Funktionelle Evaluation von R780 GMR

Mit R780 GMR transduzierte, murine lineage-negative Knochenmarkszellen bildeten in Methylzellulose mit einem auf Mausknochenmarkszellen abgestimmten Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO) im Median 25 Kolonien (an den Tagen 7–8 der Kultivierung) und 28 Kolonien (an den Tagen 11–14 der Kultivierung). Ohne Zugabe von Zytokinen wuchsen keine Kolonien, aber bei Zugabe von 20 ng/ml hGM-CSF waren die transduzierten Zellen in der Lage im Median 2 Kolonien (an den Tagen 7–8 und an den Tagen 11–14 der Kultivierung) zu bilden (Tab. 17). Die Kolonien waren zu 95 % (an den Tagen 7–8 der Kultivierung) und zu 93 % (an den Tagen 11–14 der Kultivierung) GFP-positiv (Abb. 15), entsprechend der Tatsache, dass lediglich transduzierte KBE unter Stimulation mit hGM-CSF Kolonien bilden können.

Tabelle 15: Prozentualer Anteil der GFP-positiven (GFP+) Zellen an den mit ecotropen, viralen Virusüberständen transduzierten, murinen lineage-negativen Knochenmarks-zellen im Durchflusszytofluorometer an Tag 3 und an Tag 7 nach der Transduktion.

GFP+ Leukozyten (%)

Median (Minimum–Maximum) 16 (8–30) 13 (4–21)

R780 1 Median (Minimum–Maximum) 39 (18–75) 34,5 (13–80)

Als virale Vektoren wurden SEW, R702 GMR, R780 GMR V449E, R780 GMR I374N, R780 und R780 GMR verwendet. Zusätzlich ist die bei den einzelnen Versuchen verwendete MOI und der Median der GFP-positiven Leukozyten mit Minimum und Maximum für die mit den Vektoren R780 und R780 GMR durchgeführten Versuche angegeben. Die Ergebnisse wurden der Übersichtlichkeit halber auf ganze Zahlen gerundet.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; MOI = multiplicity of infection, Anzahl der Viruspartikel pro Zelle; SEW = lentivirales Plasmid; - = Wert nicht bestimmt; R702 und R780 = retrovirale Plasmide;

GMR = der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; GMR V449E und GMR I374N = zwei mutierte -Ketten des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors

Tabelle 16: Gesamtzahl (ges.) der Kolonien und Anzahl der GFP-positiven Kolonien (GFP+), die von 1 x 10³ murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen - nichttransduziert oder nach der Transduktion mit dem retroviralen Vektor R780 - in verschiedenen Methylzellulosen gebildet wurden.

Anzahl der Kolonien in Methylzellulose mit

Zytokin-cocktail mit hGM-CSF ohne Zytokine Versuch der Ergebnisse der Tage 6–8

34 der Ergebnisse der Tage 10–14

45,5 (19–86)

9,5 (2–28)

0 0

Verwendet wurde Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO), Methylzellulose mit hGM-CSF und Methylzellulose ohne Zytokine.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; R780 = retrovirales Plasmid; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; - = Wert nicht bestimmt; rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin; rhIL = rekombinantes, humanes Interleukin; rhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin

Tabelle 17: Gesamtzahl der Kolonien (ges.) und Anzahl der GFP-positiven Kolonien (GFP+) von R780 GMR oder R702 GMR (retrovirale Vektoren mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) exprimierenden, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen in Methylzellulosen mit verschiedenen Zytokinen.

Anzahl der Kolonien in Methylzellulose mit

Zytokin-cocktail mit hGM-CSF ohne Zytokine Versuch

Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO), Methylzellulose ohne Zytokine und Methylzellulose mit ausschließlich 20 ng/ml hGM-CSF wurde verwendet. Die Zellen wurden einen Tag nach der Transduktion in die Kolonie-Assays gegeben. Die Kolonienanzahl wurde nach 7–14-tägiger Inkubation bei 37 °C ermittelt.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; R780 und R702 = retrovirales Plasmid; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin; rhIL = rekombinantes, humanes Interleukin; rhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin

Abbildung 15: Durchlichtbild und Bild der Grünfluoreszenz einer GFP-positiven Kolonie (100 x Vergrößerung), die im Kolonie-Assay mit 1 x 10³ murinen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit R780 GMR (retroviraler Vektor mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) in Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CSF gebildet wurde

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden an Tag 1 nach der Transduktion in den Kolonie-Assay gegeben und 14 Tage bei 37 °C kultiviert.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor

In den Kolonie-Assays, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen zwischen Tag 1 und Tag 8 nach der Transduktion mit R780 GMR aus Suspensionskulturen in Methylzellulose überführt und nach 14 Tagen ausgewertet wurden (Versuch 8), konnten die transduzierten Zellen an allen getesteten Tagen in Methylzellulose mit einem auf Mausknochenmarkszellen abgestimmten Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO) und in Methylzellulose nach Zugabe von 20 ng/ml hGM-CSF Kolonien bilden (Tab. 18). Im Durchflusszytofluorometer waren nach der Transduktion mit R780 GMR 38 % (Tag 2), 37 % (Tag 3), 29 % (Tag 4) und 24 % (Tag 8) der Zellen in Suspensionskultur GFP-positiv.

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen waren nach Transduktion mit R780 GMR – im Gegensatz zu nichttransduzierten oder mit R780 transduzierten murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen – in der Lage, nur in Anwesenheit von hGM-CSF Kolonien zu bilden.

Bereits an Tag eins nach Transduktion war die Genexpression ausreichend, um innerhalb von 14 Tagen in Methylzellulose mit hGM-CSF Kolonien zu bilden.

Tabelle 18: Gesamtzahl der Kolonien (ges.) und Anzahl der GFP-positiven Kolonien (GFP+) von R780 GMR (retroviraler Vektor mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) exprimierenden, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen in Kolonie-Assays unter Einsatz verschiedener Zytokine (Versuch 8).

Anzahl der Kolonien in Methylzellulose mit

Zytokin-cocktail mit hGM-CSF ohne Zytokine Zeitpunkt des

Ansatzes in Tagen nach

Transduktion ges. GFP+ ges. GFP+ ges.

1 50 12 32 32 0

2 31 8 26 26 0

3 72 26 64 64 0

4 24 5 20 20 0

8 23 7 21 18 0

Die Zellen wurden an Tag 1, 2, 3, 4 und 8 nach der Transduktion in die Kolonie-Assays gegeben und 14 Tage bei 37 °C kultiviert. 1 x 10³ Zellen wurden in Methylzellulose mit dem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO) gegeben; 5 x 10³ Zellen wurden in Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CSF und in Methylzellulose ohne Zytokine kultiviert.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin; rhIL

= rekombinantes, humanes Interleukin; rhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin

a) b)

SSC

GFP

28 % 21 %

Eine geringe Anreicherung transduzierter, muriner lineage-negativer Knochenmarkszellen bei Kultivierung in X-VIVO-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin sowie mit mSCF, mIL6 und mIL3 war bei Zugabe von 20 ng/ml hGM-CSF möglich (Abb. 16). Der Anteil an GFP-positiven Leukozyten stieg von 21 % auf 28 % an.

Abbildung 16: Dot-Plot-Grafik der GFP-Expression gemessen im Durchfluss-zytofluorometer von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen an Tag 8 nach der Transduktion mit R780 GMR (retroviraler Vektor mit einem Transgen für den chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) in Zellkulturmedium mit und ohne hGM-CSF.

a) Die Zellen im Medium ohne Zusatz von hGM-CSF waren zu 21 % GFP-positiv b) Die Zellen im Medium mit Zusatz von 20 ng/ml hGM-CSF waren zu 28 % GFP-positiv.

Die Kultivierung erfolgte in X-VIVO-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin mit mSCF, mIL6 und mIL3 mit und ohne Zusatz von hGM-CSF.

Sonstige Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; SSC = sideward light scatter, Seitwärtsstreulicht;

hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; P/S = Penicillin/

Streptomycin; mSCF = muriner Stammzellfaktor; mIL = murines Interleukin

4.1.4.3 Funktionelle Evaluation von R780 GMR V449E

Mit R780 GMR V449E transduzierte Knochenmarkszellen bildeten in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO) 35–68 Kolonien, ohne Zusatz von Zytokinen 0–18 Kolonien (Tab. 19).

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen konnten an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 8 nach der Transduktion mit R780 GMR V449E mit den drei verwendeten Zytokinbedingungen in Methylzellulose Kolonien bilden (Versuch 3). Im Durchflusszytofluorometer zeigten sich nach der Transduktion der murinen lineage-negativen Zellen 34 % (Tag 2), 31 % (Tag 3), 25 % (Tag 4) und 26 % (Tag 8) der Zellen in Suspensionskultur GFP-positiv.

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen waren nach Transduktion mit R780 GMR V449E – im Gegensatz zu nichttransduzierten oder mit R780 transduzierten murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen – in der Lage ohne Zugabe von Zytokinen Kolonien zu bilden.