Allgemeine Zellkultur

Alle Zellkulturarbeiten, ausgenommen das Fixieren und Färben der Zellen, wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sicherheitswerkbank (Herasafe KS, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold) durchgeführt. Die Materialien, Lösungen und Medien wurden, sofern nicht steril verpackt geliefert, autoklaviert bzw. steril filtriert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Inkubator bei 37 °C in 5 %-iger Kohlenstoffdioxid-Atmosphäre.

4.2.1.1 Ansetzen der Medien

Alle Medien und Zusätze wurden vor ihrer Verwendung im Wasserbad aufgetaut und auf 37 °C erwärmt. Anschließend wurden die einzelnen Zusätze dem Basalmedium zugesetzt. Die Zusammensetzung der verschiedenen Medien ist in Kapitel 4.1.2.2 beschrieben. Danach erfolgte die Filtration mittels eines Sterilfilters. Die Zusammensetzung des Proliferations- und Differenzierungsmediums für die Zelllinie HepaRG^® erfolgte nach LEREAU et al. (2012).

Um das Differenzierungsmedium zu erhalten, wurden 500 ml des Proliferationsmediums durch die Zugabe von 9 ml DMSO und 25 µl EGF ergänzt.

4.2.1.2 Auftauen der Zellen

Zunächst wurde eine T75-Zellkulturflasche unter Verwendung einer 20 ml-Glaspipette und der Pipettierhilfe mit ca. 20 ml des entsprechenden Erhaltungsmediums bestückt. Danach wurde das Kryoröhrchen, welches die Zellen enthielt, aus dem Stickstofftank entnommen, zügig aufgetaut und der Inhalt in die T75-Zellkulturflasche überführt, welche in den Inkubator gestellt wurde. Nach vier bis fünf Stunden erfolgte ein Mediumwechsel, nachdem mikroskopisch sichergestellt wurde, dass ein Großteil der Zellen adhärent war. Die HepaRG^® -Zellen benötigten mindestens sechs Stunden, um zu adhärieren.

4.2.1.3 Subkultivierung und Kultivierung der Zellen

Waren die Zellen ca. 80 % konfluent, wurden sie passagiert. Die Subkultivierung der Zellen, welche bei allen Zelllinien etwa gleich ablief, begann mit dem Absaugen des Zellkulturmediums unter Zuhilfenahme einer Pasteurpipette und der Absaugpumpe. Danach wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Je nach Größe der Zellkulturflasche wurden dabei 1-5 ml PBS verwendet. Im Anschluss wurden die Zellen durch die Zugabe von Trypsin/EDTA (1-5 ml), das die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen aufbricht, für 3-5 Min. im Inkubator vereinzelt. Gestoppt wurde die enzymatische Reaktion des Trypsins durch die Zugabe von etwa 5 ml des jeweiligen Zellkulturmediums. Die so erhaltene Zellsuspension wurde in ein 15 ml-Zellkulturröhrchen überführt und bei 500 x g für 5 Min. zentrifugiert. Der so gewonnene Mediumüberstand wurde anschließend abgesaugt und das Zellpellet in einem entsprechenden Volumen (meist 10 ml) Zellkulturmedium resuspendiert. Die Zelllinie HepaRG^® wurde nicht zentrifugiert. Die Zellen wurden direkt nach ihrer Ablösung von der Zellkulturflasche gezählt. Für die Bestimmung der vorhandenen Zellzahl wurden 20 µl der Zellsuspension in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Außerhalb der Sicherheitswerkbank wurden diesen 180 µl Trypanblau hinzugefügt, um ein Verdünnungsverhältnis von 1:10 zu erreichen. Mithilfe einer Neubauer-Zählkammer wurde die Zellzahl/ml Zellsuspension ermittelt, indem die Zellen in vier Quadraten der Zählkammer ausgezählt, ein Mittelwert berechnet, und dieser mit dem Verdünnungsfaktor zehn und weiter mit dem Kammerfaktor 10.000 multipliziert wurde. Das berechnete Volumen an Zellsuspension, das die benötigte Zellzahl enthielt, wurde danach in die bereits mit 5 ml (T25) bzw. 20 ml (T75) des entsprechenden Zellkulturmediums vorbereitete Zellkulturflasche überführt. Bevor sie im

Inkubator bei 37 °C (5 % CO₂) gelagert wurden, wurde die Zellkulturflasche vorsichtig geschwenkt, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erreichen.

Eine Erneuerung des Mediums aller Zelllinien erfolgte alle zwei bis drei Tage. Im Zuge der Subkultivierung oder des Mediumwechsels wurden die Zellen mittels Lichtmikroskop auf ihre Morphologie und die Zelldichte hin untersucht. Des Weiteren wurden mögliche Kontaminationen ausgeschlossen.

Die Kultivierung der Zelllinie HepaRG^® erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Biopredic International). Nach dem Auftauen wurden die Zellen über 14 Tage mit Proliferationsmedium (Tabelle 6) versorgt. Ein Mediumwechsel fand alle zwei bis drei Tage statt. Erst danach wurden die Zellen passagiert, in die entsprechenden Zellkulturtestplatten eingesät und für weitere 14 Tage mit Proliferationsmedium versorgt. Im Anschluss daran erfolgte die Differenzierungsphase, in der die Zellen über mindestens 14 weitere Tage mit Differenzierungsmedium, das zusätzlich DMSO und EGF enthielt, kultiviert wurden. Nach Ablauf der zwei Wochen andauernden Differenzierungsphase waren die Zellen vollständig ausdifferenziert und konnten für eine Dauer von vier Wochen im Versuch verwendet werden.

4.2.1.4 Kryokonservierung der Zellen

Jeweils zu Beginn der Arbeit mit den verschiedenen Zelllinien wurden von jeder verwendeten Zelllinie Aliquots mit der gleichen Passagenzahl eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Dabei wurden die Zellen nach Erreichen der Subkonfluenz, wie in Kapitel 4.2.1.3 beschrieben, passagiert. Nachdem die Zellzahl bestimmt wurde, konnte die Menge an Kryoröhrchen definiert werden, die eingefroren werden sollte. Es wurden ca. 1 bis 1,5 Million Zellen pro Kryoröhrchen eingefroren. Die Zellsuspension, die für die definierte Anzahl an Kryoröhrchen benötigt wurde, wurde noch einmal zentrifugiert. Anschließend wurde die passende Menge an Einfriermedium hinzugegeben, so dass je ein Milliliter mit je einer Million Zellen in jedes Kryoröhrchen überführt werden konnte. Das Einfriermedium bestand aus 70 % des entsprechenden Zellkulturmediums, 20 % FBS und 10 % DMSO. Die Zellen wurden unmittelbar danach im Mr. Frosty-Freezing Container bei - 80 °C gelagert. Einen Tag später erfolgte die Überführung der Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff.

4.2.1.5 Einsaat der Zellen

Für die Einsaat der verschiedenen Zelllinien in die Testplatten wurden die Zellen zunächst, wie in Kapitel 4.2.1.3 beschrieben, passagiert. Die einzusäende Zellzahl und das benötigte Mediumvolumen wurden berechnet. Danach wurde die entsprechende Zahl an Zellen in die unterschiedlichen Plattenformate eingesät. Dies wird bei der Beschreibung des jeweiligen Testsystems näher erläutert. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurde das entsprechend benötigte Volumen der Zellsuspension in die in einer Glasflasche vorgelegte Mediummenge überführt. Die Zellen verblieben daraufhin mindestens 24 Stunden im Brutschrank, bevor sie weiter behandelt wurden. Nach dem Auftauen wurden die BALB/c-3T3- und die D-GBM-Zellen mindestens einmal passagiert, bevor sie im Versuch verwendet wurden.

4.2.1.6 Fixierung und Färbung der Zellen

Am Ende des Plattierungseffizienztests (Tag 10/11) und des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests (Tag 42) wurden die Zellen fixiert und gefärbt. Alle Lösungen wurden kalt bis eiskalt verwendet. Im ersten Schritt wurden die Zellen zweimal mit PBS-Lösung gewaschen. Dabei wurde das Zellkulturmedium vorsichtig abgesaugt und mit Hilfe einer Multipette^® (Eppendorf AG, Hamburg) in jedes Well 1 ml PBS pipettiert und wieder abgesaugt. Im nächsten Schritt wurden 2 ml eines PBS-Methanol-Gemisches (1:1) in jedes Well gegeben und für 2-3 Min. auf den Zellen belassen. Daraufhin folgte die Fixierung der Zellen durch eine zehnminütige Inkubation mit 2 ml eiskaltem, reinem Methanol.

Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 1 ml Methanol gewaschen. Direkt danach erfolgte die Färbung der Zellen. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit 2 ml Giemsa-Färbelösung (0,76 %ig in einem Methanol/Glycerin-Gemisch) für 2-3 Min. inkubiert, bevor die Färbelösung durch die Zugabe von 4 ml destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:3 verdünnt wurde. Nach weiteren 2-3 Min Inkubation wurde die Färbelösung abgesaugt, und die Platten mit sanft fließendem Leitungswasser so lange gespült, bis das Spülwasser klar abfloss. Die Platten wurden vor der Auswertung bei Raumtemperatur getrocknet.