4. Ergebnisse
4.2 In-vivo-Experimente
4.2.1 Etablierung eines Knochenmarkstransplantationsprotokolls und Nachweis
Knochen-markstransplantation
Über 95 % der 74 transplantierten Mäuse, davon 4 seriell transplantierte Tiere, überlebten die Transplantation. Im Blut von über 90 % der transplantierten Tiere konnten GFP-positive Leukozyten nachgewiesen werden, allerdings schwankte die Anzahl der GFP-positiven Leukozyten auch innerhalb der Mausgruppen sehr, die mit derselben Knochenmarkspräparation transplantiert wurden (Tab. 21 und Tab. 37, Anhang).
Tabelle 21: Prozentualer Anteil von GFP-positiven Leukozyten im Blut von verschiedenen Gruppen* transplantierter Mäuse 4–8 Wochen nach Knochenmarks-transplantation.
GFP-positive Leukozyten im Blut (%) Gruppe Median Minimum Maximum
1 9,0 0,7 32,9
2 3,8 0,0 63,9
3 0,1 0,1 1,6
4 1,5 0,4 41,3
5 3,6 0,2 58,7
6 0,3 0,0 6,7
7 3,5 0,0 34,4
*Mausgruppen mit mindestens vier Tieren, die mit derselben Knochenmarkspräparation transplantiert wurden, werden gezeigt. Die Gruppen 1–5 wurden mit R780 GMR exprimierenden murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen transplantiert, Gruppe 6 wurde mit R780 GMR V449E und Gruppe 7 mit R780 GMR I374N exprimierenden murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen transplantiert. Die Messung wurde mit einem Durchflusszytofluorometer durchgeführt.
Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; R780 = retrovirales Plasmid; GMR = chimärer Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; GMR I374N und GMR V449E = zwei mutierter -Ketten des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor
Bei der Etablierung eines Knochenmarkstransplantationsprotokolls und dem Nachweis der In-vitro-Funktionalität des GMR nach Knochenmarkstransplantation waren in einer durchflusszytofluorometrischen Messung 3,4–85,2 % der Leukozyten im peripheren Blut und 23,5–73,2 % der leukozytären Knochenmarkszellen von transplantierten und seriell transplantierten Tieren GFP-positiv (Tab. 22).
Tabelle 22: Prozentualer Anteil von GFP-positiven Leukozyten im peripheren Blut und im Knochenmark von insgesamt fünf transplantierten oder seriell transplantierten Mäusen gemessen im Durchflusszytofluorometer. Murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden vor der Transplantation mit SEW (lentiviraler Vektor) oder mit R702 GMR (retroviraler Vektor mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) transduziert.
im Blut im Knochenmark
SEW 1 6 Monate 27,1 30,0
R702 GMR 1 6 Monate 11,6 23,5
SEW seriell 1 6 Wochen 3,4 33,8
SEW seriell 2 6 Wochen 85,2 73,2
R702 seriell 1 6 Wochen 28,3 31,1
Zunächst wurden zwei transplantierte Mäuse (SEW 1 und R702 GMR 1) sechs Monate nach der Transplantation getötet und deren Knochenmarkszellen ohne Aufreinigung seriell in insgesamt drei konditionierte Empfänger transplantiert. Dabei wurde das Knochenmark der SEW 1-Maus seriell in die SEW seriell 1-Maus und in die SEW seriell 2-Maus transplantiert, das Knochenmark der R702 GMR 1-Maus wurde seriell in die R702 GMR seriell 1-Maus transplantiert. Die Ergebnisse wurden auf eine Stelle hinter dem Komma gerundet.
Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; SEW-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, SEW exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde; R702 GMR = Maus, die mit murinen lineage-negativen, R702
GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde; seriell = beschreibt eine Maus, die seriell transplantiert wurde
Tabelle 23: Gesamtzahl der Kolonien (ges.) und Anzahl der GFP-positiven Kolonien (GFP+) in Kolonie-Assays mit 1 x 103 murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit SEW (lentiviraler Vektor) oder mit R702 GMR (retroviraler Vektor mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor), unter Einsatz verschiedener Zytokine.
Anzahl der Kolonien Für die Transduktion
verwendeter viraler Vektor
Zytokine in der
Methylzellulose ges. GFP+
SEW Cocktail 49 16
Cocktail 28 11
hGM-CSF 4 4
R702
ohne 0 0
Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO), Methylzellulose mit ausschließlich hGM-CSF und Methylzellulose ohne Zytokine wurde nach Zugabe der Zellen 11 Tage bei 37 °C kultiviert
Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; ; rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin; rhIL
= rekombinantes, humanes InterleukinrhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin
Bei der Untersuchung transduzierter Knochenmarkszellen im Kolonie-Assay in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail waren 16 bzw. 11 Kolonien GFP-positiv, in Methylzellulose mit hGM-CSF ohne weitere Zusätze wuchsen aus GMR exprimierenden Knochenmarkszellen 4 Kolonien, die alle GFP-positiv waren (Tab. 23).
Die Knochenmarkszellen der (primär und seriell) transplantierten R702 GMR-Mäuse bildeten in Methylzellulose mit dem Zytokincocktail 38–92 Kolonien und in Methylzellulose mit hGM-CSF 7–32 Kolonien. Die Knochenmarkszellen der (primär und seriell) transplantierten SEW-Mäuse bildeten mit dem Zytokincocktail 8–79 Kolonien, allerdings in Methylzellulose mit hGM-CSF wuchsen gar keine Kolonien. Ohne Zugabe eines Zytokins bildeten die Knochenmarkszellen der R702 GMR-Mäuse und der SEW-Mäuse nie Kolonien (Tab. 24).
Tabelle 24: Gesamtzahl (ges.) der Kolonien und Anzahl der GFP-positiven (GFP+) Kolonien in Kolonie-Assays mit Knochenmarkszellen von fünf transplantierten oder seriell transplantierten Mäusen nach Einsatz verschiedener Zellzahlen und verschiedener Zytokine.
Anzahl der Kolonien
Maus Zellzahl
Zytokine in der
Methylzellulose ges. GFP+
5 x 104 Cocktail 70 8 Transgen für einen chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) exprimierenden, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen wurden die transplantierten Tiere getötet, Knochenmarkszellen isoliert und diese 8 Tage bei 37 °C im Kolonie-Assay kultiviert. Die seriell transplantierten Tiere wurden sechs Wochen nach der Transplantation getötet, Knochenmark isoliert und 10 Tage im Kolonie-Assay bei 37 °C kultiviert. Verwendet wurde Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO), Methylzellulose mit ausschließlich hGM-CSF und Methylzellulose ohne Zytokine.
Fortsetzung der Legende zu Tabelle 24 (S. 109):
Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; SEW = lentivirales Plasmid; SEW-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, SEW exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde; R702 = retrovirales Plasmid;
GMR = der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; R702
GMR = Maus, die mit murinen lineage-negativen, R702 GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde; seriell = Maus, die seriell transplantiert wurde; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin; rhIL
= rekombinantes, humanes Interleukin; rhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin
Die erfolgreiche Transplantation transduzierter, hämatopoetischer Stammzellen konnte durch serielle Transplantation von Knochenmarkszellen, die mit einem lentiviralen Vektor (SEW) oder mit einem retroviralen Vektor (R702 GMR) transduziert wurden, nachgewiesen werden. Der funktionelle GMR auf den transduzierten Knochenmarkszellen konnte somit auch nach einer Transplantation und nach einer serieller Transplantation nachgewiesen werden.
Aus den Zellen von 17 Kolonien nach 15-tägiger Kultivierung im Kolonie-Assay in Methylzellulose mit hGM-CSF konnte in 5 Kolonien in der Real-Time-DNA-PCR das Transgen für den GMR nachgewiesen werden (Tab. 36, Anhang). Das Ergebnis konnte durch eine Elektrophorese in einem 2 % Agarosegel bestätigt werden. Die Proben 6, 13, 15, 18 und 19 zeigten eine Bande, die der Größe des Real-Time-DNA-PCR-Produkt entspricht (Größe = cirka 100 Basenpaare, Abb. 18). Das Transgen konnte somit auch in GFP-negativen Kolonien nachgewiesen werden.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Abbildung 18: Nachweis des Transgens für den GMR (der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) mit einem 2%-igen Agarosegel in den Real-Time-DNA-PCR-Proben 6, 13, 15, 18 und 19.
17 Kolonien aus Knochenmarkszellen der R702 GMR 1-Maus wurden isoliert, DNA aus den Zellen isoliert und in einer Real-Time-DNA-PCR untersucht. 13 von 17 in der Real-Time-DNA-PCR untersuchten Proben wurden zusammen mit Positiv-, Negativkontrollen und Markern auf das Agarosegel aufgetragen.
Probenbelegung:
Sonstige Abkürzungen: PCR = polymerase chain reaction, Polymerase-Ketten-Reaktion; DNA = Desoxyribonucleinsäure; R702 GMR-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen transplantiert wurde, die einen chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor exprimieren