Effekt von subkutanen Injektionen mit dem humanen Granulozyten-

Engraftments

Bei den Blutuntersuchungen von mit hGM-CSF injizierten R780 GMR-Mäusen und R780-Mäusen konnte 4, 5 und 6 Wochen nach der Transplantation mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen im globalen Gruppenvergleich kein signifikanter Unterschied der Leukozytenzahl zwischen der Versuchsguppe und den Kontrollgruppen festgestellt werden (4 Wochen: p = 0,183; 6 Wochen: p = 0,120; Kruskal-Wallis-Test, Tab. 25, Tab. 38 und Tab.

40, Anhang).

Im ergänzend durchgeführten Vergleich zwischen den einzelnen Gruppen mit dem Mann-Whitney-U-Test deutete sich eine tendenziell höhere Leukozytenzahl in der Versuchsgruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen zum Zeitpunkt 4 Wochen nach Transplantation an (Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 1: p = 0,056 und Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 2: p = 0,073, Mann-Whitney-U-Test). Ein signifikanter Unterschied bei einem Vergleich der einzelnen Tiergruppen untereinander konnte ausschließlich zum Zeitpunkt 6 Wochen nach Transplantation festgestellt werden, als die Leukozytenzahl der Kontrollgruppe 1 höher lag als in der Versuchsgruppe (p = 0,023, Mann-Whitney-U-Test).

Nur ein Teil der in diesem Versuch verwendeten Mäuse hatte mindestens 2 % GFP-positive Leukozyten im Blut. Betrachtet man diese Tiere, so betrug die Leukozytenzahl der Versuchstiere im Median 4 Wochen nach der Transplantation 3,9 x 10³/µl, bei den Kontrollgruppen 1 und 2 betrug der Median der Leukozytenzahl zu diesem Zeitpunkt 2,6 x 10³/µl (Tab. 25).

Tabelle 25: Leukozytenzahlen (10³/µl) und prozentuale Anteile der GFP-positiven Leukozyten (Median mit Minimum–Maximum) im Blut von drei Gruppen von Mäusen 4, 5 und 6 Wochen nach der Knochenmarkstransplantation. Die Versuchsgruppe wurde von R780 GMR-Mäusen (Mäuse, die ein Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor tragen), die Injektionen mit hGM-CSF bekamen, gebildet. Zur Kontrollgruppe 1 gehörten R780 GMR-Mäusen, die Injektionen mit PBS bekamen. Die Kontrollgruppe 2 bestand aus R780-Mäusen (R780 = retroviraler Vektor), die Injektionen mit hGM-CSF bekamen.

GFP-positive Leukozyten im Blut (%) Mäuse

Tabelle 25 (S. 113):

Die Leukozytenwerte werden von allen Mäusen und nur von den Mäusen mit mindestens 2 % GFP-positiven Leukozyten im Blut gezeigt. Die Substanzen wurden 3 x pro Woche subkutan in einem Zeitraum vom 3. bis 42. Tag nach der Transplantation injiziert.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; R780-Mäuse = Mäuse, die mit murinen lineage-negativen; R780 exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden; PBS = phosphatgepufferte Salzlösung; KMT = Knochenmarkstransplantation; n = Anzahl der Tiere

Bei dem prozentualen Anteil der GFP-positiven Leukozyten im Blut war zum Zeitpunkt 4 Wochen nach Transplantation ein signifikanter Unterschied zwischen den Versuchsgruppen einschließlich der Kontrollgruppen festzustellen (p = 0,024; Kruskal-Wallis-Test); 6 Wochen nach Transplantation war kein signifikanter Unterschied im Globaltest feststellbar (p = 0,123;

Kruskal-Wallis-Test, Tab. 25, Tab. 38, Tab. 39 und Tab. 40, Anhang). Der Gruppenvergleich mit dem Mann-Whitney-U-Test zum Zeitpunkt 4 Wochen nach Transplantation zeigte signifikant höhere prozentuale Anteile GFP-positiver Leukozyten bei der Kontrollgruppe 2 (R780-Mäusen, die Injektionen mit hGM-CSF bekamen) als bei der Versuchsgruppe (R780 GMR-Mäusen, die Injektionen mit hGM-CSF bekamen) und der Kontrollgruppe 1 (R780 GMR-Mäusen, die Injektionen mit PBS bekamen) trotz gleicher MOI (MOI = 1).

Zum Zeitpunkt 6 Wochen nach Transplantation war mittels Mann-Whitney-U-Test ausschließlich zwischen der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe 2 ein deutlicher Unterschied des prozentualen Anteils der GFP-positiven Leukozyten im Blut feststellbar, wobei die Werte in der Kontrollgruppe 2 signifikant höher waren (Tab. 40, Anhang). Ein Unterschied im Differentialblutbild zwischen den Tiergruppen konnte nicht festgestellt werden (Tab. 41, Anhang).

4.2.2.2 Stimulation transplantierter Mäuse mit dem humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor ab 5 Wochen nach Transplantation

Ein Vergleich der Gesamtzahl von 19 Versuchstiere (R702 GMR-Mäuse und R780

GMR-Mäuse) mit den 7 Kontrolltieren (SEW-Mäuse und R780-Mäuse), die jeweils 1 µ g hGM-CSF/Tag in unterschiedlichen Dosierungsschemata erhielten, ergab bei den Versuchstieren signifikant höhere Differenzen (Zunahmen) der Leukozytenzahlen (p = 0,017;

Mann-Whitney-U-Test; Tab. 26; Tab. 42, Tab. 44, Tab. 45, Tab. 47 und Tab. 49, Anhang).

Beim Vergleich der Versuchsgruppe mit der Kontrollgruppe für die einzelnen Dosierungsschemata war ausschließlich bei der Injektion von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich signifikant höhere Differenzen der Leukozytenzahlen zwischen den Messungen vor und nach Injektion feststellbar (p = 0,010, Mann-Whitney-U-Test).

Beim globalen Vergleich der einzelnen Dosierungsschemata innerhalb der Versuchsgruppe zeigten sich deutliche Unterschiede (p = 0,025, Kruskal-Wallis-Test), die höhere Werte (Zunahmen) bei dem Dosierungsschema von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich im Vergleich zum Dosierungsschema 1 µg hGM-CSF 1 x täglich zum Ausdruck brachten (p = 0,004 Mann-Whitney-U-Test (Tab. 26; Tab. 51 und Tab. 52, Anhang).

Für die Veränderungen des prozentualen Anteils der GFP-positiven Leukozyten im Blut ließ sich zwischen der Gesamtzahl der 19 Versuchstiere (R702 GMR-Mäuse und R780

GMR-Mäuse) und der Gruppe der 7 Kontrolltiere (SEW-Mäuse und R780-Mäuse), die jeweils mit verschiedenen hGM-CSF-Dosierungsschemata behandelt wurden, kein signifikanter Unterschied nachweisen (p = 0,252; Mann-Whitney-U-Test). Auch ein Vergleich der einzelnen Dosierungsschemata innerhalb der Versuchsgruppe brachte keine signifikanten Unterschiede (p = 0,251, Kruskal-Wallis-Test; Tab. 26; Tab. 43, Tab. 48, Tab.

51 und Tab. 52, Anhang). Ein Unterschied im Differentialblutbild zwischen den Tiergruppen konnte ebenfalls nicht festgestellt werden (Tab. 46 und Tab. 50, Anhang).

Bei 5 Versuchstieren (R702 GMR-Mäuse und R780 GMR-Mäuse), die in 2 von einer mindestens 6-wöchigen Pause unterbrochenen Behandlungsintervallen von jeweils einer Woche 1 µg hGM-CSF 1 x täglich injiziert erhielten, konnte für die Differenzen der Leukozytenzahlen und des prozentualen Anteils der GFP-positiven Leukozyten (vor und nach der 7-tägigen Behandlung mit hGM-CSF) kein signifikanter Unterschied zwischen dem 1.

und dem 2. Injektionsdurchgang festgestellt werden (Leukozytendifferenz: p = 0,134, GFP-Differenz: p = 0,377, Tab. 45, Anhang).

Legende zu Tabelle 26 (S. 117):

Die Mäuse wurden in einem Zeitraum von 5–33 Wochen nach Knochenmarkstransplantation mit hGM-CSF über 7 Tage subkutan injiziert und die Veränderung der Leukozytenzahlen und der prozentualen Anteile an GFP-positiven Leukozyten im Blut gemessen. Bei Tieren für die mehrere Messwerte (für die Gesamtzahl auch in verschiedenen Dosierungsgruppen) ermittelt wurden, wurde aus den einzelnen Werten des Tieres der Median gebildet und mit diesem weiter gerechnet. Die Messwerte wurden auf zwei Nachkommastellen gerundet.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; SEW, R702 und R780 = virale Plasmide; GMR = der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; R702 GMR-Mäuse und R780 GMR-Mäuse = Mäuse, die mit murinen lineage-negativen, den GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden; SEW-Mäuse = Mäuse, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit SEW transplantiert wurden;

R780-Mäuse = Mäuse, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit R780 transplantiert wurden; n = Anzahl der Tiere

Tabelle 26: Differenzen der Leukozytenzahlen (10³/µl) und Differenzen der prozentualen Anteile von GFP-positiven Leukozyten (jeweils Median, Minimum–

Maximum) vor und nach einer 7-tägigen Behandlung mit hGM-CSF mit verschiedenen Dosierungsschemata im Blut von Mäusen, die den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor haben (Versuchsgruppe - R702 GMR-Mäuse und R780 GMR-Mäuse, n = 19) und von Mäusen ohne Transplantation des chimären Rezeptors (SEW-Mäuse und R780-Mäuse, n = 7).

Median der Leukozytendifferenzen

Dosierungsschema n Versuchsgruppe n Kontrollgruppe 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich 9 3,9 (-0,6–10,4) 4 -0,45 (-3–0,09) 1 µg hGM-CSF 1 x täglich 11 0,50 (-3,1–3,7) 6 0,55 (-2,8–2,9) 2 µg hGM-CSF jeden 2. Tag 5 2,70 (-1,8–3,1) 3 1,05 0,2–1,9) Gesamtzahl 19 1,0 (-2,3–5,2) 7 -0,1 (-1,4–0,9) Vergleich der Versuchsgruppe mit der Kontrollgruppe für die Gesamtzahl:

p = 0,017 (Mann-Whitney-U-Test)

Vergleich der einzelnen Dosierungsschemata innerhalb der Versuchsgruppe:

p = 0,025 (Kruskal-Wallis-Test)

Median der Differenzen der prozentualen Anteile an GFP-positiven Leukozyten

Dosierungsschemata n Versuchsgruppe n Kontrollgruppe 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich 9 0,1 (-0,4–3,5) 4 2,25 (-2,5–7,9) 1 µg hGM-CSF 1 x täglich 11 0,1 (-2,9–10,35) 6 -1,075 (-3,2–4,35) 2 µg hGM-CSF jeden 2. Tag 5 -0,5 (-2,9–3,7) 3 -0,60 (-1,0–12,4) Gesamtzahl 19 0,1 (-1,5–3,5) 7 -1,0 (-2,9–7,9) Vergleich der Versuchsgruppe mit der Kontrollgruppe für die Gesamtzahl:

p = 0,252 (Mann-Whitney-U-Test)

Vergleich der einzelnen Dosierungsschemata innerhalb der Versuchsgruppe:

p = 0,251 (Kruskal-Wallis-Test)