinase C, TK: Tyrosinkinase, Erläuterungen im Text) Es wird nach diesem Teil B des Modells angenommen, dass die Protein-phosphatasen PP2A und PP1 ein oder mehrere Transportkanäle aktivieren, da ihre Hemmung zum Verlust des RVD führt. Eventuell könnte es sich dabei um die beschriebenen K⁺- oder Cl^--Kanäle handeln. Bei der Aktivierung der Kanäle durch die PP2A-bedingte Dephosphorylierung scheint eine cAMP-Abhängigkeit vorzuliegen, da die Zugabe von Papaverin diesen Prozess beeinflusst.

inaktivierte Kanäle aktivierte

Kanäle

P PKC

aktivierte Phosphatase

inaktivierte Phosphatase

TK, PKA PP

E. Diskussion

Da die Hemmung der Proteinkinase C (PKC) zu einem verstärkten Grad des RVD führt, lässt sich annehmen, dass durch die Hemmung die Kanäle länger geöffnet sind. Deshalb scheint PKC in dieses System involviert zu sein, wahrscheinlich schließt sie die durch Proteinphosphatasen aktivierten Kanäle. Die Einschränkung der Volumenregulation könnte auf die Inaktivierung der Proteinphosphatasen durch Tyrosinkinase (TK) und Proteinkinase A (PKA) zurückzuführen sein. Diese Annahme wird durch die Beobachtung bestätigt, dass unter der Hemmung der Kinasen, eine Tendenz zur Beschleunigung des RVD zu beobachten ist. Die Aktivität von PKA wird durch cAMP reguliert, das von der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen beeinflusst wird (URNER u. SAKKAS 2003), ob diese Wechselwirkungen genauso bei der Volumenregulation vorliegen, wäre zu prüfen.

Unter Kapazitationsbedingungen resultiert ein Anstieg des intrazellularen Ca²⁺-Gehaltes in einer Zunahme der Proteintyrosinphosphorylierung (DORVAL et al.

2002). Der Einfluss von Ca²⁺-Ionen wäre somit auch hinsichtlich der Signal-transduktion während der Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen interessant. DORVAL et al. (2003) haben bei kapazitierten Spermien des Mannes den Zusammenhang dieser zwei Ereignisse unter dem Einfluss von Thapsigargin untersucht. Es sind dabei zwei Populationen entdeckt worden: Die eine weist eine hohe Empfindlichkeit auf, die Ca²⁺-Konzentration ist höher, eine stärkere Proteinphosphorylierung ist zu beobachten, es kommen mehr Akrosomreaktionen vor. Diese Population ist als LR (low responsive) bezeichnet worden und von der zweiten Population mit niedriger Ansprechbarkeit unterschieden worden. Unter der Einwirkung eines Tyrosinkinase-Inhibitors wird die Thapsigargin-induzierte Zunahme der Proteintyrosinphosphorylierung verhindert, doch sowohl die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration als auch die akrosomreagierten Spermien bleiben davon unbeeinflußt.

Während der epididymalen Reifung der Spermien spielen Kalzium und HCO3- bei der Modulation der Tyrosinphosphorylierung eine wichtige Rolle. Unter Abwesenheit von Ca²⁺-Ionen im Versuchsmedium zeigen sowohl Spermatozoen des Nebenhoden-kopfes als auch des -schwanzes eine Tyrosinphosphorylierung im Bereich der Geißel als Antwort auf zugefügtes cAMP. In Gegenwart von Ca²⁺-Ionen im umgebenden

Medium ist dagegen nur bei Spermien aus dem Nebenhodenschwanz beim Anstieg der extrazellulären cAMP-Konzentration eine Tyrosinphosphorylierung zu beobach-ten (BAKER et al. 2003).

TARDIF et al. (2003) haben gezeigt, dass Ca²⁺-Ionen für die Tyrosinphos-phorylierung von p32 während der Kapazitation von elementarer Bedeutung ist. Da das in diesen Studien verwendete HBS-Medium kein Ca²⁺ zur Verfügung stellt, ist anzunehmen, dass die Regulationsmechanismen der Tyrosinphosphorylierung bei osmotisch stimulierten Eberspermien sich von denen während der Kapazitation unterscheiden. Der externe Ca²⁺-Gehalt scheint für das RVD nicht notwendig zu sein.

Die Rolle intrazellulärer Ca²⁺-Lager ist damit aber nicht ausgeschlossen und sollte in weiterführenden Studien untersucht werden. Da es sein könnte, dass extrazelluläres Ca²⁺ die Regulation verstärkt, wäre auch dieses noch zu prüfen. Die Rolle von Bikarbonat und Ca²⁺ ist im Rahmen der Regulationsvorgänge der Kapazitations-prozesse schwer zu trennen und möglicherweise besteht ein Zusammenhang zwischen ihnen (TARDIF et al. 2003). Dieser Zusammenhang wäre ein weiterer interessanter Aspekt, der zudem in Bezug auf die involvierten Mechanismen der osmotisch stimulierten Volumenregulation zu beleuchten wäre.

3. Anwendbarkeit der durchflusszytometrischen Untersuchung für