Versuche mit transplantierten Mäusen

Um die ligandenabhängige Funktion des chimären GMR in vivo zu untersuchen, wurden R702 GMR und R780 GMR exprimierende murine lineage-negative Knochenmarkszellen in konditionierte Mäuse transplantiert. Zuerst wurde der Effekt von subkutanen Injektionen mit hGM-CSF auf das frühe Engraftment transplantierter Mäuse untersucht und anschließend die Hämatopoese der Mäuse nach Rekonstitution ab 5 Wochen nach Knochenmarkstransplantation mit subkutanen Injektionen von hGM-CSF stimuliert. Als Negativkontrolle wurden murine lineage-negative Knochenmarkszellen mit R780 transduziert und diese Zellen in konditionierte Empfängertiere transplantiert.

3.3.9.1 Gabe des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors während des frühen Engraftments

Zur Untersuchung des Effektes von subkutanen Injektionen mit hGM-CSF auf das frühe Engraftment wurden murine lineage-negative Knochenmarkszellen mit den retroviralen Vektoren R780 und R780 GMR transduziert und anschließend in konditionierte Empfängertiere transplantiert. Subkutane Injektionen erfolgten von Tag 3 bis Tag 42 nach der Transplantation.

Die für diesen Versuch verwendeten Tiere bildeten drei Gruppen:

• R780 GMR-Mäuse, die Injektionen mit hGM-CSF bekamen, bildeten die Versuchsgruppe (12 Tiere)

• R780 GMR-Mäuse, die Injektionen mit PBS bekamen, bildeten die Kontroll- gruppe 1 (12 Tiere)

• R780-Mäuse, die Injektionen mit hGM-CSF bekamen, bildeten die Kontrollgruppe 2 (6 Tiere)

Die Tiere bekamen 3 x in der Woche 200 µl PBS bzw. 2 µg hGM-CSF gelöst in 200 µl PBS subkutan injiziert. Vier Wochen nach der Transplantation erfolgte eine Blutentnahme, um ein Blutbild zu erstellen und den Anteil der GFP-positiven Leukozyten im peripheren Blut zu bestimmen. Nach Fortsetzung der Injektionen erfolgten weitere Blutentnahme 5 und 6 Wochen nach der Transplantation

3.3.9.2 Gabe des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors ab 5 Wochen nach der Transplantation

Für den Versuch, die Hämatopoese transplantierter Mäuse durch Injektionen mit hGM-CSF zu stimulieren, wurden 19 Tiere mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit R702 GMR oder R780 GMR und 6 Kontrolltiere mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit den viralen Vektoren SEW oder R780 transplantiert. Alle Tiere bekamen Injektionen mit hGM-CSF. Die Versuche wurden 5–33 Wochen nach der Transplantation durchgeführt. An Tag 1 des Experimentes wurde diesen Tieren Blut entnommen. Von Tag 1 bis Tag 7 erfolgten subkutane Injektionen mit hGM-CSF (10 µg/ml PBS), gefolgt von einer weiteren Blutentnahme an Tag 8. Die unterschiedlichen Dosierungen von hGM-CSF sind in Tabelle 12 angegeben. Die Differenzen

der Leukozytenzahlen und die Differenzen des prozentualen Anteils GFP-positiver Leukozyten im Blut vor und nach den Injektionen wurden ermittelt. Aus den Werten wurde der Median gebildet. Wurden mehrere Werte für ein Tier ermittelt, so wurden diese Werte zu einem Median zusammengefasst und mit diesem weiter gerechnet.

3.3.9.3 Durchführung eines Over-Cross-Experimentes

Das Experiment wurde als Over-Cross-Experiment, in dem jedes Tier gleichzeitig als Kontrolle diente, durchgeführt (Abb. 11). Dazu wurden die 16 Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt. Je 8 R780 GMR-Mäuse bekamen in einem Zeitraum von 14–33 Wochen nach der Transplantation zweimal täglich Injektionen mit 50 µl PBS oder 0,5 µg hGM-CSF gelöst in 50 µl PBS. Im ersten Teil des Experimentes erfolgte an Tag 1 des Versuches eine Blutentnahme, ab Tag 1 bis Tag 7 erfolgten die subkutanen Injektionen des ersten Injektionszyklus und anschließend eine Blutentnahme an Tag 8. Der zweite Teil des Experimentes in dem jede Maus die jeweils andere Medikation bekam, begann an Tag 15 mit einer Blutentnahme mit anschließenden subkutanen Injektionen von Tag 15–22. An Tag 23 wurde Blut entnommen. Insgesamt wurden bei allen Mäusen vier Blutentnahmen durchgeführt, um Blutbilder zu erstellen und um die GFP-Expression im Durchflusszytofluorometer zu messen. Für jede Maus wurden die Differenzen der Leukozytenzahl und des prozentualen Anteils der GFP-positiven Leukozyten vor und nach den Injektionszyklen gebildet.

Tabelle 12: Dosierungsschemata des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors zur subkutanen Injektion in transplantierte Mäuse.

Dosierungsschema Volumen pro Injektion 0,5 µg 2 x täglich 50 µl

1,0 µg 1 x täglich 100 µl 2,0 µg jeden 2. Tag 200 µl

Gruppe 1 (8 Tiere):

Gruppe 2 (8 Tiere):

Abbildung 11: Abfolge der subkutanen Injektionen bei 16 R780 GMR-Mäusen im Over-Cross-Experiment 14–33 Wochen nach der Transplantation.

Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Salzlösung; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; R780 = retrovirales Plasmid; GMR = der chimäre Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; R780 GMR-Maus = Maus, die mit murinen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit R780 GMR transplantiert wurde

3.3.9.4 Tansplantation von die GMR V449E und die GMR I374N exprimierenden Knochenmarkszellen

Zum Nachweis der möglichen Induktion einer hämatologischen Erkrankung mit dem in dieser Arbeit verwendeten Knochenmarkstransplantationsprotokoll wurden jeweils sieben Tiere mit Knochenmarkszellen transplantiert, die die GMR I374N oder die GMR V449E exprimierten. Die transplantierten Mäuse bekamen aufgrund der konstitutiven Rezeptoraktivierung keine Injektionen mit hGM-CSF. Bei den sieben Mäusen, die mit murinen lineage-negativen, die GMR V449E exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden (V449E-Mäuse), wurden 8, 13, 17 und 26 Wochen nach der Transplantation Blut entnommen und im Hämatologiesystem und im

Zeit in Tagen

1 7 8 15 22 23

Zeit in Tagen

1 7 8 15 22 23

Injektionen mit PBS Injektionen mit hGM-CSF Blutentnahme

Durchflusszytofluorometer untersucht. Bei den sieben Mäuse, die mit murinen lineage-negativen, die GMR I374N exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden (I374N-Mäuse), erfolgten Blutuntersuchungen nach 8, 10, 13, 17 und 26 Wochen nach der Transplantation.

Tiere, die klinsch erkrankten, wurden nach Blutentnahme getötet und pathologisch anatomisch und histologisch untersucht. Die gewonnenen, nicht aufgereinigten Knochenmarkszellen wurden nach Optilyse nach Herstelleranweisung im Durchflusszytofluorometer untersucht. Kolonie-Assays wurden mit 1 x 10⁵ nicht aufgereinigten Knochenmarkszellen in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO) und in Methylzellulose ohne Zytokine angesetzt. Nach Bebrütung der Kolonie-Assays bei 37 °C wurden die entstandenen Kolonien an Tag 11 gezählt. Im Fluoreszenzlicht wurde zusätzlich die Anzahl der GFP-positiven Kolonien ermittelt. Zur Kontrolle wurden 12 Tiere mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit R780 transplantiert und in einem Zeitraum von 5–47 Wochen nach der Transplantation mittels Hämatologiesystem auf hämatologische Erkrankungen untersucht.