Untersuchung von Kontrollmäusen - In-vitro- und In-vivo-Funktionsanalyse von hGM-CSF-Zytokinrez

4. Ergebnisse

4.3 Untersuchung von Kontrollmäusen

Eine hämatologische Erkrankung konnte in 12 R780-Mäusen über einen Zeitraum von bis zu 48 Wochen nicht festgestellt werden. Die angefertigten Blutbilder waren ohne besonderen Befund (Tab. 57, Anhang).

5. Diskussion

In dieser Arbeit sollte die Folge von veränderten Zytokinrezeptorsignalen des hGMR als pathogenetischer Faktor für die Entstehung myeloproliferativer Erkrankungen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen beurteilt werden. Dazu wurde die Funktion der Rezeptorvariante GMR und der -Kettenmutationen GMR V449E und GMR I374N nach viralem Gentransfer in vitro in der murinen Pro-B-Zelllinie Ba/F3 und in primären Mausknochenmarkszellen und in vivo im Mausmodell untersucht. Ziel war es, die Eignung des GMR für die Entwicklung eines murinen Leukämiemodelles zu beurteilen. Das bisher verwendete murine Leukämiemodell mit dem Transgen für die Chromosomentranslokation zwischen Chromosom 9 und 22 (bcr-abl) ist auf Grund der sehr schnellen Erkrankung der Versuchstiere problematisch (LIN et al. 2001).

Als wesentliches Ergebnis der In-Vitro-Versuche zeigt sich die Funktionalität der Transgenplasmide R780 GMR und R780 GMR V449E, die in der murinen Pro-B-Zelllinie Ba/F3 Überlebens- und Proliferationssignale vermittelten. Transduzierte Ba/F3-Zellen wurden bei Zusatz von hGM-CSF (für R780 GMR) bzw. ohne Zusatz von Zytokinen (für R780 GMR V449E) positiv selektioniert, wie die Zunahme des Anteils GFP-positiver Leukozyten gegenüber der IL3-Bedingung zeigte. Diese Ergebnisse gehen konform mit der Arbeit von EDER et al. (1994) und McCORMACK u. GONDA (1997, 2000). Die Funktionalität der verwendeten Zytokinrezeptorvarianten konnte nicht nur in Ba/F3-Zellen, sondern auch im Kolonie-Assay nachgewiesen werden. Auch die Zytokinrezeptorvarianten auf Knochenmarkszellen transplantierter Mäuse und seriell transplantierter Mäuse waren im Kolonie-Assay funkionell. Im Hinblick auf den Nachweis die Funktionalität der in Knochenmarkszellen exprimierten GMR V449E und der GMR I374N im Kolonie-Assay unterscheiden sich die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit von Ergebnissen von McCORMACK und GONDA (1999). Sie führten ähnliche Versuche durch, doch ohne die erwartete Koloniebildung von die GMR V449E und die GMR I374N exprimierenden Knochenmarkszellen transplantierter Mäuse zu beobachten. Unterschiede im Versuchsprotokoll, wie die für die Kolonie-Assays verwendete Zellzahl und die Größe der

berücksichtigten Kolonien, können ursächlich für die unterschiedlichen Ergebnisse sein. So

verwendeten McCORMACK und GONDA (1999)

5 x 10⁴ unaufgereinigte Knochenmarkszellen für die Kolonie-Assays und berücksichtigten Kolonien erst ab einer Größe von 50 Zellen, während in der vorliegenden Untersuchung 1–5 x 10³ aufgereinigte oder 1–5 x 10⁵ unaufgereinigte Knochenmarkszellen in die Kolonie-Assays gegeben wurden und Kolonien bereits ab einer Größe von 10 Zellen berücksichtigt wurden. Für eine methodische Ursache der fehlenden Funktionalität in Knochenmarkszellen in der Studie von McCORMACK und GONDA (1999) spricht auch die Tatsache, dass die Autoren den grundsätzliche Nachweis der Funktionalität der Transgene GMR V449E und

GMR I374N in hämatopoetischen Zellen aus der fetalen Leber in Methylzellulose ohne Zytokine erbrachten.

Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Kolonie-Assays fiel grundsätzlich auf, dass in der Methylzellulose mit dem Zytokincocktail immer mehr Kolonien wuchsen als bei alleiniger Zugabe von hGM-CSF oder ohne Zytokine. Da nur die erfolgreich transduzierten und den

GMR exprimierenden Zellen die Fähigkeit haben, bei ausschließlicher Zugabe von hGM-CSF zu wachsen bzw. nur die GMR V449E und die GMR I374N exprimierenden Zellen in der Lage sind, ohne Zytokinzusatz zu wachsen, ist die Differenz der Kolonienzahl in Abhängigkeit von der Transduktionseffizienz zu erklären.

Bei Versuchen mit die GMR V449E und die GMR I374N exprimierenden Zellen sind sowohl die Kolonienbildung in Methylzellulose ohne Zytokine wie in der Bedingung mit hGM-CSF ein Nachweis für die Funktionalität der verwendeten Transgene, da die -Kette des hGMR den Liganden (hGM-CSF) nicht binden kann. Grundsätzlich konnte bei den Kolonie-Assays außerdem festgestellt werden, dass die Anzahl der gezählten Kolonien an Tag 7 der Kultivierung in Methylzellulose nicht mit der Anzahl der gezählten Kolonien an Tag 14 identisch ist. Dies erklärt sich durch die Größe der Kolonien: bei einer Koloniezählung an Tag 7 sind einige Kolonien noch zu klein, um mitgezählt zu werden; bei einer Auswertung des Assays an Tag 14 sind unter Umständen schon einige Kolonien ineinander gewachsen, so dass die ermittelte Kolonienzahl zu niedrig ist. Außerdem fiel auf, das GFP-positive Kolonien oft inhomogen grün fluoreszieren. Dieses Phänomen wurde auch von MIKKOLA et al. (2000) beschrieben, die murine lineage-negative Knochenmarkszellen viral transduzierten und die

GFP-Expression im Kolonie-Assay untersuchten, und durch die unvollständige Integration des viralen Vektors in das Zellgenom vor der ersten Zellteilung erklärt.

Aus Kolonien, in denen das Transgen R780 GMR und R780 GMR I374N funktionell nachgewiesen wurde, konnte zum Teil auch in einer Real Time-DNA-PCR-Untersuchung das Transgen qualitativ nachgewiesen werden. Die negativ ausgefallenen PCR-Ergebnisse sind durch die geringe Zellzahl der Kolonien und die damit verbundene geringe DNA-Menge zu erklären. Da Kolonien ab einer Größe von 10 Zellen berücksichtigt wurden, diese Kolonien aus der Methylzellulose isoliert und gewaschen wurden und anschließend aus den gewonnenen Zellen DNA isoliert wurde, ist eine selbst für eine PCR nicht ausreichende DNA-Menge wahrscheinlich.

Die erfolgreiche Transduktion hämatopoetischer Stammzellen konnte durch eine serielle Transplantation mit Nachweis GFP-positiver Leukozyten im Blut der seriell transplantierten Tiere nachgewiesen werden. Damit reihen sich die eigenen Ergebnisse in eine Reihe anderer Ergebnisse von Arbeitsgruppen ein, die mit ähnlichen Protokollen erfolgreich genetisch veränderte Knochenmarkszellen in Mäuse transplantiert haben (CHALLITA u. KOHN 1993, SCHWALLER et al. 1998, HALENE et al. 1999, AUDET et al. 2001, LI et al. 2003).

In der vorliegenden Arbeit fielen bei den Versuchen im Mausmodell die geringe Expression der Transgene in vivo und große interindividuelle Schwankungen auf. Von diesen Schwierigkeiten berichteten viele Arbeitsgruppen auch in Xenotransplantationsmodellen, unter anderem auch SCHWIEGER et al. (2004). Ursächlich kommen hierfür als Erklärung Schwierigkeiten bei der Transduktion, Schwierigkeiten mit dem Marker GFP, autologes Engraftment, Reaktionen des Immunsystems und Methylierung der Transgene in Betracht.

Von den angeführten Faktoren spielten in der vorliegenden Arbeit Probleme der Transduktion und Schwierigkeiten mit dem Marker GFP wahrscheinlich die größte Rolle. Hinweise auf ein autologes Engraftment (das Protokoll zur Konditionierung der Empfängertiere ist in der Literatur hinreichend beschrieben [BRECHER et al. (1988), CHALLITA und KOHN (1993), GRANDE et al. (1999), HALENE et al. (1999), WAHLERS et al. (2001, 2002), LI et al.

(2002, 2003)]), die Methylierung der Transgene und Reaktionen des Immunsystems konnten

in der vorliegenden Arbeit nicht gefunden werden. Auch eine Antikörperbildung gegen Komponenten des Transgens war nach einer myeloablativer Bestrahlung nicht zu erwarten (ROSENZWEIG et al. 2001, HANAZONO et al. 2002, BAUM et al. 2003). Die Frage nach der Induktion von hGM-CSF-spezifischen Antikörpern bleibt weiteren Studien vorbehalten.

Die in der vorliegenden Arbeit beobachtete geringe Transduktionseffizienz in vitro kann die geringe In-vivo-Expression der Transgene und die deutlichen Schwankungen innerhalb der transplantierten Tiergruppen erklären. Eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Vektoren und der Genexpression für GFP beschrieben KUSTIKOVA et al.

(2003). Zur Verbesserung der Transduktion kann daher eine höhere MOI gewählt (WAHLERS et al. 2001) oder eine zweite Transduktion durchgeführt werden (MIKKOLA et al. 2000). In der vorliegenden Arbeit wurde auf diese beiden Möglichkeiten zur Erhöhung der Transduktionseffizienz verzichtet, da das Risiko einer malignen Erkrankung durch Insertionsmutagenese bei einer vermehrten Integration von Proviren ins Zellgenom steigt.

Dabei kann es zu einer Aktivierung zellulärer Onkogene oder zu einer Änderung der Transkriptionsaktivität regulatorischer Gene kommen. LI et al. (2002) veröffentlichte entsprechende Daten von einer Maus und auch bei einem therapeutisch durchgeführten retroviralen Gentransfer bei Kindern mit einem angeborenen Immundefekt traten bei einem Teil der Patienten nach drei Jahren maligne Erkrankungen auf (HACEIN-BEY-ABINA et al.

2003). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die von WAHLERS et al. (2001) und BAUM et al. (2003) empfohlene retrovirale Transduktion mit geringer MOI, die zur Integration von ein bis zwei Transgenen pro Zelle führt, durchgeführt.

Die Schwierigkeiten des viralen Gentransfers würde man durch die Generierung von transgenen Tieren umgehen, müsste sich dann aber intensiv mit der Zucht von Versuchstieren beschäftigen. Eine Untersuchung zur In-vivo-Selektion ist außerdem in transgenen Tieren nicht sinnvoll.

Während der Versuche wurde ein signifikanter Verlust GFP-exprimierender Zellen im Blut transplantierter Mäuse beobachtet. Ursachen für die Schwierigkeiten mit dem Marker GFP, die auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben werden, können sein:

• eine Blockierung GFP-positiver Vorläuferzellen in der Differenzierung (HANAZONO et al. 2002, SCHWIEGER et al. 2004),

• eine Suppression der GFP-Expression (KLUG et al. 2000),

• ein Verlust von GFP-positiven Zellen durch In-vitro-Manipulation (TOMASSON et al. 2001, VAN ETTEN 2002),

• eine geringe Expression anhängig vom Integrationsort (VIGNA et al. 2000, KELLY et al. 2002),

• keine Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen sowie

• Probleme mit bicistronischen Vektoren.

Eine wahrscheinliche Erklärung für den Verlust von GFP-positiven Zellen in der vorliegenden Arbeit ist eine fehlende Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen.

Transduzierte Progenitorzellen differenzieren aus und nichttransduzierte, GFP-negative Stammzellen übernehmen die Hämatopoese.

In der vorliegenden Arbeit fiel außerdem die deutlich stärkere GFP-Expression im Blut von R780-Mäusen und SEW-Mäusen auf, die nur ein Transgen (GFP, monocistronischer Vektor) exprimierten, im Vergleich zu Mäusen, die eine Rezeptorvariante des hGMR als erstes Transgen und GFP als zweites Transgen exprimierten (bicistronischer Vektor). Auch andere Arbeitsgruppen beschrieben die deutlich geringere Translation des zweiten Transgens (in Abhängigkeit von der internen ribosomalen Bindungsstelle) eines bicistronischen Vektors im Vergleich zum ersten Transgen (MORGAN et al. 1992, ATTAL e al. 1999, KELLY et al.

1999, HENNEKE et al. 2001, VAN ETTEN 2002, YU et al 2003). Dabei ermöglicht eine interne ribosomale Bindungsstelle erst die Translation des zweiten Transgens (GURTU et al.

1996, ATTAL et al. 1999). Die Ergebnisse der Kolonie-Assays gehen mit dieser Beobachtung konform. In den Kolonie-Assays wurde das erste Transgen auch in Zellen mit geringer bis fehlender Expression des zweiten Transgens (GFP) exprimiert. Die demzufolge höhere GFP-Expression in der Kontrollgruppe 2 (SEW-Mäuse und R780-Mäuse) im Vergleich zur

Kontrollgruppe 1 und der Versuchsgruppe (R780 GMR-Mäuse) erklärt, warum in dem Stimulationsversuch mit hGM-CSF während des frühen Engraftments kein Effekt der Stimulation der Hämatopoese durch Injektionen mit hGM-CSF auf die Anzahl der GFP-positiven Leukozyten sichtbar wurde.

Für die Stimulation der Hämatopoese während des frühen Engraftments (ab dem Zeitpunkt der Knochenmarkstransplantation bis 6 Wochen nach Transplantation) wurde den Mäusen 3 x pro Woche 2 µg hGM-CSF injiziert. Die gemessen z.B. an den Verhältnissen einer vergleichbaren Behandlung beim Menschen geringe Injektionshäufigkeit trägt der Tatsache Rechnung, dass die Tiere durch die zur Konditionierung notwendige Bestrahlung aplastisch waren und bei einem Tier starke Blutungen in der Unterhaut auftraten, denen bei der Maus nicht wie beim Menschen mit Thrombozytentransfusionen begegnet werden kann. Auch NAGASHIMA et al. (2004), die mit einem selektiven Verstärkergen mit dem EPO-Rezeptor als Schalter Selektionsversuche in der Maus durchführten, injizierten in ihrem Falle EPO 3 x pro Woche über insgesamt 4 Wochen und konnten einen Selektionseffekt vier Wochen nach Injektionsbeginn im Blut nachweisen.

In der vorliegenden Arbeit deutete sich 4 Wochen nach Knochenmarkstransplantation eine tendenziell höhere und nach 6 Wochen tendenziell niedrigere bis analoge Leukozytenzahlen in der Versuchsgruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen an. Hier könnte ein Phänomen zum Ausdruck kommen, das auch beim Menschen beschrieben wurde. So engraften Menschen, die Injektionen mit hGM-CSF nach einer Knochenmarkstransplanation bekommen, auf Grund eines Wachstumsvorteils 4–7 Tage früher als Kontrollen, danach gleichen sich die Blutwerte an, so dass kein Unterschied messbar ist. Beim Menschen finden sich diese Unterschiede in einem Zeitraum von 2 bis 3 Wochen nach Knochenmarkstransplantation (LAZARUS 1991, NEMUNAITIS et al. 1991, NEIDHART et al. 1992). Denkbar ist, dass der Effekt bei der Maus aufgrund des längeren Engraftments von 4–6 Wochen (Li, X., Abteilung Hämatologie, Hämostaseologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover, mündiche Mitteilung) später auftritt. Andererseits ist aber auch denkbar, dass bereits zu einem früheren Zeitpunkt als dem gewählten ersten Probenentnahmezeitpunkt nach 4 Wochen deutlichere Effekte der Stimulation der Hämatopoese mit hGM-CSF vorlagen. Auf eine frühere Probenentnahme wurde im selbst

angewandten Protokoll aber verzichtet, da die Blutentnahme bei den aplastischen Tieren kritisch zu bewerten ist. Schon die gesunde Maus wird auf Grund ihres geringen Blutvolumens (cirka 1,2 ml) durch eine Blutentnahme enorm gestresst. Die Wahl eines größeren Versuchstieres würde das Problem der eingeschränkten Blutentnahmemöglichkeiten entschärfen. Allerdings verwendet man dann nicht mehr das Standardversuchstier für hämatologische Erkrankungen, die Maus des Stammes C57BL/6, was wiederum Probleme bei der Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit sich bringt. Auch eine häufigere Injektion von hGM-CSF während des frühen Engraftment als 3 x pro Woche mit der Folge eines konstanteren Wirkspiegels hätte eventuell einen deutlicheren Effekt gezeigt. Die Verwendung von Mikroinjektionspumpen, die unter die Haut transplantiert werden und dann über einen bestimmten Zeitraum Substanzen kontinuierlich abgeben können, stellt eine aufwendige, teure, aber elegante Alternative dar. Da das Operationsrisiko um den Transplantations-zeitpunkt aber erhöht ist, wurden Mikroinjektionspumpen nicht angewendet.

Die Applikationen von hGM-CSF 5–33 Wochen nach Knochenmarkstransplantation wurde in Anlehnung an das von NISHIJIMA et al. (1997) und WATANABE et al. (2000) verwendete Dosierungsschema von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich durchgeführt. Diese Dosierung von 1 µg hGM-CSF pro Tag und Maus entspricht in etwa einer Dosierung von 40 µg hGM-CSF pro Kilogramm und liegt deutlich über den beim Mensch und Hund verwendeten Dosierungen (BRANDT et al. 1988, HAMMOND et al. 1990). Auf eine theoretisch mögliche Behinderung der Rezeptordimerisierung mit ausbleibender Signaltransduktion durch Überangebot des Liganden bei hoher hGM-CSF-Konzentration konnte in vitro kein Hinweis gefunden werden.

Ba/F3 GMR-Zellen proliferierten auch bei Konzentrationen von bis zu 2000 ng/ml hGM-CSF. Eine Wirkungsreduktion durch Überdosierung von hGM-CSF besitzt somit nach den eigenen Ergebnissen keine Relevanz und wurde in der Literatur auch noch nicht beschrieben.

Neben der angeführten Dosierung wurden bei gleichbleibender Tagesdosis von 1 µg hGM-CSF auch zwei andere Dosierungschemata mit geringerer Zahl von Applikationen geprüft (1 µg hGM-CSF jeden Tag oder 2 µ g hGM-CSF alle zwei Tage). Dies geschah im Hinblick auf eine Stressminimierung, da eine stressbedingte Stimulation der Hämatopoese nicht

ausgeschlossen werden konnte. Allerdings sprachen die Ergebnisse dieses Vergleichs dafür, dass Schemata mit größeren Injektionsintervallen einen geringeren Effekt auf die Leukozytenzahl besitzen. Zudem war anhand der Ergebnisse der Kontrollgruppe, in der nach zweimaliger täglicher Injektion von PBS die Leukozytenzahl im Median um 0,45 x 10³/µl abnahm, keine stressbedingte Aktivierung der Hämatopoese festzustellen.

Der in der vorliegenden Arbeit nach Injektion von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich über 7 Tage gefundene Anstieg der Leukozytenzahl im Median um 3,9 x 10³/µl liegt deutlich unter den Verhältnissen der von NISHIJIMA et al. (1997) gefundenen Werte. NISHIJIMA et al. (1997) fanden nach einer Injektion von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich über 7 Tage einen Anstieg der Leukozytenzahl im Blut transgener Mäuse auf 24,5 x 10³/µl (Kontrolle: 3,4–3,7 x 10³/µl). Der deutliche Unterschied zwischen den Angaben in der Arbeit von NISHIJIMA et al. (1997) und der eigenen Untersuchung liegt in dem deutlich unterschiedlichen Anteil der Zellen mit Effektorfunktion begründet. Bei den in der zitierten Studie verwendeten transgenen Tieren kann durch die Injektionen mit hGM-CSF jede Zelle stimuliert werden (100 % für das Transgen positive Zellen), während in den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen nur die erfolgreich transduzierten und engrafteten Zellen mit hGM-CSF stimuliert werden konnten.

WATANABE et al. (2000) fanden hingegen nur einen moderaten Anstieg der Leukozytenzahl im Blut von für einen GMR (der sich von dem in dieser Arbeit verwendeten GMR in der zusätzlichen Glutaminsäure unterscheiden) transgenen Mäusen auf 3,5 x 10³/µl (Kontrollen:

2,47–2,83 x 10³/µl). Da schon bei den transgenen Tieren nur Veränderungen des Differentialblutbildes innerhalb der Referenzbereiche festzustellen waren (NISHIJIMA et al.

1997, WATANABE et al. 2000), konnte bei den in dieser Arbeit verwendeten Tieren kein Unterschied im Differentialblutbild zwischen den Tiergruppen erwartet werden, was auch experimentell bestätigt wurde.

Die Ergebnisse zum Effekt der vorher evaluierten Dosierung von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich auf die Leukozytenzahl bei transplantierten Mäusen werden durch die Ergebnisse des Over-Cross-Experimentes relativiert, in dem sich kein deutlicher Unterschied zur Kontrolle ergab, die in diesem Fall aus Mäusen bestand, die ebenfalls Zellen mit der Rezeptorvariante transplantiert bekamen. Die Ursache, warum im Over-Cross-Experiment die Leukozytenzahl

im Median in der Kontrollgruppe nach einer Behandlung mit PBS um 2,7 x 10³/µl anstieg, so dass kein Unterschied zu der Veränderung in der Behandlungsgruppe nachweisbar war, bleibt unklar. Die Tatsache, dass bei den nicht mit dem chimären Rezeptor transplantierten Mäusen in den orientierenden Studien keine entsprechenden Veränderungen nachweisbar waren, spricht gegen eine grundsätzlich denkbare unspezifische Stimulation des Knochenmarks durch die Blutentnahmen. Gleichfalls unklar bleibt, warum beim 2. Injektionsdurchgang des Over-Cross-Experiments mit hGM-CSF kein Effekt mehr zu erzielen war. Eine Ursache könnten die hier bereits deutlich höheren Ausgangswerte sein, die andeuten, dass das behandlungsfreie Intervall von einer Woche zwischen den Behandlungszyklen zu kurz gewählt war. Bei Planung des Versuches wurde in diesem Gesichtspunkt die Tatsache zu Grunde gelegt, dass der Effekt von hGM-CSF beim Menschen allenfalls 3–4 Tage anhält (BRANDT et al. 1988).

In zwei von sieben transplantierten I374N-Mäusen konnten Symptome festgestellt werden, die mit einer myeloproliferativen Erkrankung vereinbar waren.

Der kontinuierliche Anstieg verschiedener Parameter im Blutbild von Woche 8 bis Woche 26 nach Transplantation bei der I374N-Maus 6 spricht für eine erfolgreiche Transduktion einer Stammzelle oder frühen Vorläuferzelle, die klonal expandiert. Im Gegensatz dazu wurden bei der I374N-Maus 5 relativ konstante Veränderungen des Blutbildes von Woche 8 bis Woche 17 nach Transplantation festgestellt, so dass bei diesem Tier die Transduktion von einer oder mehreren, nicht klonal expandierenden Progenitorzellen wahrscheinlicher ist.

Molekulargenetische Untersuchungen, wie zum Beispiel die Feststellung, ob eine klonale oder polyklonale Erkrankung bei den I374N-Mäusen 5 und 6 vorlag, wären zur näheren Charakterisierung der Erkrankungen interessant gewesen, hätten jedoch den Rahmen dieser Arbeit gesprengt. Trotz der deutlichen Veränderungen im Blutbild war die I374N-Maus 6 beim Abschluss der Versuche klinisch unauffällig. Dieses Ergebnis geht konform mit Ergebnissen von McCORMACK und GONDA (1999), die ebenfalls GMR I374N exprimierende Knochenmarkszellen in Mäuse transplantierten und deutliche Veränderungen im Blutbild einige Monate vor der klinischen Erkrankung der Tiere beschrieben.

Eine hämatologische Erkrankung konnte während des Versuches in keiner der sieben transplantierten V449E-Mäusen festgestellt werden. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von

den Ergebnissen von McCORMACK und GONDA (1999). Diese Arbeitsgruppe berichtete von einer akuten-Leukämie-ähnlichen Erkrankung in 5 von 17 mit die GMR V449E exprimierenden Knochenmarkszellen transplantierten Mäusen innerhalb von 8 Monaten nach Transplantation. In der vorliegenden Arbeit sind die wahrscheinlichsten Ursachen der fehlenden Induktion einer hämatologischen Erkrankung sowohl in 7 mit R780 GMR V449E, wie auch in 5 mit R780 GMR I374N transplantierten Mäusen, die nicht ausreichende Transduktion der Zellen, auf die bereits bei der Besprechung der schwankenden Genexpression eingegangen wurde, und/oder die fehlende Expression des Transgens. Die Transduktionseffizienz der transplantierten, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit R780 GMR V449E und R780 GMR I374N war in der vorliegenden Arbeit mit 10–17 % im Vergleich zu der Arbeit von McCORMACK und GONDA (1999) (13–56 %) deutlich niedriger.

Da nach Untersuchungen von McCORMACK und GONDA (1997, 1999) eine immortalisierte Zellkultur aus die GMR V449E exprimierenden, hämatopoetischen Zellen aus der fetalen Leber nach subkutaner Injektion in Mäuse zu maximal 25 % Tumore und in Transplantationsversuchen selbst bei besserer Transduktionseffizienz nur bei 5 von 17 Tieren der transplantierten Tiere eine akute-Leukämie-ähnliche Erkrankung entstand, wird eine zweite Mutation als Voraussetzung zur Entstehung einer malignen Erkrankungen bei V449E-Mäusen angenommen.

Unter kriticher Berücksichtigung dieser Faktoren, muss die gewählte Tierzahl von n = 7 als zu gering eingestuft werden, um eine zuverlässige Aussage zur möglichen Induktion einer hämatologischen Erkrankung mit diesem Rezeptor treffen zu können. Für die Zukunft ist die Durchführung der Versuche mit entsprechend hohen Tierzahlen ist zu empfehlen.

Auf Grund der generell geringen Transduktionseffizienz beim retroviralen Gentransfer wäre die Möglichkeit der In-vivo-Selektion ein wichtiges Hilfsmittel, um die Anzahl der transduzierten Zellen zu erhöhen. So entwickelten NAGASHIMA et al. (2004) ein selektives Verstärkergen mit dem EPO-Rezeptor als Schalter. Trotz der in der vorliegenden Arbeit

Im Dokument In-vitro- und In-vivo-Funktionsanalyse von hGM-CSF-Zytokinrezeptor-Varianten in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (Seite 131-200)