BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit metabolisierendem System

A B

C

4.2.5 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit metabolisierendem System

Um auch die Substanzen im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest adäquat zu untersuchen, die in vivo zunächst metabolisch aktiviert werden, wurde dem oben beschriebenen Testsystem ein exogenes metabolisierendes System vorgeschaltet. Dieses Aktivierungssystem sollte die initiierend wirksamen Substanzen so verstoffwechseln, dass ihre Metabolite im Testverfahren ihre vollständige transformierende Wirkung entfalten.

4.2.5.1 S9-Mix

Es wurde S9 der Firma Biopredic International (Rennes, Frankreich) und der Firma Trinova Biochem GmbH (Gießen) getestet. Um die Aktivität fremdstoffmetabolisierenden Enzyme im S9 zu erhöhen, wurden die Tiere, die zur Gewinnung des S9 eingesetzt wurden, vorher mit Aroclor 1254 (Trinova Biochem GmbH) bzw. Phenobarbital und β-Naphthoflavon (Biopredic International) behandelt.

Der S9-Mix besteht aus S9 (5 oder 10 %-ig) und BALB/c-3T3-Zellkulturmedium (Zusammensetzung: Tabelle 6), das nach einem Protokoll von ASADA et al. (2005) mit den

Abbildung 12: Merkmale eines Focus Typ III:

A) Starke basophile Färbung B) Spindelförmige Zellen (Pfeile)

C) Criss-crossing, besonders am Rand des Focus zu erkennen (Pfeile)

folgenden Zusätzen angereichert wurde: 5 mM MgCl₂, 33 mM KCl, 5 mM Glucose-6-Phosphat, 4 mM β-NADP⁺, 2 mM HEPES. Dem S9-Mix der Firma Biopredic International wurde zusätzlich 0,6 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase hinzugefügt.

Zusätzlich zu den im klassischen Protokoll eingesetzten Behandlungsgruppen (Tabelle 15) wurden die Zellen folgendermaßen behandelt:

Tabelle 18: Behandlungsprotokoll des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests zur Prüfung von Prokanzerogenen mit S9-Mix als metabolisierendes Aktivierungssystem. Mix: Medium mit Zusätzen, aber ohne S9, MW: Mediumwechsel, TS: Testsubstanz.

Behandlungsgruppen

Tag 22-42 Siehe klassisches Protokoll

Behandlung der Zellen an Tag 1 des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests:

(1) Die Zusätze wurden in den oben genannten Konzentrationen in einem Becherglas unter Rühren direkt im erwärmten Zellkulturmedium gelöst. Im Anschluss wurde der pH-Wert auf 7,4 (pH-Meter Lab 850, Schott AG, Mainz) eingestellt und der Mediummix steril filtriert.

(2) Pro Behandlungsgruppe wurden nun die aufgetauten Stammlösungen jeder Testsubstanzkonzentration in einem Verhältnis von 1:1.000 mit dem zuvor angesetzten Mediummix verdünnt, welches zuvor in einem 15 ml-Zellkulturröhrchen vorgelegt wurde. In den Kontrollgruppen wurde das ursprüngliche Zellkulturmedium verwendet.

(3) Das S9 wurde schonend aufgetaut und bis zu seiner Verwendung auf Eis gelagert. Der Proteingehalt wurde durch Verdünnen mit Mediummix auf ca. 20 mg/ml eingestellt. Das

S9 der Firma Biopredic International (Rennes, Frankreich) wurde unverdünnt verwendet, da der Proteingehalt bei 21 mg/ml lag.

(4) Es erfolgte die Behandlung der Zellen mit den Testsubstanzen. Danach wurde in jedes der Wells einzeln die entsprechende Menge S9 (5 oder 10 % in 2 ml Mediummix) pipettiert. Erst im Anschluss daran wurden die Kontrollzellen behandelt.

(5) Die Zellkulturtestplatten wurden im Brutschrank gelagert.

(6) Nach drei Stunden wurden die Zellen, die mit den Testsubstanzen und S9-Mix inkubiert wurden, einmal mit PBS gewaschen und wieder mit frischem Zellkulturmedium versehen.

(7) An Tag 4 erfolgte ein Mediumwechsel. Die weitere Behandlung der Zellen verlief nach dem klassischen Protokoll des Zwei-Stufen-BALB/c-3T3-Zelltransformationstests.

4.2.5.2 Zelllinie HepaRG^®

Der Versuch, die Zelllinie HepaRG^® als metabolisierendes Aktivierungssystem in den BALB/c-3T3-Zelltransformationstest zu integrieren, wurde auf zwei verschiedenen Wegen unternommen:

1) Übertragung des Mediumüberstandes der HepaRG^®-Zellen auf die BALB/c/3T3-Zellen

diff.

Abbildung 13: Schematische Darstellung des Behandlungsablaufs für die Prüfung von AFB1 im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit ausdifferenzierten (diff.) HepaRG^®-Zellen als metabolisierendes System.

Die HepaRG^®-Zellen wurden ca. fünf Wochen vor Versuchsbeginn in 6-Well-Zellkulturtestplatten eingesät (200.000 Zellen/Well) und solange kultiviert, bis sie vollständig ausdifferenziert waren (Kapitel 4.2.1.3). Um die Zellpopulation zu synchronisieren, wurden

die Zellen 24 Std. vor Versuchsbeginn mit FBS-freiem Differenzierungsmedium versorgt.

Das Verdünnen der Testsubstanz und die Behandlung der HepaRG^®-Zellen erfolgte wie für die BALB/c-Zellen beschrieben. Jedoch wurde das AFB1 (Konz. 0,1-10 µM) in FBS- und DMSO-freiem Differenzierungsmedium verdünnt. Zeitgleich mit der 24 Std.-Behandlung der HepaRG^®-Zellen wurden in weiteren 6-Well-Zellkulturtestplatten BALB/c-3T3-Zellen (5.000 Zellen/Well) eingesät. Dabei wurden ausreichend Zellkulturtestplatten eingesät, um im gleichen Testverlauf einen BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ohne metabolische Aktivierung des AFB1 als Kontrolle durchführen zu können. Die unterschiedlichen Behandlungszeiten wurden so begonnen, dass die Übertragung des Mediumüberstandes zu einem Zeitpunkt (Tag 1 des BALB/c-3T3- Zelltransformationstests) stattfand (siehe Abbildung 14). Die BALB/c-3T3-Zellen wurden über 72 Std. mit dem Mediumüberstand inkubiert, dem zusätzlich noch 1 ml BALB/c-Medium hinzugefügt wurde. Im Anschluss wurden sie nach dem klassischen Protokoll des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests weiter behandelt.

Behandlung der HepaRG^®-Zellen Klassischer BALB/c-3T3-Zelltransformationstest

Initiationsphase

Behandlung der HepaRG^®-Zellen Klassischer BALB/c-3T3-Zelltransformationstest

Initiationsphase Promotionsphase

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Abbildung 14: Behandlungsschema für die Übertragung des Mediumüberstandes der HepaRG^®-Zellen nach der Behandlung mit AFB₁.

2) Verwendung eines Transwell-Systems

Das Transwell-System macht die Kokultivierung zweier Zelllinien möglich. Durch eine semipermeable Membran wird das System mittels eines Einsatzes (insert) in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilt. Dieser Versuchsaufbau erfolgte unter Verwendung eines 12-Well-Formates. Auch hier wurde das Prokanzerogen AFB1 in den Konzentrationen

0,1-10 µM getestet. Die 12-Well-Transwell-Systeme (Corning Incorporated, U.S.A) wiesen einen Membrandurchmesser von 12 mm, eine Porengröße von 0,4 µm und eine Wachstumsfläche von 1,12 cm² auf.

Die HepaRG^®-Zellen wurden ca. fünf Wochen vor Versuchsbeginn mit 32.500 Zellen pro insert eingesät. Zu Versuchsbeginn (Tag 0) wurden die BALB/c-3T3-Zellen in die 12-Well-Zellkulturtestplatten eingesät (2.055 Zellen/Well). 24 Std. später (Tag 1) erfolgte die

„Behandlung“ der Zellen, indem die inserts mit den HepaRG^®-Zellen über die eingesäten BALB/c-3T3-Zellen gesetzt wurden. Wie in Abbildung 15 schematisch dargestellt, wurden nun die in FBS- und DMSO-freiem Differenzierungsmedium verdünnten Testsubstanzen auf die HepaRG^®-Zellen gegeben. Das Zellkulturmedium der BALB/c-3T3-Zellen im unteren Kompartiment des Transwell-Systems wurde nicht erneuert. Nach einer Inkubationszeit von 72 Std. wurde das insert mit den HepaRG^®-Zellen verworfen und das Zellkulturmedium der Zellen erneuert. Es wurde wie im klassischen Protokoll des Zelltransformationstest fortgefahren. Als Kontrolle wurden parallel BALB/c-3T3-Zelltransformationstests ohne eine metabolische Aktivierung der Testsubstanz im 12-Well-Format durchgeführt.

Abbildung 15: Schematische Darstellung des Behandlungsablaufs für die Testung von AFB₁ im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit der Zelllinie HepaRG^® als metabolisierendes Aktivierungssystem. Die HepaRG^®-Zellen werden mit den BALB/c-Zellen im Transwell-System kokultiviert und nach der Initiationsphase (72 Std.) entfernt.