Entwicklung eines In-vitro-Testsystems zur Prüfung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Maria Daniela Brauneis
Offenbach/Main
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Pablo Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg 2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 10. April 2014
Gefördert durch die Stiftung SET und die Döhrenkamp-Zbinden-Stiftung.
Sei Du selbst die Veränderung, die Du Dir wünschst für die Welt.
Mahatma Gandhi
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert:
Abstracts für Poster:
Brauneis M, Oortgiese S, Steinberg P. Optimization of the BALB/c-3T3 cell transformation assay by coupling a drug metabolizing system. 78. Jahrestagung der DGPT, 19.-22. März 2012, Dresden
Brauneis M, Oortgiese S, Steinberg P. Coupling of a drug metabolizing system to the BALB/c-3T3 cell transformation assay. 14th Annual Congress of EUSAAT, 5.-8. Sept. 2012, Linz, Österreich
Brauneis M, Steinberg P. Coupling of the BALB/c-3T3 cell transformation assay to a metabolic activation system and to the soft agar colony formation assay: determination of two endpoints in a single in vitro test system. 15th Annual Congress of EUSAAT, 16.-18. Sept.
2013, Linz, Österreich Abstracts für Vorträge:
Brauneis M, Oortgiese S, Steinberg P. Erste Arbeiten zur Weiterentwicklung des BALB/c- 3T3-Zelltransformationstests unter Verwendung verschiedener metabolisierender Systeme. 21.
VETPHARM-Symposium, 30. Sept. 2011, Leipzig
Brauneis M, Oortgiese S, Steinberg P. Coupling of the BALB/c-3T3 cell transformation assay with a drug metabolizing system. 2nd Symposium on the Replacement, Reduction and Refinement of Animal Experiments, 19. März 2012, Hannover
Brauneis M, Steinberg P. Kopplung des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests an ein metabolisierendes System. 22. VETPHARM-Symposium, 13. Sept. 2012, Wien
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... I Abkürzungsverzeichnis ... VI
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Chemikaliensicherheit und Stoffprüfung unter REACH ... 3
2.2 Kanzerogenese in vivo und in vitro ... 5
2.2.1 Mehrstufenmodell der Kanzerogenese ... 6
2.2.2 Biotransformation von Fremdstoffen ... 9
2.2.2.1 Phase-I-Reaktionen ... 9
2.2.2.2 Phase-II-Reaktionen ... 12
2.2.3 Chemische Kanzerogene ... 13
2.2.4 Wirkungsmechanismen genotoxischer Kanzerogene ... 13
2.2.4.1 Aflatoxin B1 ... 14
2.2.4.2 Benzo[a]pyren ... 15
2.2.4.3 Dimethylnitrosamin ... 17
2.2.5 Wirkungsmechanismen nicht-genotoxischer Kanzerogene ... 18
2.2.5.1 Okadasäure und 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat ... 19
2.2.5.2 Natriumarsenat ... 20
2.2.5.3 Natriumsaccharin ... 21
2.3 Alternativmethoden zum Tierversuch ... 22
2.3.1 Gesetzliche Vorgaben ... 23
2.3.2 Das 3R-Konzept ... 23
2.3.3 Kanzerogenitätsprüfung von Chemikalien ... 26
2.3.4 In-vitro-Methoden zur Kanzerogenitätsprüfung von Chemikalien ... 27
2.3.5 Zelltransformationssysteme ... 28
2.3.6 Der BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ... 31
2.3.7 Biotransformationssysteme ... 34
2.3.7.1 Subzelluläre Fraktionen aus Lebergewebe ... 35
2.3.7.2 Humane hepatische Zelllinien ... 36
2.3.8 Der Weichagar-Koloniebildungstest ... 38
3 Ziele der Arbeit ... 39
4 Material und Methoden ... 40
4.1 Material ... 40
4.1.1 Zelllinien ... 40
4.1.1.1 BALB/c-3T3-A31-1-1 (HRI) ... 40
4.1.1.2 HepaRG® ... 40
4.1.1.3 D-GBM ... 41
4.1.2 Zellkulturmedien und -zusätze ... 41
4.1.2.1 Auflistung verwendeter Zellkulturmedien und -zusätze ... 41
4.1.2.2 Zusammensetzung verwendeter Zellkulturmedien und Lösungen ... 42
4.1.3 Leberhomogenate ... 43
4.1.4 Test- und Kontrollsubstanzen ... 43
4.1.4.1 Tumorinitiatoren und Tumorpromotoren ... 43
4.1.4.2 Kontrollsubstanzen ... 43
4.1.5 Weitere Chemikalien und Lösungen ... 44
4.1.6 Verbrauchsmaterialien ... 44
4.1.7 Geräte und Hilfsmittel ... 45
4.2 Methoden ... 46
4.2.1 Allgemeine Zellkultur ... 46
4.2.1.1 Ansetzen der Medien ... 46
4.2.1.2 Auftauen der Zellen ... 47
4.2.1.3 Subkultivierung und Kultivierung der Zellen ... 47
4.2.1.4 Kryokonservierung der Zellen ... 48
4.2.1.5 Einsaat der Zellen ... 49
4.2.1.6 Fixierung und Färbung der Zellen ... 49
4.2.2 Stammlösungen der Test- und Kontrollchemikalien ... 49
4.2.3 Zytotoxizitätstests ... 50
4.2.3.1 Plattierungseffizienztest ... 50
4.2.3.2 CytoTox-ONETM Homogenous Membrane Integrity Assay ... 52
4.2.4 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ... 53
4.2.4.1 Behandlungsschema ... 54
4.2.4.2 Behandlungsgruppen und Durchführungsprotokoll ... 55
4.2.4.3 Prüfung tumorinitiierend wirksamer Substanzen ... 57
4.2.4.4 Prüfung tumorpromovierend wirksamer Substanzen ... 57
4.2.4.5 Auswertung ... 57
4.2.5 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit metabolisierendem System ... 59
4.2.5.1 S9-Mix ... 59
4.2.5.2 Zelllinie HepaRG® ... 61
4.2.6 Weichagar-Koloniebildungstest ... 63
4.2.6.1 Durchführung ... 64
4.2.6.2 Auswertung ... 65
4.2.7 Kombination beider Testsysteme ... 66
4.2.8 Statistische Analyse ... 67
5 Ergebnisse ... 69
5.1 Prüfung genotoxischer Substanzen ... 69
5.1.1 Klassisches Protokoll ohne metabolische Aktivierung ... 69
5.1.2 Erweitertes Protokoll mit metabolischer Aktivierung ... 73
5.1.2.1 S9-Mix ... 73
5.1.2.1.1 Erweitertes Protokoll ... 74
5.1.2.1.2 Zytotoxizitätstests ... 77
5.1.2.2 Zelllinie HepaRG® ... 78
5.1.2.2.1 Zytotoxizitätstests ... 78
5.1.2.2.2 Erweitertes Protokoll ... 81
5.2 Prüfung nicht-genotoxischer Substanzen ... 83
5.3 Kombination beider In-vitro-Testsysteme ... 87
5.3.1 12-Well-Format ... 87
5.3.1.1 Der Tumorinitiator Aflatoxin B1 ... 87
5.3.1.2 Die Tumorpromotoren Natriumarsenat, Okadasäure und Natriumsaccharin ... 88
5.3.2 96-Well-Format ... 89
5.3.2.1 Der Tumorinitiator Aflatoxin B1 ... 90
5.3.2.2 Die Tumorpromotoren Natriumarsenat, Okadasäure und Natriumsaccharin ... 92
6 Diskussion ... 97
6.1 Prüfung von Prokanzerogenen im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ... 99
6.2 Erweiterung des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests um ein metabolisierendes System ... 101
6.2.1 Untersuchungen zum S9-Mix als metabolisierendes System ... 104
6.2.2 Untersuchungen zur Zelllinie HepaRG® als metabolisierendes System ... 108
6.3 Prüfung von Tumorpromotoren im BALB/c-3T3-Zelltransformations-test ... 111
6.4 Kombination von BALB/c-3T3-Zelltransformations- und Weichagar- Koloniebildungstest ... 113
6.4.1 Untersuchungen zur Übertragung der Zellen aus dem BALB/c-3T3- Zelltransformationstest in den Weichagar-Koloniebildungstest ... 115
6.4.2 Prüfung genotoxischer und nicht-genotoxischer Modellsubstanzen im kombinierten Testsystem ... 116
6.5 Schlussbetrachtung und Ausblick ... 120
7 Zusammenfassung ... 123
8 Summary ... 125
9 Anhang ... 127
9.1 Darstellung weiterer Ergebnisse ... 127
9.1.1 Behandlungszeitpunkt der Zellen ... 127
9.1.2 Zytotoxizität der Leberhomogenate (S9) ... 128
9.1.3 Der S9-Mix als metabolisierendes System... 129
9.1.4 Die Zelllinie HepaRG® als metabolisierendes System ... 131
9.1.5 Etablierung des Weichagar-Koloniebildungstests ... 132
9.2 Abbildungsverzeichnis ... 134
9.3 Tabellenverzeichnis ... 137
10 Literaturverzeichnis ... 138
11 Danksagung ... 171
Abkürzungsverzeichnis
µM Mikromolar
AFB1 Aflatoxin B1
AFP α-Fetoprotein
BfR Bundesinstitut für Risikoforschung
BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung
ChemG Chemikaliengesetz
COX Cyclooxygenasen
CYP Cytochrom P450
dH2O Destilliertes Wasser, steril
DMEM (engl.) Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
ECHA Europäische Agentur für chemische Stoffe
ECVAM (engl.) European Centre for the Validation of Alternative Methods EGF (engl.) Epithelial Growth Factor
FBS Fetales bovines Serum
FE Fluoreszenzeinheiten
Ggr. Geringgradig
Griech. Griechisch
GST Glutathion-S-Transferase
Hgr. Hochgradig
HPLC/MS (engl.) High-performance liquid chromatography, mass spectrometry IE Internationale Einheiten
KBE Koloniebildungseffizienz
Konz. Konzentration
KV Kristallviolett
LDH Laktat-Dehydrogenase
LOX Lipoxygenasen
Lsm. Lösungsmittel
MAP (engl.) Mitogen-activated protein MCA oder 3-MC 3-Methylcholanthren
Mod. Modifiziert
MPV Medizinprodukte-Verordnung
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
n Stichprobenanzahl
NAD+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid, oxidierte Form NADH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid, reduzierte Form
OECD (engl.) Organisation for Economic Co-operation and Development (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung) PAK Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
PPAR Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Pen/Strep Penicillin/Streptomycin PflSchG Pflanzenschutzgesetz
QSAR (engl.) Quantitative structure–activity relationship
REACH (engl.) Registration, evaluation and authorisation of chemicals Rpm (engl.) Rounds per minute
SHE (engl.) Syrian hamster embryo SV40 (engl.) Simian Vacuolating Virus TCDD 2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
UBA Umweltbundesamt
v/v (engl.) Volume in volume
VO Verordnung
ZTT BALB/c-3T3-Zelltransformationstest
β-NADP+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat, oxidierte Form
1 Einleitung
Die Prüfung und Risikobewertung von Lebensmittelinhaltsstoffen und Chemikalien spielt eine zentrale Rolle in der Lebensmittelsicherheit. Dabei steht die Verwendung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch zunehmend im Vordergrund.
Im Hinblick auf die gesetzliche Entwicklung der letzten Jahre wird die Untersuchung chemischer Stoffe auf ihr toxisches und/oder kanzerogenes Potenzial immer bedeutender. Seit dem Inkrafttreten der Europäischen Chemikalienverordnung 1907/2006 (REACH) im Jahre 2007 sind die Hersteller und Importeure von Chemikalien vermehrt in der Pflicht, eine sichere Verwendung der von ihnen hergestellten bzw. vertriebenen chemischen Stoffe zu gewährleisten (UBA 2013). Die Verantwortung über die Erfassung der für die Registrierung benötigten Daten liegt seitdem in den Händen der herstellenden und/oder importierenden Unternehmen.
Wenngleich Tierversuche zur Generierung dieser Daten nicht gänzlich vermieden werden können und sogar vorgeschrieben sind, soll ihre Zahl aber soweit wie möglich reduziert werden (UBA 2013). Dies macht die Entwicklung, Etablierung und Evaluierung verschiedenster In-vitro-Techniken und Testverfahren als Ersatz- und Ergänzungsmethoden notwendig. Der Anspruch, auf der einen Seite den Schutz der Verbraucher sicher zu stellen und auf der anderen Seite die Zahl an Tierversuchen zu reduzieren, stellt die Forschung vor eine schwere Aufgabe (BMBF 2012).
Es gibt bereits heute schon eine beträchtliche Anzahl an Alternativmethoden, die durch die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) offiziell anerkannt sowie im europäischen Recht verankert sind (BFR 2013). In der Industrie werden neben den als Ersatz zum Tierversuch offiziell anerkannten Prüfmethoden auch In-vitro- Verfahren eingesetzt, die vom Gesetzgeber noch nicht offiziell akzeptiert sind. Die Ergebnisse dieser systematischen „Pre-screening“-Methoden helfen dabei, die anschließenden In-vivo- Studien effizienter zu planen und so die Anzahl an Versuchstieren zu reduzieren.
Bereits seit langer Zeit bekannte und etablierte Zellkulturmethoden zur Prüfung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien sind die Zelltransformationstests, von denen sich einige derzeit in der Prävalidierungsphase des European Centre for the Validation of
Alternative Methods (ECVAM) befinden (CORVI et al. 2012). Diese In-vitro-Testverfahren machen es möglich, sowohl genotoxische als auch nicht-genotoxische Substanzen zu untersuchen und Schwellenwerte zu bestimmen, die für anschließende In-vivo-Studien hilfreich sein können (VANPARYS et al. 2012). Zelltransformationstests stellen vereinfachte, experimentelle Modelle der Kanzerogenese dar, mit deren Hilfe die Veränderungen des Wachstums von Zellen nach einer Transformation durch verschiedene potenziell kanzerogene Chemikalien bestimmt werden können (SAKAI 2007). Eines dieser In-vitro-Testsysteme ist der BALB/c-3T3-Zelltransformationstest. Im Allgemeinen haben Zelltransformationstests jedoch den Nachteil, dass Substanzen, die in vivo zunächst metabolisch aktiviert werden müssen, um ihr vollständiges toxisches Potenzial zu entfalten, nicht adäquat geprüft werden können. Ein solcher Metabolisierungsschritt kann in diesen Testverfahren noch nicht adäquat simuliert werden.
Infolgedessen ist die Zielsetzung dieser Arbeit zum einen die Erweiterung des BALB/c-3T3- Zelltransformationstests durch ein metabolisches Aktivierungssystem und zum anderen die Verbindung dieses erweiterten Systems mit dem Weichagar-Koloniebildungstest. Der Weichagar-Koloniebildungstest detektiert das anheftungsunabhängige Wachstum maligne transformierter Zellen (MACPHERSON u. MONTAGNIER 1964; SAKAI 2007). Die Kopplung beider In-vitro-Testsysteme und damit die Untersuchung zweier wachstumsassoziierter Endpunkte in einer In-vitro-Prüfmethode soll eine effektivere und präzisere Bestimmung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien ermöglichen und möglicherweise die Sensitivität des BALB/c-3T3-Zelltransformationstest erhöhen.
2 Literaturübersicht
2.1 Chemikaliensicherheit und Stoffprüfung unter REACH
Die Europäische Chemikalienverordnung (VO (EG) 1907/2006; REACH) reguliert seit 2007 die Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe. Sie schreibt vor, dass Chemikalien, die in Mengen über eine Tonne pro Jahr produziert oder importiert werden, vom Hersteller bzw. Importeur auf ihr gesundheits- und umweltgefährdendes Potenzial hin überprüft und bewertet werden müssen (UBA 2013). Die Verantwortung liegt nach der neuen Verordnung also primär beim Hersteller oder Importeur und nicht mehr bei der zuständigen Behörde. Dabei muss nicht nur die Ermittlung der potenziell gefährlichen Eigenschaften der Stoffe, sondern u. a. auch eine Einschätzung des möglichen Risikopotenzials für die Umwelt und die menschliche Gesundheit erfolgen (FOTH 2008;
UBA 2013). Für Stoffe, die bereits auf dem Markt sind, wurden Fristen, bis wann diese registriert werden müssen, eingeführt. REACH beinhaltet dafür einen Katalog an Standardverfahren, mit deren Hilfe die verschiedenen potenziell gefährlichen Stoffeigenschaften, wie beispielsweise die akute Toxizität oder das kanzerogene Potenzial, untersucht werden sollen (FOTH 2008). Dabei kann die Stoffprüfung in vivo durch Alternativmethoden ersetzt werden oder sogar ganz entfallen. Letzteres ist möglich, wenn der Substanz bereits durch im Vorfeld durchgeführte In-vitro-Verfahren oder anhand chemisch- physikalischer Grundparameter gefährliche Eigenschaften zugeschrieben werden können (FOTH 2008). Nicht möglich ist der Ersatz von In-vivo-Studien jedoch, wenn es sich um einen komplexen und klassifikationsrelevanten Endpunkt handelt (FOTH 2008). Dazu gehört auch die Prüfung der potenziell kanzerogenen Wirkungen eines Stoffes.
Die In-vivo-Studien zur Prüfung des Gefahrenpotenzials einer chemischen Substanz sind mittels standardisierter und international anerkannter Prüfmethoden, die von der OECD festgelegt wurden, durchzuführen (FOTH 2008). Jedoch sind vor jeder neuen Prüfung zunächst alle vorliegenden Daten sowohl aus In-vivo- und In-vitro- als auch aus humanen Studien, validierte QSAR-Daten (engl. quantitative structure–activity relationship) sowie Daten strukturell verwandter Stoffe (sog. Analogiekonzept) zu prüfen und zu bewerten. Für einige Tiermodelle gibt es bereits offiziell anerkannte Alternativmethoden, die den
Tierversuch ergänzen oder auch vollständig ersetzen. In Tabelle 1 sind die vorgeschriebenen Prüfmethoden für die verschiedenen Standarddatenanforderungen auszugsweise dargestellt.
Tabelle 1: Erforderliche Standarddatenanforderungen für zu registrierende chemische Stoffe (Auszug aus der VO (EG) 1907/2006). Modifiziert nach FOTH (2008).
Erforderliche
Standarddatenanforderungen
In vivo (OECD-Richtlinie
Nr.) In vitro
Reizung und Verätzung der
Haut Akuter Test (Nr. 404) Humanzellkultur
Ex-vivo-Humanhaut Reizung und Verätzung der
Augen Akuter Test (Nr. 405) Ex-vivo-Tierauge (Rind,
Huhn, Kaninchen)
Toxizität nach Einmalkontakt
Orale Gabe (Nr. 401, 420, 423, 425)
Dermale Verabreichung (Nr. 402, 434)
Verabreichung durch Inhalation (Nr. 403, 433, 436)
Keine
Toxizität nach wiederholtem
Kontakt Orale Gabe (Nr. 407) Keine
Karzinogenität Bei Verdacht (Nr. 451, 453) Keine
Mutagenität/Genotoxizität
Genotoxizität an somatischen Zellen (Nr. 474, 475, 486) Keimzellmutagenität (Nr. 483, 484, 485) Dominant-Letal-Test (Nr. 478)
In-vitro-
Genmutationsversuch in Bakterien
In-vitro-zytogenetische Untersuchung oder Mikronukleusbildung in Säugerzellen
Reproduktionstoxizität
Reproduktionstoxizitäts- Screeningtest (Nr. 422) Embryonale
Entwicklungstoxizität Zweigenerationentest (Nr. 421)
Keine
Ist eine solche In-vitro-Methode vorhanden, darf kein Tierversuch mehr durchgeführt werden.
In Artikel 25 (1) Satz 1 der REACH-VO wird deutlich gemacht, dass In-vivo-Studien nur als
letzte Maßnahme angesehen werden dürfen und die Zahl der notwendigen Versuche auf ein Mindestmaß beschränkt werden soll (VO (EG) 1907/2006). Dies soll u. a. durch eine Beschränkung von Mehrfachdurchführungen dieser Studien und durch die gemeinschaftliche Datennutzung geschehen (VO (EG) 1907/2006).
Für die Prüfung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien besteht bisher keine offiziell anerkannte Alternativmethode, so dass weiterhin zeit- und kostenintensive In-vivo-Studien nach der OECD-Richtlinie Nr. 451 (Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien:
Kanzerogenitätsstudien) durchgeführt werden müssen (OECD 2009). Allerdings schreitet die Forschung auch in diesem Bereich voran. Es gibt bereits gut etablierte Zellkulturmethoden, die verschiedene Phasen der Tumorentstehung simulieren können (Kapitel 2.3.4) (SCHECHTMAN 2012).
2.2 Kanzerogenese in vivo und in vitro
Krebserkrankungen sind nach kardiovaskulären Krankheiten die zweithäufigste Todesursache in Deutschland (DESTATIS 2013). Neben der genetischen Prädisposition, ionisierenden Strahlen oder auch der spontanen Zelltransformation ist man sich heutzutage einig, dass die Hauptursache für die Entstehung von Tumoren in der Exposition der Menschen mit Chemikalien und Mikroorganismen besteht (MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 158). Die Folge sind genetische Schäden und transformierte, autonom wachsende Zellen, die durch bestimmte pathologische Merkmale, wie ein unkontrolliertes und meist invasives Wachstum sowie Zellatypien oder die häufige Bildung von Tochtergeschwülsten (sog. Metastasen) charakterisiert sind (MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 157). Die im gesunden Organismus vorhandene präzise Steuerung wachsender und differenzierender Zellen, die für die Homöostase des Körpers von größter Bedeutung ist, wird dabei gestört oder ganz außer Kraft gesetzt (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 196; MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 157).
Da der Mensch über Jahre hinweg der Exposition mit Lebensmittelinhalts- und -zusatzstoffen, Rückständen von Kontaminanten oder Tierarzneimitteln in Lebensmitteln ausgesetzt ist, ist eine potenziell kanzerogene oder zumindest mutagene Wirkung in der Lebensmitteltoxikologie von großer Relevanz (NAU 2003, S. 11).
2.2.1 Mehrstufenmodell der Kanzerogenese
Bereits seit dem frühen 18. Jahrhundert postulierten verschiedene Forschergruppen einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein chemischer Substanzen in der Umwelt und der Entstehung von Tumoren beim Menschen. Ab dem frühen 20. Jahrhundert wurde das Fundament für unser heutiges Wissen auf dem Gebiet der (chemischen) Kanzerogenese gelegt (MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 159). Bis heute anerkannt ist die Tatsache, dass es sich bei der Tumorentstehung um einen mehrstufigen Prozess biologischer Ereignisse handelt, der modellhaft die folgenden Phasen mit einschließt (FRIEDEWALD u. ROUS 1944; HARRIS 1991; SCHULTE-HERMANN et al. 2004). Die erste Phase ist die Initiation, in der im Genom der Zelle eine Mutation entsteht (KUSEWITT u. RUSH 2009, S. 243; SCHULTE- HERMANN et al. 2004, S. 169). Von entsprechender Bedeutung für die Entstehung eines Tumors ist die nächste Phase, die Tumorpromotion (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 199). Das Wachstum und die selektive Vervielfachung der durch die Mutation im Genom geschädigten Zellen führt in dieser Phase zur Entstehung eines benignen Tumors (SCHULTE- HERMANN et al. 2004, S. 196). Der Übergang von einem benignen zu einem malignen Tumor durch die Akkumulation weiterer genetischer Veränderungen wird schließlich als Progressionsphase bezeichnet (STOPPER 2010, S. 134).
Die Initiation tritt nur in einzelnen Zellen auf, ist irreversibel und nicht organspezifisch (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 199). Proliferierende Zellen sind besonders empfindlich, da eine fehlerfreie Reparatur der DNA hier nicht bzw. nur eingeschränkt möglich ist und die Mutation auf diese Weise schnell im Genom fixiert werden kann (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 199; KUSEWITT u. RUSH 2009, S. 259). Zielstellen der DNA für solche irreparablen Schäden sind Gene, die für das Wachstumsverhalten der Zellen verantwortlich sind (HORN et al. 2003a, S. 311). Dazu zählen Protoonkogene, die durch eine Mutation zu Onkogenen aktiviert werden, und Tumorsuppressorgene, deren wohl wichtigster Vertreter das p53-Gen ist (HORN et al. 2003a, S. 311). Protoonkogene kodieren für Proteine, deren Hauptaufgabe die Aktivierung des Zellzyklus und -wachstums sowie die Inhibition der Apoptose ist (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 183). Ein Beispiel dafür ist das ras-Gen, das im aktivierten Zustand ein exzessives und unkontrolliertes Wachstum der Zellen stimuliert (LODISH et al. 2008, S. 1119). Tumorsuppressorgene, wie beispielsweise TP53, dessen Genprodukt das p53 ist, oder das RB-Gen (Retinoblastom-Gen) kodieren für
Proteine, die u. a. für die Hemmung der Teilungsaktivität einer Zelle zuständig sind und apoptotische Vorgänge induzieren können, also den Zellzyklus oder die DNA-Reparatur kontrollieren (KUSEWITT u. RUSH 2009, S. 266; STOPPER 2010, S. 134). Nehmen diese wichtigen Gene Schaden, ist die Voraussetzung für die Entstehung einer malignen Transformation gegeben (STOPPER 2010, S. 134). Die Tumorpromotion ist ein lang andauernder Prozess, der Monate bis Jahre währen kann. Dabei wird die Proliferation der Zellen angeregt, die durch die Mutation einen Wachstumsvorteil erhalten haben. Sie reagieren stärker auf den stimulierenden Effekt des Tumorpromotors als normale Zellen (KAINA 2005, S. 977). Vermutlich wirken Tumorpromotoren über Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte Bereiche, sog. response elements, in der Promotorregion von Zielgenen binden und so deren Expression regulieren können (NAU 2003, S. 11). Ist der Organismus nur dem Tumorpromotor allein ausgesetzt, kommt es nicht zur Tumorbildung, da die nötige initiierende Schädigung der DNA fehlt (BOUTWELL 1964; SCHULTE-HERMANN et al.
2004, S. 200). Die Wirksamkeit eines Tumorpromotors kann bei einer Unterbrechung abgeschwächt werden, so dass oftmals Dosen unterhalb eines bestimmten Schwellenwertes keinen Effekt mehr haben (BOUTWELL 1964; SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 200).
Einen feststehenden Endpunkt gibt es für das Tumorwachstum nicht (SCHULTE- HERMANN et al. 2004, S. 200). Die für Tumorzellen typische genetische Instabilität, defekte DNA-Reparaturmechanismen und ihr unbegrenztes Vermehrungspotenzial sind einige wesentliche Gründe dafür, dass sich einmal entartetes Gewebe weiter ausbreiten kann (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 200). Tabelle 2 zeigt zusammengefasst die wichtigsten biologischen Merkmale der genannten Phasen der Kanzerogenese.
Tabelle 2: Biologische Merkmale der verschiedenen Phasen des Mehrstufenmodells der Kanzerogenese.
Modifiziert nach SCHULTE-HERMANN et al. (2004) und STOPPER (2010).
Initiation Promotion Progression
Mutation
Proliferationsfördernd (klonale Expansion), Selektion initiierter Zellen
Weitere Mutationen (Übergang von einem
benignen zu einem malignen Tumor)
Irreversibel Reversibel Irreversibel
Manifestation in einzelnen Zellen ohne spezifisches Erfolgsorgan
Wachstum im Erfolgsorgan (organspezifisch)
Invasion und Metastasierung, Gefäßbildung
Zellteilung erforderlich zur Fixierung der Mutation (proliferierende Zellen besonders empfindlich)
- Fortschreitend aggressives Verhalten der Tumorzellen Ohne nachfolgende
Promotion keine Tumorbildung
Ohne vorangegangene Initiation keine
Tumorbildung
Unbegrenztes
Vermehrungspotenzial der Tumorzellen
Keine Schwellendosis
bestimmbar Schwellendosis bestimmbar -
(Proto-) Onkogene, Tumorsuppressorgene betroffen
Wachstumsrelevante Gene betroffen
Gene für Gewebekontrolle, Überlebensfähigkeit und Migration betroffen
Der Prozess der Kanzerogenese in vivo lässt sich phasenweise und modellhaft auch in vitro simulieren (BARRETT u. TS'O 1978). Die dafür genutzten Methoden stützen sich hauptsächlich auf die Zellkulturtechnik. Mit Hilfe sog. Zelltransformationstests ist es möglich, den Wandel einer gesunden zu einer tumorösen Zelle nach einer Exposition mit kanzerogenen Chemikalien zu imitieren (BERWALD u. SACHS 1963). Die OECD definiert Zelltransformation als ein Auftreten verschiedener phänotypischer Veränderungen von kultivierten Zellen, die für Tumorzellen charakteristisch sind (OECD 2007). Transformierte Zellen durchlaufen eine Reihe von zellulären Veränderungen, u. a. auf morphologischer, karyotypischer oder metabolischer Ebene (DIPAOLO et al. 1971). Zudem ändern sie ihr Wachstumsverhalten und erlangen eine unbegrenzte Lebensdauer, wie es auch in Tumoren in vivo beschrieben ist (BERWALD u. SACHS 1963; BARRETT 1985). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass Zellen, die in vitro transformiert wurden, nach der
Transplantation in ein Versuchstier, meistens Mäuse, Tumoren bildeten (BERWALD u.
SACHS 1963; MONDAL et al. 1976). Diese Tatsache zeigt deutlich den Zusammenhang zwischen den molekularen und zellulären Prozessen der Transformation einer Zelle in vitro und der Tumorentstehung in vivo (DIPAOLO et al. 1971; OECD 2007; VANPARYS et al.
2012).
2.2.2 Biotransformation von Fremdstoffen
Der Organismus ist zeit seines Lebens Fremdstoffen ausgesetzt. Um einer Schädigung entgegen zu wirken, kann er diese verstoffwechseln und unschädlich machen. Die entstandenen Metabolite können dann renal oder biliär ausgeschieden werden (NAU 2003, S. 31; MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 178). Dafür müssen die Stoffe, die häufig unpolar und sehr lipophil sind, in polare und hydrophile Moleküle umgewandelt werden (LEWIS u.
PRATT 1998). Während auf diese Weise einige schädliche Substanzen detoxifiziert werden, können andere zu toxischen Metaboliten aktiviert werden (sog. Giftung) (HORN et al. 2003b, S. 527). Dies trifft für die Mehrzahl ursprünglich inerter, potenzieller Kanzerogene zu (E. C.
MILLER 1978; IOANNIDES u. LEWIS 2004). Die auf diese Weise gebildeten Metabolite sind zum größten Teil starke Elektrophile und sind in der Lage kovalent an nukleophile Zentren sensitiver Zellkomponenten wie der DNA zu binden (J. A. MILLER u. MILLER 1969; MARQUARDT u. PFAU 2004, S.164).
Die Biotransformation von Fremdstoffen (griech. Xenobiotika) verläuft grundsätzlich in zwei Phasen: die Funktionalisierung (Phase I) und die Konjugation (Phase II) (HORN et al. 2003b, S. 527). Dafür hält der Organismus eine Vielzahl (> 100) einzelner Enzyme bereit, die aus Kapazitätsgründen zum großen Teil erst durch eine Exposition mit Fremdstoffen substratspezifisch induzierbar sind (ARAND u. OESCH 2004, S. 91).
2.2.2.1 Phase-I-Reaktionen
In Phase-I-Reaktionen werden durch Oxidation, Reduktion oder Hydrolyse funktionelle Gruppen in die Fremdstoffmoleküle eingebaut, die dazu führen, dass aus dem Molekül ein nukleophiles oder elektrophiles Zwischenprodukt wird (NAU 2003; ARAND u. OESCH 2004, S. 90). Im Gegensatz zu den nukleophilen Metaboliten ist es den elektrophilen Zwischenprodukten möglich, mit Makromolekülen elektronenreicher Strukturen wie der
DNA, der RNA oder von Proteinen zu interagieren, so dass sie toxisch wirken können (J. A.
MILLER u. MILLER 1969; ARAND u. OESCH 2004, S. 90). Enzymsysteme, die hauptsächlich an den Reaktionen des Phase-I-Metabolismus beteiligt sind, sind Hydrolasen und Oxidoreduktasen (ARAND u. OESCH 2004, S. 92). Zu den Hydrolasen gehören Esterasen, Epoxidhydrolasen sowie Enzymfamilien, die Glucuronide, Sulfate oder Amide hydrolysieren (ARAND u. OESCH 2004, S. 92). Die zu den Oxidoreduktasen zählende Enzymfamilie der Cytochrom-P450-abhängigen Monooxygenasen (CYPs) katalysiert den Großteil (etwa 75 %) der Phase-I-Reaktionen (COON et al. 1992; GUENGERICH 2008).
Davon sind hauptsächlich fünf der bisher identifizierten 57 humanen CYP-Gene in die Biotransformation von Fremdstoffen involviert (GUENGERICH 2008).
In Eukaryonten besteht die große Familie der CYPs aus einer Vielzahl von membranständigen Enzymen, die im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind (COON et al. 1992). Die CYPs bilden dort einen Komplex mit der CYP450-Reduktase. Dieser Komplex lässt sich für diverse In-vitro-Methoden mittels differentieller Ultrazentrifugation als mikrosomale Fraktion aus Gewebehomogenaten (meistens aus Rattenleberhomogenaten) gewinnen (DENT et al.
1981; ARAND u. OESCH 2004, S. 92). In Tabelle 3 befindet sich eine Übersicht über die wichtigsten CYPs und ihre Substrate (Auswahl).
Tabelle 3: Wichtige am Fremdstoffmetabolismus beteiligte Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYP).
Modifiziert nach ARAND u. OESCH (2004), S. 96.
Isoenzym Hauptwirkungsort Substrate (Auswahl)
CYP1A1 Verschiedene Organe Polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe (PAKs)
CYP1A2 Leber
Aromatische Amine, PAKs, Koffein, Warfarin, Aflatoxin B1
CYP1B1 Extrahepatische Organe PAKs, Fjord-Region-Diole
CYP2A6 Leber Cumarin, Aflatoxin B1,
Nitrosamine
CYP2C9 Leber, Niere Diclofenac, Ibuprofen,
Phenytoin
CYP2C19 Leber Omeprazol
CYP2D6 Leber Propranolol,
Dextrometorphan
CYP2E1 Leber, Gastrointestinaltrakt
Ethanol, Benzol, Dimethylnitrosamin, Chlorzoxazon
CYP3A4 Leber, Dünndarm
Acetaminophen, Steroidhormone,
Erythromycin, Aflatoxin B1
Ein wichtiges Merkmal der Familie der CYPs ist ihre Induzierbarkeit. Bereits CONNEY et al.
(1956) fanden Beweise dafür, dass eine Induktion bestimmter fremdstoffmetabolisierender Leberenzyme durch die Gabe von 3-Methylcholanthren (MCA) an Ratten auftritt. So können Arzneimittel und Umweltstoffe auf den Metabolismus von Xenobiotika einwirken, indem sie die Aktivität bestimmter Isoenzyme der CYP-Familie erhöhen und dabei ihre eigene Biotransformation oder die anderer Substanzen verändern (CONNEY 1982). Klassische Induktoren verschiedener CYPs sind polychlorierte Biphenyle (z. B. Aroclor 1254), Phenobarbital, β-Naphthoflavon oder MCA, welche u. a. Anwendung in der Erforschung des Fremdstoffmetabolismus in vivo und in vitro finden (CONNEY 1982; IOANNIDES u.
PARKE 1990; KLOTZ et al. 2006, S. 29).
Aus der Gruppe der Hydrolasen soll an dieser Stelle der Fokus auf die Epoxidhydrolasen gelegt werden, da diese sowohl für die Detoxifizierung als auch für die Toxifizierung von Xenobiotika eine Bedeutung haben. Hydrolasen sind ubiquitär im Organismus zu finden, wobei ihr Hauptaktivitätsorgan wie bei allen fremdstoffmetabolisierenden Enzymen die Leber ist (ARAND u. OESCH 2004, S. 104). Man unterscheidet eine lösliche und eine mikrosomale Epoxidhydrolase. Die hauptsächlich für die Biotransformation von Fremdstoffen verantwortliche und durch diese auch induzierbare mikrosomale Epoxidhydrolase katalysiert die Reaktionen eines breiten Spektrums an Substraten (ARAND u. OESCH 2004, S. 104).
Durch die hydrolytische Öffnung eines Epoxidrings sind sie in der Lage, ein reaktives Epoxid zu einem weniger reaktiven Dihydrodiol-Produkt zu verestern und es so den Phase-II- Enzymen zugänglich zu machen (ARAND u. OESCH 2004, S. 104). Allerdings kann sich das gebildete Dihydrodiol durch eine wiederholte CYP-vermittelte Reaktion auch mit einem weiteren Epoxid verbinden und so ein hoch kanzerogenes Endprodukt ergeben (z. B.
Metabolismus der PAKs) (THAKKER et al. 1976; ARAND u. OESCH 2004, S. 104).
Neben den CYPs und den Epoxidhydrolasen tragen auch die Cyclooxygenasen (COX) zur Toxifizierung von Fremdstoffen bei. Ihre physiologische Funktion ist die Produktion von Prostaglandin H2 aus Arachidonsäure, das als Ausgangsmolekül für die Biosynthese weiterer Prostaglandine fungiert (WÄTJEN u. FRITSCHE 2004, S. 56). Dabei wird zwischen der COX-1 und der COX-2 unterschieden, von denen die erste konstitutiv aktiv und die zweite durch Fremdstoffe wie 2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin (TCDD) oder Benzo[a]pyren (B[a]P) induzierbar ist (WÄTJEN u. FRITSCHE 2004, S. 56).
2.2.2.2 Phase-II-Reaktionen
Während in Phase I der Biotransformation endogene oder exogene Substanzen so
„funktionalisiert“ werden, dass eine Interaktion mit den Phase-II-Enzymen möglich gemacht wird, erfolgt in den Phase-II-Reaktionen letztendlich die Konjugation an negativ geladene, sehr polare Kosubstrate (HORN et al. 2003b, S. 530). Die Ausschleusung aus dem Organismus ist nur möglich, sofern die Polarität der Verbindung und damit ihre Wasserlöslichkeit erhöht werden. Dazu werden die funktionalisierten Fremdstoffmoleküle glucuronidiert, sulfatiert, acetyliert, methyliert oder an andere Kopplungspartner wie diverse
Aminosäuren (Glutamat, Glycin oder Taurin) oder Glutathion gebunden (WÄTJEN u.
FRITSCHE 2004, S. 60).
2.2.3 Chemische Kanzerogene
Verglichen mit endogenen Faktoren, wie z. B. hereditäre, genetische Schäden oder auch freie Sauerstoffradikale, wie sie in entzündetem Gewebe vermehrt auftreten, sind chemische Kanzerogene als exogene Risikofaktoren aus der Nahrung oder der Umwelt von großer Relevanz für die Entstehung von Krebserkrankungen beim Menschen (SCHULTE- HERMANN et al. 2004, S. 198). Je nach Art und Weise mit der DNA zu interagieren, werden die chemischen Kanzerogene in zwei Klassen eingeteilt: genotoxische und nicht-genotoxische Substanzen (MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 162). Im Folgenden werden die in der vorliegenden Arbeit als Modellsubstanzen verwendeten chemischen Kanzerogene kurz vorgestellt.
2.2.4 Wirkungsmechanismen genotoxischer Kanzerogene
Die Wirkungsmechanismen genotoxisch wirksamer, chemischer Kanzerogene fokussieren sich auf eine Interaktion dieser Substanzen mit der DNA. Sie sind in der Lage, die DNA direkt zu schädigen, also die Zelle zu initiieren (OECD 2007). Solche Substanzen wirken in Genotoxizitätstests mutagen (OECD 2007; STOPPER 2010). Sie können aber auch die DNA- Reparatur, die genetische Stabilität einer Zelle, die für die Wachstumsregulierung verantwortlichen Onko- und Tumorsuppressorgene oder die Telomerasefunktionen einer Zelle beeinträchtigen (HANAHAN u. WEINBERG 2000; MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 181- 184).
Die Interaktion mit der DNA resultiert in der Bildung von DNA-Addukten, die durch die Bindung elektrophiler reaktiver Intermediate an die exozyklischen Hydroxyl- oder Aminogruppen von Nukleobasen (C8- oder N7-Positionen der Purinbasen) der DNA entstehen (MISRA et al. 1983; MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 181). Durch ihre große Anzahl nukleophiler Zentren, bedingt durch einen hohen Gehalt an Stickstoff- und Sauerstoffatomen, sind die Basen der DNA besonders leichte Ziele für solche kovalente, lang im Genom persistierende Bindungen (E. C. MILLER 1978). Dabei können Basenfehlpaarungen entstehen, die während der DNA-Replikation auftreten, und im weiteren Verlauf zu einer
Akkumulation von Mutationen beitragen (STEINBERG 2003b, S. 149). Ferner können sich instabile DNA-Addukte bilden, die spontan abgespalten (depuriniert) werden. Dies kann zu einer Schwächung der DNA an dieser Stelle führen, wodurch Strangbrüche auftreten können (MARQUARDT u. PFAU 2004, S. 181).
2.2.4.1 Aflatoxin B1
Ein bekanntes Beispiel für die Bildung von DNA-Addukten an der N7-Position von Guanin ist ein Metabolit des Mykotoxins Aflatoxin B1 (AFB1). AFB1 ist ein sehr potentes Leberkanzerogen und der für Mensch und Tier toxischste Vertreter der Gruppe der Aflatoxine.
Besonders belastet sind Getreide, Nüsse oder Reis. Die Giftung durch die Bildung verschiedener stark kanzerogener Stoffwechselprodukte findet erst durch eine metabolische Aktivierung im Rahmen der Biotransformation in der Leber statt (GARNER et al. 1972; LIN et al. 1977; MARTIN u. GARNER 1977). Beim Menschen spielen CYP1A2 und 3A4 eine dominierende Rolle bei der Aktivierung des aufgenommenen AFB1 zu seinem hochtoxischen und hochkanzerogenen Metaboliten, dem Aflatoxin B1-8,9-epoxid (SWENSON et al. 1977;
SHIMADA u. GUENGERICH 1989; FORRESTER et al. 1990). Zusätzlich dazu kann eine Aktivierung aber auch durch CYP2A1, CYP2A6 oder Isomere der CYP2C-Unterfamilie erfolgen (ESSIGMANN et al. 1982; FORRESTER et al. 1990; ARAND u. OESCH 2004, S. 95). Neben dem Hauptaktivierungsweg über die CYPs ist eine Kooxidation durch COX oder Lipoxygenasen (LOX) möglich (L. LIU u. MASSEY 1992; ROY u. KULKARNI 1997).
Das als ultimales Kanzerogen bezeichnete Aflatoxin B1-8,9-epoxid (Abbildung 1) entsteht durch die Epoxidierung der Doppelbindung zwischen den Positionen C8 und C9, ist stark elektrophil und bildet eine kovalente Bindung vorwiegend mit dem N7-Atom der Purinbase Guanin aus, was zu einem Basenaustausch führt (ESSIGMANN et al. 1977; LIN et al. 1977;
MARTIN u. GARNER 1977). Anstelle eines Cytosins, das sich normalerweise mit dem Guanin paaren würde, wird bei der Replikation nun ein Thymin in die DNA eingebaut (HELMBERG 2007). Diese Guanin- zu Thymin-Transversion im Codon 249 des Tumorsuppressorgens p53 führt dazu, dass anstelle von Arginin die Aminosäure Serin in das Protein eingebaut wird, und somit die Funktion des p53 als „Wächter des Genoms“ beeinträchtigt wird (FOSTER et al. 1983; HORN et al. 2003c, S. 265; HELMBERG 2007). Des Weiteren kommt es zur Schwächung der N-glykosidischen Bindungen durch
spontane Abspaltungen (Depurinierung) des modifizierten Guanin-Rests, welche zu sog.
apurinischen Stellen führen und die DNA sehr anfällig für Strangbrüche machen (STEINBERG 2003b, S. 149).
O O
O
OCH3
O O
O O
O
OCH3
O O
CYP450
O
O O
O
OCH3
O O
GST
GS
OH
AFB1-8,9-epoxid-GSH-Konjugat
O O
O
OCH3
O O
N N HN
N R O H2N
OH
8,9-Dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroxyaflatoxin B1 DNA
Abbildung 1: Biotransformation von Aflatoxin B1: Toxifizierung und Detoxifizierung (vereinfachte Darstellung). GS: Glutathion, R: Desoxyribose.
Für die Detoxifizierung des Aflatoxin B1-8,9-epoxids ist bei den Säugetieren die zytosolische GST von entscheidender Bedeutung (Phase-II-Reaktionen), wobei es durchaus speziesspezifische Unterschiede in ihrer Expression gibt (EATON u. GALLAGHER 1994).
2.2.4.2 Benzo[a]pyren
PAKs sind seit langem als Ursache für die Entstehung von malignen Tumoren bekannt. Sie sind ubiquitär in der Umwelt vorhanden und entstehen bei der unvollständigen Verbrennung organischen Materials unter Sauerstoffmangel und bei niedrigen Temperaturen (STEINBERG
2003a). Ihre Distribution in der Umwelt erfolgt hauptsächlich über die Luft, wodurch sie schlussendlich in die Nahrungskette gelangen bzw. eingeatmet werden (KONTIR et al. 1986;
KOSS 2004, S. 592). Ein wichtiger Vertreter der PAKs und eine in dieser Arbeit verwendete Modellsubstanz ist das genotoxische Kanzerogen B[a]P. Die Substanz an sich ist chemisch inert und wird als Prokanzerogen bezeichnet, da erst ihre metabolische Aktivierung, z. B.
durch verschiedene Isoformen der CYP-Familie, zur Bildung reaktiver Metabolite führt (ARAND u. OESCH 2004).
CYP450
O
Benzo[a]pyren Benzo[a]pyren-7,8-epoxid
OH OH + H2O Epoxidhydrolase
Benzo[a]pyren-7,8-dihydrodiol OH
OH O
Benzo[a]pyren-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid CYP450
O
Benzo[a]pyren-Glutathion-Konjugat GS OH
Abbildung 2: Metabolismus von Benzo[a]pyren (auszugsweise). GS: Glutathion.
Der Metabolismus von B[a]P ist sehr komplex, so dass an dieser Stelle nur ein möglicher Metabolisierungsweg beschrieben werden soll. In einem ersten Schritt wird B[a]P zum Benzo[a]pyren-7,8-epoxid oxidiert, welches eine höhere Wasserlöslichkeit als das Ausgangsmolekül aufweist. Der kanzerogene Metabolit Benzo[a]pyren-7,8-dihydrodiol-9,10-
epoxid entsteht durch Hydrolyse und Epoxidierung unter Beteiligung verschiedener CYPs und der mikrosomalen Epoxidhydrolase (THAKKER et al. 1976; BUENING et al. 1978;
SHOU et al. 1994; STEINBERG 2003b). Diese sehr reaktive, elektrophile Verbindung ist in der Lage, an nukleophile Zentren der DNA zu binden, reagiert aber auch mit der RNA oder zellulären Proteinen (STEINBERG 2003a, S. 203). Dabei werden die Purinbasen Adenin oder Guanin für die Ausbildung kovalenter Bindungen zur DNA bevorzugt (STRAUB et al. 1977;
JERINA et al. 1991). Ferner ist die Bioaktivierung des B[a]P durch eine Epoxidierung verschiedener B[a]P-Metabolite, z. B. des 7,8-Dihydrodiols durch LOX, oder die Kooxidation durch COX bei der Prostaglandin-Synthese möglich (MARNETT et al. 1975;
BYCZKOWSKI u. KULKARNI 1989). Außerdem sind Lipidperoxylradikale in der Lage, direkt mit dem Substrat B[a]P oder AFB1 zu interagieren und Epoxide zu bilden (REED 1987).
In Abbildung 2 ist beispielhaft als eine Möglichkeit der Detoxifizierung der hochreaktiven B[a]P-Metabolite die Konjugation an Glutathion dargestellt. Weitere Optionen der Phase-II- Reaktionen zur Elimination der hochtoxischen Metabolite sind die Umwandlung zu Diolen oder Phenolen, die dann glucuronidiert oder sulfatiert und somit ausgeschieden werden können (KOSS 2004, S. 597).
Ein weiterer Vertreter der PAKs, der in dieser Arbeit Verwendung findet, ist das MCA. Diese stark genotoxische Substanz ist ein bekannter Tumorinitiator und wird in vielen In-vitro- Testsystemen als Positivkontrolle eingesetzt (REZNIKOFF et al. 1973a; IARC/NCI/EPA WORKING GROUP 1985).
2.2.4.3 Dimethylnitrosamin
Dimethylnitrosamin (DMN) gehört zur Stoffgruppe der N-Nitrosoverbindungen, die als Umweltkanzerogene von hoher Relevanz sind. N-Nitrosamine werden endogen aus Nitriten, die durch mikrobielle Reduktasen aus Nitraten entstehen, und nitrosierbaren Aminen gebildet.
Nitrate werden hauptsächlich mit der Nahrung aus pflanzlichen Produkten, Trinkwasser und gepökelten Lebensmitteln oder aber über die Haut sowie die Lunge (Zigarettenrauch) aufgenommen. Pökelware ist für die Bildung von N-Nitrosaminen von besonderer Relevanz, da sie sowohl Nitrit als auch sekundäre (nitrosierbare) Amine enthält. Die Folgen einer Vergiftung mit N-Nitrosaminen sind Leberschäden, deren Entstehungsmechanismus
allerdings bis heute nicht eindeutig geklärt ist (MAGEE u. BARNES 1967; KÖHL u.
EISENBRAND 2004, S. 757). N-Nitrosamine sind Prokanzerogene. Die Bioaktivierung des DMN ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Über eine α-Hydroxylierung, die bei DMN vorwiegend CYP2E1-vermittelt ist, entsteht ein Zwischenprodukt, das in Formaldehyd und Methyldiazohydroxid zerfällt. Die Freisetzung von molekularem Stickstoff und die Abgabe der Hydroxylgruppe resultiert in der Bildung eines hochreaktiven Carbeniumions, ein Radikal, das zelluläre Makromoleküle wie die DNA, RNA oder Proteine methylieren kann (TU et al.
1984; YANG et al. 1990; YOO et al. 1990).
N N
H3C H3C
O N N
H2C H3C
O OH
N N OH
H3C
- HCHO
[CH3+]
- N2, OH- CYP450 Hydroxylierung
Abbildung 3: Bioaktivierung des Dimethylnitrosamins.
Das vorwiegend gebildete DNA-Addukt ist das N7-Methylguanin. DNA-Addukte entstehen aber auch an anderen Positionen des Guanins (z. B. an der O6-Position) sowie an verschiedenen Bindungsstellen der zweiten Purinbase Adenin (SOULIOTIS et al. 1995).
2.2.5 Wirkungsmechanismen nicht-genotoxischer Kanzerogene
Nicht-genotoxische Stoffe sind solche, welche die DNA nicht direkt angreifen, sondern über veränderte Genexpressionsmuster und/oder zelluläre Signaltransduktionswege DNA- Strukturen oder ~Funktionen modifizieren können (NAU 2003, S. 12, 14; OECD 2007). Sie wirken in Genotoxizitätstests nicht mutagen (SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 201).
Nicht-genotoxische Kanzerogene gehören zu den Tumorpromotoren (ASADA et al. 2005).
An dieser Stelle sollen als Beispiele für die Wirkungsmechanismen nicht-genotoxischer Kanzerogene die in dieser Arbeit verwendeten tumorpromovierenden Substanzen kurz beschrieben werden. Nicht-genotoxische Kanzerogene werden auch als Kokanzerogene
bezeichnet, da sie das Tumorwachstum durch die Erhöhung der Zellproliferation verstärken können, selbst jedoch keine Mutationen verursachen (HELMBERG 2007).
2.2.5.1 Okadasäure und 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
Okadasäure, ein C38-Fettsäurederivat, wurde aus marinen Schwämmen isoliert und kann über den Verzehr von Muscheln oder Fisch zu Intoxikationen führen. Namensgebend war der Schwamm Halichondria okadai (TACHIBANA et al. 1981). Die Okadasäure ist ein sehr potenter Inhibitor der Serin/Threonin-Protein-Phosphatasen vom Typ 1, 2a und 3, welche die Proteinkinase C, eine Serin/Threonin-Kinase, durch den Abbau von Serin und Threonin hemmen (DOUNAY u. FORSYTH 2002; SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 215;
BOUDREAU u. HOSKIN 2005). Wird die Funktion dieser Phosphatasen durch Okadasäure inhibiert, führt dies zu einer Hyperphosphorylierung regulatorischer Proteine in der Zelle und somit zu einer Induktion der Signaltransduktion (FUJIKI u. SUGANUMA 1999; SCHULTE- HERMANN et al. 2004, S. 215). Dies wiederum resultiert in einer Verstärkung der Zellproliferation, welche die Entstehung eines malignen Tumors vorantreibt. Die promovierende Wirkung der Okadasäure konnte bereits von SAKAI und FUJIKI (1991) im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest nachgewiesen werden.
Den gleichen molekularen Angriffsmechanismus, jedoch über eine direkte Hyperaktivierung der Proteinkinase C, besitzt 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), ein Fettsäureester des Diterpenalkohols Phorbol (BURNS u. BELL 1991). Als Inhaltstoff des Krotonöls ist TPA eine der ersten als tumorpromovierend erkannten Substanzen und gleichzeitig der wirksamste Vertreter der Tumorpromotoren (BERENBLUM 1941; BAIRD u. BOUTWELL 1971).
Aufgrund des vorhandenen oder nicht vorhandenen Bindungsvermögens an Phorbolrezeptoren, u. a. die Proteinkinase C, werden Tumorpromotoren in den TPA-Typ und den Nicht-TPA-Typ unterteilt, wobei die Okadasäure zu Letzterem zählt (FUJIKI et al. 1991).
HO
O O
OH H
O OH
O O
O O
O
OH H
H OH
H3C
CH2OH O HO
O
HO H3C
O CH3 CH3
C C CH2 O
O CH3
CH3
Okadasäure
12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
Abbildung 4: Strukturformeln der Tumorpromotoren Okadasäure und 12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetat (TPA).
2.2.5.2 Natriumarsenat
Arsenverbindungen führen beim Menschen vermehrt zu Lungen-, Haut- oder Leberkrebs (TAKAHASHI et al. 2002). Dabei erfolgt die Aufnahme meist inhalativ oder oral.
Arsenverbindungen werden im Körper metabolisiert, so dass es nach der Reduktion von Arsen(V) zu Arsen(III) zu einer Methylierung des Arsens kommt. Als Hauptmetabolit beim Menschen entsteht Dimethylarsinsäure. Obwohl eine kanzerogene Wirkung von Arsen in tierexperimentellen Studien nicht eindeutig bewiesen werden konnte, wird Arsen von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als krebserregend eingestuft (HUGHES 2002). Mögliche Wirkungsmechanismen sind die Induktion von Chromosomenabberationen oder der Austausch von Schwesterchromatiden. Dies konnte sowohl in vivo als auch in vitro nachgewiesen werden (LEE et al. 1985). Des Weiteren werden eine Inhibition der DNA- Reparatur und die Methylierung der DNA als epigenetische Mechanismen für die kanzerogene Wirkung von Arsen diskutiert (ZHAO et al. 1997; TAKAHASHI et al. 2002).
Aufgrund eines Mangels an adäquaten In-vivo-Modellen wurde schon früh auf In-vitro- Zelltransformationstests zurückgegriffen, die zumindest zelluläre Effekte anorganischer Arsenverbindungen detektieren können (LEE et al. 1985; TAKAHASHI et al. 2002).
As O
O HO
Na O
Na
Abbildung 5: Strukturformel des Tumorpromotors Natriumarsenat.
2.2.5.3 Natriumsaccharin
Die kanzerogene Wirkung des künstlichen Süßstoffes Saccharin wird seit seiner Entdeckung im Jahr 1879 kontrovers diskutiert. So konnte durch COHEN et al. (1979) ein promovierender Effekt des Saccharins bei der Entstehung von Blasentumoren im Rattenversuch nachgewiesen werden. Eine genotoxische Wirkung, beispielsweise durch die Bindung an die DNA, wurde jedoch von LUTZ und SCHLATTER (1977) ausgeschlossen. Dabei wird diskutiert, ob die Bildung von Kristallen, die durch die Aufnahme bzw. Gabe von hohen Konzentrationen an Saccharin auftreten kann, und die dadurch entstehenden Entzündungsprozesse die tumorpromovierende Wirkung hervorrufen (CLAYSON 1974; HICKS et al. 1975). Solche Entzündungsprozesse, ob durch Kristalle, Strahlen oder Infektionen ausgelöst, fördern die Freisetzung von freien Radikalen aus Makrophagen, die wiederum die DNA schädigen und apoptotische Vorgänge induzieren können. Durch den Zellverlust kann es zur Anregung der Zellproliferation kommen, die für den Prozess der Tumorpromotion notwendig ist (ELLWEIN u. COHEN 1990; SCHULTE-HERMANN et al. 2004, S. 198; BURSCH 2009, S. 43). Eine Hyperplasie des Urothels konnten auch ELLWEIN und COHEN (1990) feststellen, nachdem sie männlichen Ratten Natriumsaccharin in hohen Dosen oral verabreicht hatten. Weibliche Ratten zeigten eine deutlich verringerte Ansprechbarkeit auf die Substanz.
Dies könnte der Tatsache zugeschrieben werden, dass männliche Ratten einen höheren Proteingehalt im Urin aufweisen, der zu einer Bildung von Silikatkristallen führt (ELLWEIN u. COHEN 1990). Dagegen scheinen Mäuse, Affen und Hamster gegen hohe Dosen Saccharin resistent zu sein (ARNOLD et al. 1980; ELLWEIN u. COHEN 1990). Der promovierende Effekt des Saccharins konnte von MONDAL et al. (1978) in embryonalen Mauszellen (C3H/10T1/2) in vitro bestätigt werden, wohingegen andere Studien diese Daten nicht reproduzieren konnten (SIVAK u. TU 1980).
S N
O O O
Na
Abbildung 6: Strukturformel von Natriumsaccharin.
2.3 Alternativmethoden zum Tierversuch
Die Anzahl der in Tierversuchen verwendeten Tiere steigt, wie aktuelle Zahlen des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) belegen (BMELV 2013). So wurden im Jahr 2012 5,8 % mehr Tiere für Tierversuche und andere wissenschaftliche Zwecke eingesetzt als im Vorjahr. Eine Steigerung der Tierzahlen war besonders in der medizinischen Forschung, der biologischen Grundlagenforschung und der Qualitätskontrolle von Medizinprodukten zu verzeichnen. Eine Reduzierung hingegen konnte in toxikologischen oder anderen Sicherheitsprüfungen sowie in der Entwicklung von Produkten für unterschiedliche Sparten der Medizin, beispielsweise der Veterinär- oder Zahnmedizin, registriert werden (BMELV 2013).
Abbildung 7: Tierversuchszahlen der Jahre 2011 und 2012. Gezeigt werden die Tierarten, die am häufigsten verwendet wurden. Daten entnommen aus dem Bericht des BMELV (2013) zum Einsatz von Wirbeltieren in Tierversuchen vom 28.10.2013.
2.3.1 Gesetzliche Vorgaben
Auch wenn In-vivo-Experimente in diversen internationalen und nationalen gesetzlichen Vorschriften direkt oder auch indirekt vorgeschrieben sind (z. B. REACH, EU-Verordnungen zu Tierarzneimitteln oder Pflanzenschutzmitteln sowie nationale Verordnungen wie die MPV oder das PflSchG), rufen sie per se ethische Konflikte hervor, sind sehr kosten- und zeitintensiv und häufig mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für die verwendeten Tiere verbunden. Des Weiteren ist die Extrapolation der Daten auf den Menschen häufig problematisch. Aus diesem Grund wird die Entwicklung und der Einsatz von Ersatz- und Ergänzungsmethoden von der EU konsequent verfolgt und in ihre Legislatur implementiert (LILIENBLUM 2008). In der Verordnung 2010/63/EU vom 22. September 2010 „zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere“ werden alle EU- Mitgliedsstaaten dazu aufgefordert, nach dem 3R-Konzept zu handeln, Tierversuche zu reduzieren, die Entwicklung und den Einsatz von Alternativmethoden zu fördern und ein höheres Schutzniveau für die für Versuche und andere wissenschaftlichen Zwecke verwendeten Wirbeltiere zu gewährleisten (VO 2010/63/EU). Auch für die Chemikalienprüfung im Rahmen von REACH wird deutlich gemacht, dass Tierversuche so weit wie möglich vermieden werden sollen. Dies bedeutet, dass auch für komplexe toxikologische Endpunkte wie Kanzerogenität oder Reproduktionstoxizität vorrangig alternative Methoden eingesetzt werden müssen. Das gilt jedoch nur, solange diese Methoden geeignet sind, vergleichbar sichere Ergebnisse im Hinblick auf die zu testenden toxikologischen Eigenschaften einer Substanz zu liefern wie konventionelle In-vivo- Methoden (LILIENBLUM 2008).
2.3.2 Das 3R-Konzept
Alternativmethoden zum Tierversuch werden definiert als Versuchsanordnungen, in denen anstelle eines lebenden Organismus schmerzfreie Materie eingesetzt wird (LEMBECK 1988, S. 1). Dabei darf die Aussagekraft des Experiments nicht geschmälert oder verändert werden (DFG 2004; LILIENBLUM 2008). Eine breitere Definition basiert im Wesentlichen auf dem Konzept der englischen Wissenschaftler RUSSELL und BURCH (1959), das sie zur Minimierung des Leidens von Tieren entwickelten. Dieses sog. 3R-Konzept nennt die im
Folgenden genannten Ziele, welche durch den Einsatz von Ersatz- und Ergänzungsmethoden erreicht werden sollen:
(1) Replacement: Der Ersatz von In-vivo-Studien durch tierversuchsfreie Methoden kann als oberstes Ziel angesehen werden (VAN ZUTPHEN et al. 1995, S. 5). Möglich ist aber auch die Substitution nur eines Teils des Tierversuchs durch beispielsweise In- vitro- oder computerbasierte, sog. In-silico-Methoden. Durch solche partiellen Ersatzmethoden können bereits heute Tiere, z. B. in der Kanzerogenitätsprüfung von Chemikalien, eingespart werden.
(2) Reduction: Die Reduzierung der Anzahl an Tierversuchen und/oder Tierzahlen innerhalb der Versuche kann zum einen durch ergänzende Methoden (siehe auch Replacement) und zum anderen durch eine exakte Versuchsplanung und ein optimales Versuchsdesign erreicht werden (DFG 2004). Beide Faktoren sind für einen größtmöglichen Erkenntnisgewinn ausschlaggebend.
(3) Refinement: Verbesserung der Lebensbedingungen der Versuchstiere. Durch eine Optimierung und Standardisierung von In-vivo-Studien sowohl in der Haltung der Tiere als auch in der Versuchsdurchführung ist es möglich, einen erheblichen Beitrag zur Minimierung von Schmerzen, Leiden oder Schäden der Tiere zu leisten (STAUFFACHER 1993, S. 7; VAN ZUTPHEN et al. 1995, S. 5; DFG 2004).
Die Methoden, die einen wertvollen Beitrag zur Erfüllung des 3R-Konzeptes leisten, sind vielfältig. Sie reichen vom Einsatz niederer Organismen bzw. höherer Pflanzen und Mikroorganismen über die Verwendung von In-vitro-Techniken (Zellkultur, immunologische Verfahren) bis hin zu In-silico-Verfahren. Letztere, nicht-experimentelle Methoden ermitteln anhand einer computergestützten Simulation mögliche Beziehungen zwischen der Struktur einer Substanz und seiner biologischen/biochemischen Aktivität („QSAR“: quantitative oder qualitative Struktur-Wirkungs-Beziehungen) (P. LIU u. LONG 2009).
In Deutschland wurden bereits im Juli 1972 im Rahmen des ersten Tierschutzgesetzes der Bundesrepublik Vorschriften zur Durchführung von Tierversuchen zu Forschungszwecken und der Schutz von Versuchstieren auf ethischer Basis formuliert. Das deutsche Tierschutzgesetz, das 2013 erneut geändert wurde, beinhaltet genaue Angaben, zu welchem Zweck Tierversuche durchgeführt werden dürfen (§ 7), und die Forderung, die Anzahl der
durchgeführten Versuche auf ein unerlässliches Maß zu beschränken (§ 9). Bei der Entscheidung, ob ein Versuch unerlässlich ist, ist insbesondere der jeweilige Kenntnisstand der Wissenschaft zugrunde zu legen und zu prüfen, ob der verfolgte Zweck nicht durch andere Methoden oder Verfahren erreicht werden kann (TSchG 2013).
Mit dem Ziel, in Deutschland das 3R-Konzept vermehrt in das Gebiet der toxikologischen Forschung zu integrieren und die Entwicklung tierversuchsfreier Testmethoden zu fördern, wurde als erste staatliche Institution im Jahr 1989 die Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET) ins Leben gerufen (SPIELMANN et al. 2008). Die ZEBET pflegt u. a. eine Datenbank (AnimALT- ZEBET), die Informationen über wissenschaftlich bewertete Alternativmethoden enthält (ZEBET 2013). Mit der Gründung des European Center ort he Validation of Alternative Methods (ECVAM) im Jahr 1993 und äquivalenter Zentren in den USA und Japan wurde der Weg für eine internationale Koordination und Harmonisierung der Entwicklung und Validierung von Alternativmethoden geebnet (SPIELMANN et al. 2008).
Hauptverantwortlich für die weltweite Koordination dieser Einrichtungen und die internationale Akzeptanz validierter Testmethoden ist die OECD, welche die zunächst wissenschaftlich, danach auf nationaler („regulatorisch“) und schlussendlich auf internationaler Ebene anerkannte Methode in eine Testrichtlinie (testing guideline) umwandelt. Die OECD-Anerkennung als Testrichtlinie ist die Voraussetzung dafür, dass gewonnene Daten weltweit gegenseitig akzeptiert werden. Sie ist durch ein internationales Abkommen geregelt (LILIENBLUM 2008). Die gegenseitige Akzeptanz bereits generierter Daten hat den Vorteil, dass Mehrfachtestungen vermieden und damit Tiere, Kosten und Zeit eingespart werden können (LILIENBLUM 2008).
Nach Meinung der Experten sind jedoch die Vorgaben, die durch die EU-Legislatur (z. B. die Kosmetik-VO oder REACH) im Hinblick auf den Einsatz von Alternativmethoden in der Sicherheitsprüfung von Chemikalien vorgeschrieben sind, für die meisten toxikologischen Endpunkte nicht umsetzbar (LILIENBLUM 2008). Bis heute gibt es nur wenige In-vitro- Testmethoden für diesen Bereich, welche durch eine OECD-Implementierung in eine Testrichtlinie international akzeptiert sind. Dazu gehören beispielsweise die OECD- Testrichtlinien Nr. 430 (Transcutaneous Electrical Restistance Test (TER)) oder Nr. 431 (Skin
Corrosion: Human Skin Model Test, EpiSkinTM), anhand derer die ätzende und reizende Wirkung einer Chemikalie auf die Haut geprüft werden kann (OECD 2013b).
Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren liegt die Vermutung nahe, dass besonders bei der Untersuchung komplexer toxikologischer Endpunkte wie die systemische Toxizität, Sensibilisierung (Allergieauslösung), Reproduktionstoxizität oder Kanzerogenität von Chemikalien derzeit und auch in naher Zukunft nicht auf den Einsatz etablierter In-vivo- Modelle verzichtet werden kann (LILIENBLUM 2008).
2.3.3 Kanzerogenitätsprüfung von Chemikalien
Nicht zuletzt durch fehlende Erkenntnisse im Prozess der Krebsentstehung, ihre hochgradige Komplexität sowie multifaktorielle Ursachen ist es bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht möglich, den vollständigen Prozess der chemischen Kanzerogenese in vitro zu simulieren (SPIELMANN et al. 2011). Aus diesem Grund muss weiterhin der sog. Lifetime rodent bioassay nach der OECD-Testrichtlinie Nr. 451 durchgeführt werden. Er liefert Informationen über mögliche Gesundheitsrisiken durch eine Langzeitexposition, über toxische Effekte und mögliche Zielorgane einer chemischen Substanz (OECD 2009; SPIELMANN et al. 2011).
Dennoch können auch in diesem Gebiet kleine Erfolge und Fortschritte in der tierversuchsfreien Sicherheitsprüfung von Chemikalien mit Hilfe experimenteller als auch nicht-experimenteller Methoden verzeichnet werden. So zeigte ein im Juni 2011 publizierter Bericht der Europäischen Chemikalienagentur (ECHA) über die Verwendung von Alternativmethoden im Rahmen der REACH-Verordnung, dass wider Erwarten keine signifikante Erhöhung der Tierzahlen in toxikologischen Studien registriert werden konnte (ECHA 2011; SPIELMANN et al. 2011). In Bezug auf den zu prüfenden Endpunkt
„kanzerogenes Potenzial“ bedeutet das, dass in der ersten Registrierungsperiode, in der die Dossiers für alle Chemikalien mit einem Produktions- oder Importvolumen von
≥ 1.000 Tonnen pro Jahr eingereicht werden mussten, nur in etwas mehr als einem Drittel (38,7 %) der Endpunktstudien In-vivo-Methoden durchgeführt wurden (ECHA 2011). Im Umkehrschluss heißt das, dass in fast zwei Dritteln aller Kanzerogenitätsstudien tierversuchsfreie Methoden zum Einsatz kamen. Beispiele dafür sind die Übertragung von Daten strukturell verwandter Stoffe oder die Auswertung von Gruppentrends (read across oder grouping), der Verzicht auf die Ermittlung von Daten, wenn das Ergebnis
