4.2 Methoden
4.2.4 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest
4.2.4.4 Prüfung tumorpromovierend wirksamer Substanzen
Die Prüfung des transformierenden Effekts der tumorpromovierend wirksamen Substanzen Okadasäure, Natriumarsenat und Natriumsaccharin wurde anhand des klassischen Protokolls durchgeführt. Zusätzlich zu den im klassischen Protokoll eingesetzten Behandlungsgruppen (Tabelle 15) wurden die Zellen folgendermaßen behandelt.
Tabelle 16: Behandlungsprotokoll des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests zur Prüfung tumorpromovierend wirksamer Substanzen. MW: Mediumwechsel, TS: Testsubstanz.
Behandlungsgruppen
Tag Phase 1-6 11
0 Einsaat - -
1 Initiation … MCA
4 … MW
8 Promotion … TS
11 … TS
15 … TS
18 … TS
Tag 22-42 Siehe klassisches Protokoll 4.2.4.5 Auswertung
Nach der Trocknung der fixierten und gefärbten Zellen (Kapitel 4.2.1.6) wurden die gebildeten Zellherde (Foci) mit Hilfe eines Stereomikroskops (Olympus Deutschland GmbH, Hamburg) ausgezählt und anhand des von SASAKI et al. (2012b) veröffentlichten Fotokataloges kategorisiert (Abbildung 12). Für die Auswertung werden nur Foci Typ III mit einem Durchmesser von ≥ 3 mm berücksichtigt (REZNIKOFF et al. 1973a; IARC/NCI/EPA WORKING GROUP 1985; SASAKI et al. 2012b). Je nach Ausprägungsgrad der verschiedenen Merkmale wird zwischen Foci Typ I, II oder III unterschieden (Tabelle 17).
Tabelle 17: Unterscheidung der im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest gebildeten Zellherde (Foci).
Ggr.: geringgradig, hgr.: hochgradig (REZNIKOFF et al. 1973a; IARC/NCI/EPA WORKING GROUP 1985; SASAKI et al. 2012b).
Merkmal Foci Typ I Foci Typ II Foci Typ III
Basophile Färbung Schwach Stärker Stark
Wachstum der
Zellen Nur leicht verändert
Dicht, mehrschichtig, ggr. „piling up“ (Zellen wachsen übereinander)
Dicht, mehrschichtig, hgr. „piling up“
Auftreten spindelförmiger Zellen
Keine Wenige Viele
Orientierung der Zellen am Rand des Focus
- -
Kreuz und quer, am Rand des Focus gut zu erkennen („criss crossing“)
Invasives
Wachstum in den Monolayer
- - Ja
In Auswertung Nein Nein Ja, gelten als maligne
transformiert
A B
C
4.2.5 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit metabolisierendem System
Um auch die Substanzen im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest adäquat zu untersuchen, die in vivo zunächst metabolisch aktiviert werden, wurde dem oben beschriebenen Testsystem ein exogenes metabolisierendes System vorgeschaltet. Dieses Aktivierungssystem sollte die initiierend wirksamen Substanzen so verstoffwechseln, dass ihre Metabolite im Testverfahren ihre vollständige transformierende Wirkung entfalten.
4.2.5.1 S9-Mix
Es wurde S9 der Firma Biopredic International (Rennes, Frankreich) und der Firma Trinova Biochem GmbH (Gießen) getestet. Um die Aktivität fremdstoffmetabolisierenden Enzyme im S9 zu erhöhen, wurden die Tiere, die zur Gewinnung des S9 eingesetzt wurden, vorher mit Aroclor 1254 (Trinova Biochem GmbH) bzw. Phenobarbital und β-Naphthoflavon (Biopredic International) behandelt.
Der S9-Mix besteht aus S9 (5 oder 10 %-ig) und BALB/c-3T3-Zellkulturmedium (Zusammensetzung: Tabelle 6), das nach einem Protokoll von ASADA et al. (2005) mit den
Abbildung 12: Merkmale eines Focus Typ III:
A) Starke basophile Färbung B) Spindelförmige Zellen (Pfeile)
C) Criss-crossing, besonders am Rand des Focus zu erkennen (Pfeile)
folgenden Zusätzen angereichert wurde: 5 mM MgCl2, 33 mM KCl, 5 mM Glucose-6-Phosphat, 4 mM β-NADP+, 2 mM HEPES. Dem S9-Mix der Firma Biopredic International wurde zusätzlich 0,6 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase hinzugefügt.
Zusätzlich zu den im klassischen Protokoll eingesetzten Behandlungsgruppen (Tabelle 15) wurden die Zellen folgendermaßen behandelt:
Tabelle 18: Behandlungsprotokoll des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests zur Prüfung von Prokanzerogenen mit S9-Mix als metabolisierendes Aktivierungssystem. Mix: Medium mit Zusätzen, aber ohne S9, MW: Mediumwechsel, TS: Testsubstanz.
Behandlungsgruppen
Tag 22-42 Siehe klassisches Protokoll
Behandlung der Zellen an Tag 1 des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests:
(1) Die Zusätze wurden in den oben genannten Konzentrationen in einem Becherglas unter Rühren direkt im erwärmten Zellkulturmedium gelöst. Im Anschluss wurde der pH-Wert auf 7,4 (pH-Meter Lab 850, Schott AG, Mainz) eingestellt und der Mediummix steril filtriert.
(2) Pro Behandlungsgruppe wurden nun die aufgetauten Stammlösungen jeder Testsubstanzkonzentration in einem Verhältnis von 1:1.000 mit dem zuvor angesetzten Mediummix verdünnt, welches zuvor in einem 15 ml-Zellkulturröhrchen vorgelegt wurde. In den Kontrollgruppen wurde das ursprüngliche Zellkulturmedium verwendet.
(3) Das S9 wurde schonend aufgetaut und bis zu seiner Verwendung auf Eis gelagert. Der Proteingehalt wurde durch Verdünnen mit Mediummix auf ca. 20 mg/ml eingestellt. Das
S9 der Firma Biopredic International (Rennes, Frankreich) wurde unverdünnt verwendet, da der Proteingehalt bei 21 mg/ml lag.
(4) Es erfolgte die Behandlung der Zellen mit den Testsubstanzen. Danach wurde in jedes der Wells einzeln die entsprechende Menge S9 (5 oder 10 % in 2 ml Mediummix) pipettiert. Erst im Anschluss daran wurden die Kontrollzellen behandelt.
(5) Die Zellkulturtestplatten wurden im Brutschrank gelagert.
(6) Nach drei Stunden wurden die Zellen, die mit den Testsubstanzen und S9-Mix inkubiert wurden, einmal mit PBS gewaschen und wieder mit frischem Zellkulturmedium versehen.
(7) An Tag 4 erfolgte ein Mediumwechsel. Die weitere Behandlung der Zellen verlief nach dem klassischen Protokoll des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests.
4.2.5.2 Zelllinie HepaRG®
Der Versuch, die Zelllinie HepaRG® als metabolisierendes Aktivierungssystem in den BALB/c-3T3-Zelltransformationstest zu integrieren, wurde auf zwei verschiedenen Wegen unternommen:
1) Übertragung des Mediumüberstandes der HepaRG®-Zellen auf die BALB/c/3T3-Zellen
diff.
Abbildung 13: Schematische Darstellung des Behandlungsablaufs für die Prüfung von AFB1 im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit ausdifferenzierten (diff.) HepaRG®-Zellen als metabolisierendes System.
Die HepaRG®-Zellen wurden ca. fünf Wochen vor Versuchsbeginn in 6-Well-Zellkulturtestplatten eingesät (200.000 Zellen/Well) und solange kultiviert, bis sie vollständig ausdifferenziert waren (Kapitel 4.2.1.3). Um die Zellpopulation zu synchronisieren, wurden
die Zellen 24 Std. vor Versuchsbeginn mit FBS-freiem Differenzierungsmedium versorgt.
Das Verdünnen der Testsubstanz und die Behandlung der HepaRG®-Zellen erfolgte wie für die BALB/c-Zellen beschrieben. Jedoch wurde das AFB1 (Konz. 0,1-10 µM) in FBS- und DMSO-freiem Differenzierungsmedium verdünnt. Zeitgleich mit der 24 Std.-Behandlung der HepaRG®-Zellen wurden in weiteren 6-Well-Zellkulturtestplatten BALB/c-3T3-Zellen (5.000 Zellen/Well) eingesät. Dabei wurden ausreichend Zellkulturtestplatten eingesät, um im gleichen Testverlauf einen BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ohne metabolische Aktivierung des AFB1 als Kontrolle durchführen zu können. Die unterschiedlichen Behandlungszeiten wurden so begonnen, dass die Übertragung des Mediumüberstandes zu einem Zeitpunkt (Tag 1 des BALB/c-3T3- Zelltransformationstests) stattfand (siehe Abbildung 14). Die BALB/c-3T3-Zellen wurden über 72 Std. mit dem Mediumüberstand inkubiert, dem zusätzlich noch 1 ml BALB/c-Medium hinzugefügt wurde. Im Anschluss wurden sie nach dem klassischen Protokoll des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests weiter behandelt.
Behandlung der HepaRG®-Zellen Klassischer BALB/c-3T3-Zelltransformationstest
Initiationsphase
Behandlung der HepaRG®-Zellen Klassischer BALB/c-3T3-Zelltransformationstest
Initiationsphase Promotionsphase
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
Abbildung 14: Behandlungsschema für die Übertragung des Mediumüberstandes der HepaRG®-Zellen nach der Behandlung mit AFB1.
2) Verwendung eines Transwell-Systems
Das Transwell-System macht die Kokultivierung zweier Zelllinien möglich. Durch eine semipermeable Membran wird das System mittels eines Einsatzes (insert) in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilt. Dieser Versuchsaufbau erfolgte unter Verwendung eines 12-Well-Formates. Auch hier wurde das Prokanzerogen AFB1 in den Konzentrationen
0,1-10 µM getestet. Die 12-Well-Transwell-Systeme (Corning Incorporated, U.S.A) wiesen einen Membrandurchmesser von 12 mm, eine Porengröße von 0,4 µm und eine Wachstumsfläche von 1,12 cm2 auf.
Die HepaRG®-Zellen wurden ca. fünf Wochen vor Versuchsbeginn mit 32.500 Zellen pro insert eingesät. Zu Versuchsbeginn (Tag 0) wurden die BALB/c-3T3-Zellen in die 12-Well-Zellkulturtestplatten eingesät (2.055 Zellen/Well). 24 Std. später (Tag 1) erfolgte die
„Behandlung“ der Zellen, indem die inserts mit den HepaRG®-Zellen über die eingesäten BALB/c-3T3-Zellen gesetzt wurden. Wie in Abbildung 15 schematisch dargestellt, wurden nun die in FBS- und DMSO-freiem Differenzierungsmedium verdünnten Testsubstanzen auf die HepaRG®-Zellen gegeben. Das Zellkulturmedium der BALB/c-3T3-Zellen im unteren Kompartiment des Transwell-Systems wurde nicht erneuert. Nach einer Inkubationszeit von 72 Std. wurde das insert mit den HepaRG®-Zellen verworfen und das Zellkulturmedium der Zellen erneuert. Es wurde wie im klassischen Protokoll des Zelltransformationstest fortgefahren. Als Kontrolle wurden parallel BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne eine metabolische Aktivierung der Testsubstanz im 12-Well-Format durchgeführt.
Abbildung 15: Schematische Darstellung des Behandlungsablaufs für die Testung von AFB1 im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit der Zelllinie HepaRG® als metabolisierendes Aktivierungssystem. Die HepaRG®-Zellen werden mit den BALB/c-Zellen im Transwell-System kokultiviert und nach der Initiationsphase (72 Std.) entfernt.
4.2.6 Weichagar-Koloniebildungstest
Der in dieser Arbeit durchgeführte Weichagar-Koloniebildungstest basiert auf einem Protokoll von MACPHERSON u. MONTAGNIER (1964).
4.2.6.1 Durchführung
(1) Die Agarose (LMP, Preparative Grade for Small Fragments, Promega Corporation, U.S.A.) wurde ca. zwei Tage vor Versuchsbeginn in einem sterilen 50 ml-Zellkulturröhrchen abgewogen, mit dH2O vermischt und bei 60 °C in einem Trockenschrank zum Schmelzen gelagert.
Ausgangskonzentration Bodenagar: 5 %
Ausgangskonzentration Topagar: 1,5 %
(2) Die 12-Well-Zellkulturtestplatten wurden am Versuchstag mit einem Kreuz auf der Unterseite jedes Wells versehen, um die spätere Auszählung der Kolonien zu vereinfachen.
(3) Zunächst wurde jedes Well mit Bodenagar belegt (Volumina: Tabelle 19), welcher zuvor mit dem entsprechenden Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 1 % verdünnt wurde. Um den Bodenagar während der Versuchsdurchführung flüssig zu halten, wurde er in einem Wasserbad bei ca. 60 °C aufbewahrt. Nach der Belegung wurden die Zellkulturplatten an die Seite gestellt, um den Bodenagar aushärten zu lassen.
(4) Nun wurden die Zellen in die Zellsuspension überführt, gezählt und mit dem Topagar, der zuvor mit dem entsprechenden Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 0,5 % verdünnt wurde, vermischt (Zellzahlen und Volumina: Tabelle 19). Dabei wurde darauf geachtet, dass der Topagar eine Temperatur von ca. 40 °C nicht überschritt. Jeder Ansatz wurde im Triplikat durchgeführt. Aus dieser Mischung wurde zügig das benötigte Volumen auf den Bodenagar eines jeden Wells gegeben.
(5) In jedem Versuch wurde eine Leerkontrolle (enthielt keine Zellen), eine Negativ- und eine Positivkontrolle mitgeführt. Unbehandelte BALB/c-3T3-Zellen dienten als Negativkontrolle, da sie nicht anheftungsunabhängig wachsen können. Als Positivkontrolle wurden D-GBM-Zellen verwendet aufwiesen. Die eingesäten Zellzahlen sind aus Tabelle 19 zu entnehmen.
(6) Die Zellkulturtestplatten wurden für sieben bzw. 14 Tage bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank gelagert.
(7) Wurde der Weichagar-Koloniebildungstest im 12-Well-Format durchgeführt, wurde nach einer Woche 160 µl frisches Zellkulturmedium auf den Topagar gegeben.
4.2.6.2 Auswertung
(8) Die Auswertung des Weichagar-Koloniebildungstests im 12-Well-Format erfolgte nach 14 Tagen. Die Kolonien wurden zunächst mit 400 µl Kristallviolett-Lösung (KV, 0,005 %) gefärbt. Nach ca. einer Stunde war die KV-Lösung ausreichend in die Agarose diffundiert und die Kolonien unter dem Lichtmikroskop (Nikon GmbH, Düsseldorf) gut sichtbar. Gezählt wurden nur Kolonien, die einen Durchmesser von ≥ 50 µm aufwiesen (VAN ZOGGEL et al. 2012). Die Kolonien wurden bei zweifacher Vergrößerung und in der Durchlicht-Einstellung ausgezählt und die Koloniebildungseffizienz (%) mit folgender Formel berechnet:
(9) Die Auswertung des Weichagar-Koloniebildungstests im 96-Well-Format erfolgte nach sieben Tagen mit Hilfe des Alamar Blue®-Tests. Durch die Reduktion des kaum fluoreszierenden Resazurins zum stark fluoreszierenden Resorufin kann mit diesem Test die Viabilität von Zellen ermittelt werden. Die Resazurin-Lösung wurde 10 %ig (20 µl auf 200 µl Agarvolumen im Well) unter Lichtausschluss in die einzelnen zu messenden Wells gegeben. Nach drei Std. Inkubationszeit im Brutschrank erfolgte die Fluoreszenzmessung (Emissionswellenlänge 531 nm und Exzitationswellenlänge 615 nm) mittels eines Plattenlesegerätes (Infinite® M200, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim). Die Messdaten wurden um die Leerkontrolle (enthielt keine Zellen) korrigiert und aus dem Triplikat ein Mittelwert gebildet. Die Mittelwerte der Fluoreszenzeinheiten (FE) wurden dann im Verhältnis zur Zellzahl in einem Säulendiagramm aufgetragen.
Tabelle 19: Unterschiede zwischen 12-Well- und 96-Well-Format in der Versuchsdurchführung des Weichagar-Koloniebildungstests.
Format 12-Well 96-Well
Agarvolumen Boden (µl) 400 100
Agarvolumen Top (µl) 800 100
Einsaat (Zellen/Well) 500 100-5.000
Wachstum im Weichagar (Tage)
14 7
Auswertung Mikroskopisch nach KV-Färbung
(Kolonie = ≥ 50 µm)
Fluorimetrische Messung mittels Alamar Blue®
4.2.7 Kombination beider Testsysteme
Um innerhalb einer Versuchsdurchführung mehr als einen biologischen Endpunkt bestimmen zu können, sollten der BALB/c-3T3-Zelltransformationstest und der Weichagar-Koloniebildungstest kombiniert werden. Dabei sollte Ersterer so weit wie möglich verkürzt und die so erhaltenen transformierten Zellen in Letzteren überführt werden (Abbildung 16). In jedem Testsystem wurde per se mit Triplikaten gearbeitet.
0 1 2 3 4 5 6 Wochen
Abbildung 16: Schematische Darstellung der Kombination beider In-vitro-Testsysteme.
Zur Etablierung des kombinierten Protokolls wurden unterschiedliche Strategien ausgetestet, die transformierten Zellen aus dem BALB/c-3T3-Zelltransformationstest in den Weichagar-Koloniebildungstest zu überführen. Das Abschaben der mit dem bloßen Auge in Form von Zellherden (Foci) erkennbaren transformierten Zellen mit Hilfe einer Pipettenspitze oder das selektive Ablösen der Zellherde mittels Klonierungsringen wurde aufgrund von
Vitalitätsverlusten der Zellen und der schwierigen technischen Durchführung als nicht geeignet erachtet. Dahingegen erwies sich die Ablösung sämtlicher transformierter und nicht transformierter Zellen innerhalb eines Wells, welches sichtbare Zellherde aufwies, mittels Trypsin/EDTA hinsichtlich der Vitalität der Zellen, der Koloniebildung und der technischen Handhabung als besser geeignet, so dass diese Art der Übertragung gewählt wurde. Eine weitere Variation, die im Vorfeld überprüft wurde, war die Möglichkeit, die transformierten Zellen über mehrere Passagen zu kultivieren, bevor sie in den Weichagar-Koloniebildungstest eingesät wurden. Auch diese Variation wurde verworfen, da dies sowohl zu einem geringeren Koloniebildungsvermögen führte als auch die Dauer des kombinierten Testsystems erheblich verlängerte. Folgendes Protokoll wurde schlussendlich durchgeführt:
(1) Wie in Abbildung 16 schematisch dargestellt wurden die BALB/c-3T3-Zellen zunächst mit den Testsubstanzen behandelt. Dabei erfolgte die Inkubation der Zellen mit den Tumorpromotoren wie im klassischen BALB/c-3T3-Zelltransformationstest (Kapitel 4.2.4.4), während im Fall der AFB1-Behandlung der Zellen das mit S9-Mix erweiterte Protokoll verwendet wurde (Kapitel 4.2.5.1).
(2) An Tag 28-30 (Tumorpromotoren) bzw. an Tag 22 (AFB1) wurden die transformierten Zellen mittels Trypsin/EDTA abgelöst. Die Transformation war bereits durch eine anfängliche Focibildung sichtbar. Dabei wurden die drei Wells einer Behandlungsgruppe (Triplikat) zu einer Probe zusammengefügt.
(3) Die Zellen einer Behandlungsgruppe (jetzt eine Probe) wurden gezählt und in der entsprechenden Zellzahl erneut in einem Dreifachansatz in den Weichagar-Koloniebildungstest eingesät.
(4) Es folgte die in Kapitel 4.2.6.1 beschriebene Durchführung des Weichagar-Koloniebildungstests in den verschiedenen Formaten.
4.2.8 Statistische Analyse
Eine statistische Auswertung wurde nur bei Experimenten vorgenommen, die mindestens vier Mal wiederholt wurden (n ≥ 4).
Die Datenerfassung sowie die Ermittlung des arithmetischen Mittelwertes der Daten erfolgten mit Microsoft Office Excel 2003 für Windows XP. Die Normalverteilung der Daten wurde
mit Hilfe der Software IBM SPSS Statistics Version 20 getestet. Anhand des Shapiro-Wilk-Tests wurde die Hypothese, dass die Daten normal verteilt sind, überprüft. Wurde dabei der kritische Wert (p = 0,05) überschritten, waren die Daten normal verteilt. Als nicht normal verteilt wurden die Daten bewertet, wenn der Signifikanzwert unter diesem kritischen Wert lag.
Die weiterführende statistische Analyse wurde anhand des Programms Graph Pad Prism Version 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, U.S.A.) durchgeführt. Waren die Daten normal verteilt, wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) zum Vergleich der arithmetischen Mittelwerte mit anschließendem Dunnett-Post hoc-Test vorgenommen. Bei einem nicht normal verteilten Datensatz wurde der Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Dunn-Post hoc-Test angewendet. Das Signifikanzniveau wurde stets auf p = 0,05 festgelegt.
Zum Vergleich der Daten aus dem BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit S9 als metabolisierendem System und ohne eine metabolische Aktivierung wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Bonferroni-Post hoc-Test (p = 0,05) durchgeführt. Die zu berücksichtigenden Einflussvariablen waren die Behandlung der Zellen mit den verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen und das Vorhandensein eines metabolisierenden Systems.
5 Ergebnisse
5.1 Prüfung genotoxischer Substanzen
5.1.1 Klassisches Protokoll ohne metabolische Aktivierung
Zunächst werden die Ergebnisse des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests für die initiierend wirksamen Testsubstanzen (B[a]P, AFB1 und DMN) dargestellt (Abbildung 17). Um den geeigneten Behandlungszeitpunkt der Zellen innerhalb der Initiationsphase zu ermitteln, wurde zunächst je ein Plattierungseffizienztest durchgeführt, in dem die Zellen entweder an Tag 1, an Tag 1 und 2, an Tag 1, 2 und 3 oder an Tag 1 und 3 für jeweils 3 Std.
mit der jeweiligen Testsubstanz inkubiert wurden (Abbildung 37 im Anhang). Es konnten keine Unterschiede im relativen Koloniebildungsvermögen festgestellt werden, so dass die dreistündige Behandlung der Zellen an Tag 1 ausgewählt wurde.
Im Abbildung 17 sind die Ergebnisse der BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne eine metabolische Aktivierung der Testsubstanzen dargestellt.
Abbildung 17: Ergebnisse des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne metabolische Aktivierung der Prokanzerogene B[a]P (A), AFB1 (B) und DMN (C). Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Aufgrund nicht normal verteilter Datensätze wurde für jede Testsubstanz der Kruskal-Wallis-Test mit Dunn Post-hoc Test (vs. Lösungsmittelkontrolle) durchgeführt; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.
Lösungsmittelkontrolle: 0,1 % DMSO bzw. 0,1 % H2O; Positivkontrolle: MCA + TPA, Konz.:
Konzentration.
Aus allen drei Graphen der Abbildung 17 wird deutlich, dass die BALB/c-3T3-Zellen, die mit den Lösungsmitteln DMSO oder dH2O behandelt wurden, nur eine sehr geringe Bildung von Foci Typ III pro Well zeigen. Im Vergleich dazu weist die Positivkontrolle, in der die Zellen mit MCA (Initiationsphase) und TPA (Promotionsphase) behandelt wurden, einen signifikanten Anstieg der Anzahl der gebildeten Foci Typ III pro Well auf. Des Weiteren lässt sich im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle mit steigender Konzentration der Testsubstanzen eine verstärkte Focibildung erkennen. Dieser Effekt ist jedoch nicht
dosisabhängig. Das B[a]P (Abbildung 17 A) zeigt in den Konzentrationen 0,01, 5, 20 und 40 µM in Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle einen tendenziell dosisabhängigen signifikanten Anstieg der Anzahl der gebildeten Foci Typ III pro Well. AFB1 und DMN (Abbildung 17 B und C) präsentieren ein ähnliches Bild, jedoch mit schwächeren und nicht dosisabhängigen Effekten auf die Zielzellen und damit einer geringeren Anzahl gebildeter Foci Typ III pro Well.
Die in jedem Test mitgeführten Kontrollen sind in einer gesonderten Abbildung dargestellt (Abbildung 18). In einer ersten Testreihe wurden die Konzentrationsbereiche 0,1-5 µM im Fall des B[a]P und 0,1-2 µM im Fall des AFB1 sowie in einer zweiten Testreihe die Konzentrationen 10-500 µM (ohne 250 µM) im Fall des DMN untersucht. Alle weiteren Konzentrationen der Testsubstanzen wurden in einer dritten Versuchsreihe getestet. Daraus resultieren die hohen Stichprobenzahlen der Kontrollsubstanzen.
Abbildung 18: Mittelwerte mit Standardabweichung der Daten der Kontrollgruppen aus insgesamt 15 unabhängig voneinander durchgeführten BALB/c-3T3-Zelltransformationstests. DMSO und H2O: n = 10, MCA, TPA, MCA + TPA: n = 15. Eine gesonderte statistische Analyse wurde hier nicht vorgenommen.
In Abbildung 18 ist wiederholt der geringe Effekt der Lösungsmittel DMSO und dH2O auf die Focibildung der BALB/c-3T3-Zellen zu beobachten. Die Behandlung der Zellen mit MCA über die gesamte Testdauer hinweg (Initiations- und Promotionsphase) weist eine Anzahl gebildeter Foci Typ III pro Well von durchschnittlich eins auf. Werden die Zielzellen über die gesamte Testdauer hinweg mit TPA exponiert, liegt die Anzahl gebildeter Foci Typ III pro
Well bei durchschnittlich 2,4. Die als Positivkontrolle angesehene kombinierte Behandlung der BALB/c-3T3-Zellen mit MCA und TPA zeigt, wie bereits in Abbildung 17 beschrieben, mit durchschnittlich 4 Foci Typ III pro Well einen starken Anstieg der Anzahl gebildeter Foci.
Um mögliche zytotoxischen Effekte auf die Zielzellen zu prüfen, wurden parallel zu den BALB/c-3T3-Zelltransformationstests Plattierungseffizienztests durchgeführt (Abbildung 19).
Dabei wird jeweils die relative Koloniebildungseffizienz (KBE) in % der Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) angegeben.
Abbildung 19: Ergebnisse der Plattierungseffizienztests ohne metabolische Aktivierung der Prokanzerogene B[a]P (A), AFB1 (B) und DMN (C). Für B[a]P und DMN, inkl. Kontrollen, sind die Mittelwerte mit Standardabweichung aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen dargestellt. Aufgrund nicht normal verteilter Datensätze für B[a]P (0,001-1 µM) und DMN (0,1-100 µM) wurde für jede Testsubstanz der Kruskal-Wallis-Test mit Dunn Post-hoc Test (vs.
Lösungsmittelkontrolle) durchgeführt; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Für AFB1, B[a]P in den Konz. 5-40 µM und DMN in den Konz. 250-500 µM sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen dargestellt. Aufgrund der geringen Stichprobenzahl wurde hier keine statistische Analyse vorgenommen. Lösungsmittelkontrolle: 0,1 % DMSO bzw. 0,1 % H2O, Positivkontrolle: MCA + TPA, Konz.: Konzentration.
Der Tumorinitiator MCA ruft zytotoxische Effekte hervor, die, wie die Daten für DMN (Abbildung 19 C) erkennen lassen, bis zu 50 % der Zellen betreffen und signifikant sind. Die tumorpromovierend wirksame Substanz TPA hingegen weist in sämtlichen Graphen der Abbildung 19 keine Zytotoxizität auf. Die Kombination MCA und TPA zeigt wiederum deutlich erkennbare zytotoxische Effekte, die im Fall des DMN (C) bezogen auf die Lösungsmittelkontrolle dH2O signifikant sind. Die Testsubstanz B[a]P (Abbildung 19 A) zeigt eine dosisabhängige Abnahme der relativen KBE, die sich bei einer Konzentration von 1 µM in einer signifikanten Reduzierung der Zellviabilität widerspiegelt. Für die Konzentrationen 5-40 µM wurde keine statistische Analyse durchgeführt, da die Stichprobenzahl mit drei durchgeführten Versuchen zu gering war. Für AFB1 und DMN (Abbildung 19 B und C) konnten keine dosisabhängigen Effekte beobachtet werden. AFB1 (B) zeigte ohne eine metabolische Aktivierung in drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen nur eine sehr geringe Zytotoxizität. Die zytotoxische Wirkung von DMN (C) auf die Zellen war tendenziell ausgeprägter, was sich signifikant in einer bis zu 30 % geringeren relativen KBE bei 10 µM darstellt.
5.1.2 Erweitertes Protokoll mit metabolischer Aktivierung
5.1.2.1 S9-Mix
Zunächst wurde die Zytotoxizität des S9 in verschiedenen Plattierungseffizienztests untersucht. Die Prüfung von 0-10 % S9 der Firma Biopredic International (Proteingehalt 21 mg/ml) ergab für sämtliche Konzentrationen eine relative KBE, die mit jener der Negativkontrolle (= 100 %) vergleichbar war (Abbildung 38 im Anhang). Der Vergleich der Zytotoxizität der verschiedenen Leberhomogenate mit einer Konzentration von 10 % S9 und den Konzentrationen der Testsubstanzen von 0,1-5 µM B[a]P bzw. 0,1-2 µM AFB1 ergab keine Unterschiede (Abbildung 39 im Anhang). Auf der Grundlage dieser Vortests wurde im Folgenden mit den Konzentrationen von 5 % und 10 % S9 beider Firmen weitergearbeitet.
5.1.2.1.1 Erweitertes Protokoll
Auch ein Vergleich der Daten aus BALB/c-3T3-Zelltransformationstests, in denen die Zellen mit 5 und 10 % S9 sowie mit den unterschiedlich induzierten Leberhomogenaten beider Firmen behandelt wurden, konnte kein Unterschied in der Focibildung festgestellt werden (Abbildung 40 im Anhang). Aufgrund dessen wurde der BALB/c-3T3-Zelltransformationstest im weiteren Verlauf der Arbeit nur mit einer 5 %-igen S9-Konzentration durchgeführt.
In Abbildung 20 sind die Ergebnisse der BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne und
In Abbildung 20 sind die Ergebnisse der BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne und