Isolierung von Stammzellen

3.3.5.1 Gewinnung von murinem Knochenmark

Acht bis zwölf Wochen alte, männliche C57 BL/6J Mäuse wurden nach Betäubung mit Diethylether durch zervikale Dislokation getötet. Femur und Tibia wurden an der sterilen Werkbank frei präpariert und die einzelnen Knochen in PBS mit 2 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure und 0,5 % BSA (Aufreinigungspuffer) gelagert. Jeder präparierte Knochen wurden mit einer Pinzette gehalten und das distale Knochenende durch einen Scherenschnitt möglichst weit distal geöffnet. In das proximale Knochenende wurde durch drehende Bewegung eine 23 G x 1 ¼“ Kanüle eingeführt und mit einer 1 ml Spritze das Knochenmark aus dem Knochen in 5 ml Aufreinigungspuffer in eine 6-Loch-Platte gespült.

Der Vorgang des Ausspülens wurde wiederholt, wenn nötig wurde die Durchspülrichtung geändert, bis der verbleibende Knochen frei vom Knochenmark und somit weiß war. Nach Suspension der Zellen wurden diese in ein 50 ml Kunststoffröhrchen überführt. Die

Bestimmung der Zellzahl erfolgte in einer Zählkammer nach Neubauer. Dazu wurde ein Aliquot der Zellsuspension nach Bedarf mit Trypanblaulösung (zur Anfärbung der Zellmembran toter Zellen) verdünnt und in die mit Deckglas versehene Zählkammer pipettiert. Unter dem Mikroskop wurden vier Quadrate ausgezählt. Die Zellzahl pro ml konnte wie folgt ermittelt werden:

gezählte Zellen : 4 ∗ Verdünnungsfaktor ∗ 10⁴ = Zellzahl/ml.

3.3.5.2 Gewinnung muriner lineage-negativer Knochenmarkszellen

Mithilfe der magnetischen Zellaufreinigung (magnetic cell sorting = MACS) konnten murine lineage-negative Zellen (angereichert für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen) aus Mausknochenmarkszellen durch Depletion aufgereinigt werden (Abb. 10). Dazu wurden die gewonnenen Knochenmarkszellen bei 1000 Umdrehungen pro Minute und 10 °C 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen und 1 x 10⁷ Zellen in 40 µl Aufreinigungspuffer und 10 µl Antikörpercocktail (bestehend aus biotinylierten Antikörpern gegen folgende Differenzierungsantigene [cluster of differentiation, CD]: mCD5, mCD45/B220, mCD11b, mLy6G/Gr1 und mTer119) aufgenommen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 6–12 °C wurden pro 1 x 10⁷ Zellen 30 µl Aufreinigungspuffer und 20 µl Suspension mit Antikörpern, an die magnetische Partikel (Microbeads) gekoppelte sind, hinzugefügt und gemischt. Nach 15 Minuten Inkubation bei 6–12 °C erfolgte ein Waschschritt der nun markierten Zellen mit 15 ml Aufreinigungspuffer mit anschließender Zentrifugation bei 1000 Umdrehungen pro Minute und 10 °C für 10 Minuten. Der Überstand wurde abpipettiert und die Zellen in entgastem, eisgekühltem Aufreinigungspuffer aufgenommen. Die Zellzahl wurde auf 1 x 10⁸ Zellen pro ml eingestellt. Nach dem Vorbereiten des Magnetständers, der Midi-Magneten, der LS-Säulen und der 30 µm Filter an der sterilen Werkbank wurde jede Säule und jeder Filter zum Equilibrieren mit 3 ml entgastem, eisgekühltem Aufreinigungspuffer gespült. Danach wurden maximal 1 x 10⁸ Zellen über einen Filter auf eine Säule gegeben und die Säulen nach vollständigem Einsickern der Zellen dreimal mit 3 ml entgastem, eisgekühltem Aufreinigungspuffer gespült. Lineage-negative Zellen und die Spülflüssigkeit wurden in einem Kunststoffröhrchen gesammelt. Nach Entnahme der Säule aus dem Magneten konnten lineage-positive Zellen ausgespült werden.

Abbildung 10: Schematische Darstellung der magnetischen Zellsortierung.

Nach Markierung mit Antikörpern mit Microbeads werden die Zellen über MACS-Säulen durch Depletion auf-gereinigt (modifiziert nach Miltenyi Biotec).

Abkürzung: MACS = magnetic cell sorting, magnetische Zellsortierung

3.3.5.3 Kultivierung von murinen lineage-negativen Zellen

Die im Kunststoffröhrchen gesammelten murinen lineage-negativen Zellen wurden bei 1000 Umdrehungen pro Minute und 10 °C 10 Minuten abzentrifugiert. 3–5 x 10⁵ Zellen/ml wurden in X-VIVO-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin nach Zugabe von murinem Stammzellfaktor (mSCF) (100 ng/ml), mIL6 (50 ng/ml) und mIL3 (50 ng/ml) für 48–72 Stunden im Brutschrank bei 37 °C kultiviert.

3.3.5.4 Durchflusszytofluorometrische Analyse zur Bestimmung der Reinheit der depletierten, murinen Knochenmarkszellen

Der überwiegende Anteil der lineage-negativen Knochenmarkszellen war positiv für das Antigen auf multipotenten hämatopoetischen Stammzellen (sca1) und insbesondere positiv für das Antigen auf hämatopoetischen Stammzellen, myeloerythroiden und lymphozytären Vorläufern (c-kit).

Zelle

mit Microbeads gekoppelter Antikörper

biotinylierter Antikörper

Tabelle 7: Verwendete Antikörper und Farbstoffe zur durchflusszytoflurometrischen Bestimmung des prozentualen Anteils sca1- und c-kit-positiver Zellen in der Fraktion der murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Depletion über MACS-Säulen.

Probe Verwendete Zellen Antikörper und Farbstoffe 1 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen mCD45-FITC

2 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen mCD45-PE 3 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen mCD45-APC 4 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen PI

5 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen SA-PE

6 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen Maus IgG1-FITC, Maus IgG1-PE, Maus IgG1-APC

7 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen nach Markierung für die magnetischen Zellsortierung

Maus IgG1-FITC, SA-PE, Maus IgG1-APC

8 nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen nach Markierung für die magnetischen Zellsortierung

sca1-FITC, SA-PE, c-kit-APC

9 lineage-positive Zellen sca1-FITC, SA-PE, c-kit-APC

10 lineage-negative Zellen sca1-FITC, SA-PE, c-kit-APC

Abkürzungen: sca1 = Antigen auf multipotenten hämatopoetischen Stammzellen; c-kit = Antigen auf hämatopoetischen Stammzellen, myeloerythroiden und lymphozytären Vorläufern ; MACS = magnetic cell sorting, magnetische Zellsortierung ; mCD45 = gemeinsames Antigen auf murinen Leukozyten; FITC =

Fluoresceinisothiocyanat; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin; PI = Propidiumjodid; SA = Streptavidin; Maus IgG1 = Fluoreszenzkontrolle, um die unspezifische Bindung von fluoreszierenden Anikörpern und die Bindung von fluoreszierenden Anikörpern an FC-Rezeptoren abzuschätzen

Um den Anteil der lineage-negativen Zellen in der Fraktion der depletierten Zellen und somit den Erfolg der Depletion zu bestimmen, wurde der prozentuale Anteil an sca1- und c-kit-positiven Zellen in dieser Fraktion bestimmt. Dazu wurden 1 x 10⁵ Zellen (nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen lineage-positive und lineage-negative Knochenmarkszellen) in einem

Volumen von 100 µl mit 10 µl Antikörpern 15 Minuten bei 6 °C in einer 96-Loch-Platte inkubiert und anschließend 10 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute und 10 °C zentrifugiert. Nach Entnahme des Überstandes wurden die Zellen in 200 µl PBS suspendiert, in ein Durchflusszytofluorometer-Röhrchen überführt und im Durchflusszytofluorometer untersucht. Die verwendeten Antikörper und Farbstoffe sind in Tabelle 7 dargestellt. Die nicht aufgereinigten Knochenmarkszellen und die lineage-positiven Zellen dienten zur Einstellung des Durchflusszytofluorometers. Die Anfärbung der DNA toter und apoptotischer Zellen durch Zugabe von 10 µl/ml PI erfolgte erst unmittelbar vor der Messung.

3.3.5.5 Transduktion von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen

Eine 48- oder 24-Loch-Platte wurde mit 200 µl Retronectin (50 µ g/ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 6 °C beschichtet. Nach Entnahme des Retronectin wurde die Platte 30 Minuten mit PBS mit 2 % bovinem Serumalbumin geblockt und dann mit HBSS mit 2,5 % 1 mol/l Hepes gewaschen. In der 48-Loch-Platte konnten 7 x 10⁵ Zellen, in der 24-Loch-Platte konnten 1,4 x 10⁶ Zellen pro Loch transduziert werden. Dazu wurden Zellen und das gewünschte Virus mit einer MOI von 1 bis 4 zusammen in ein beschichtetes Loch gegeben. Das Gesamtvolumen von Zellen und Virus betrug 300 µl in der 48-Loch-Platte bzw. 600 µl in der 24-Loch-Platte. Zu den Zellen und dem Virus wurden noch 6,7 µg/ml Polybrene und 5 µl bzw. 10 µl 10 mmol/l Desoxynukleosid-Triphosphat hinzu gegeben.

Zytokine (mSCF, mIL3 und mIL6) wurden entsprechend Tabelle 8 für das spätere Gesamtvolumen (500 µl bzw. 800 µl) hinzugefügt. Anschließend erfolgte eine 90-minütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen pro Minute und 32 °C. Im Anschluss wurden 200 µl frisches X-Vivo-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin in jedes Loch gegeben und die Zellen im Brutschrank inkubiert.

Tabelle 8: Eingesetzte Zytokinkonzentrationen zur Kultivierung muriner lineage-negativer Knochenmarkszellen in Zellkulturmedium.

Zytokine

Konzentration in X-Vivo-Medium

mSCF 100 ng/ml

mIL3 50 ng/ml

mIL6 50 ng/ml

Abkürzungen: mSCF = muriner Stammzellfaktor; mIL = murines Interleukin

An Tag 1 nach der Transduktion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und Zellen für die gewünschten Versuche (Knochenmarkstransplantation, Kolonie-Assays) entnommen. Die übrigen Zellen wurden in X-Vivo-Medium mit 1% P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin mit mSCF, mIL3 und mIL6 kultiviert. Zur Bestimmung der Transduktionseffizienz der murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen wurde an Tag 3 und Tag 7 nach der Transduktion eine Messung im Durchflusszytofluorometer durchgeführt.