Methoden der In-vitro-Versuche

3.3.6.1 Kultivierung von transduzierten, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen bei unterschiedlichen Zytokinbedingungen zur Ermittlung einer geeigneten Zytokinbedingung

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden in initialen Vorversuchen unter Zugabe von drei verschiedenen, aus der Literatur entnommenen Zytokincocktails in X-VIVO-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin kultiviert (Tab. 9). An Tag 3 nach Aufreinigung der murinen lineage-negativen Zellen erfolgte eine Transduktion mit dem retroviralen Vektor R780 GMR (MOI 2) unter Zugabe von 6,7 µg/ml Polybrene oder 4 µ g/ml Protaminsulfat gefolgt von einer Messung im Durchflusszytofluorometer an Tag 6 nach Aufreinigung der Zellen, um die Anzahl der transduzierten, GFP-positiven Leukozyten zu ermitteln.

Tabelle 9: In der Literatur verwendete Zytokincocktails zur Kultivierung muriner WAHLERS et al. (2001, 2002), LI et al. (1999)

Abkürzungen: mSCF = muriner Stammzellfaktor; mIL = murines Interleukin; hFLT3 = humaner FLT3-Ligand;

hIL = humanes Interleukin

3.3.6.2 Kultivierung von Zellen einer murinen Pro-B-Zelllinie, die den

GMR exprimieren, mit verschiedenen Konzentrationen des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors Durchflusszytofluorometer nach Zugabe von PI auf Vitalität untersucht. Zur Kontrolle wurden Ba/F3 GMR-Zellen unter Zugabe von 10 % WEHI-3B konditioniertem Medium als IL3-Quelle und den beschriebenen Konzentrationen von hGM-CSF kultiviert.

3.3.6.3 Funktionelle Evaluation der verwendeten Transgene in Zellen einer murinen Pro-B-Zelllinie

Zur Untersuchung der Funktionalität der verwendeten Transgene wurde die Expression der Transgene in der Ba/F3-Zelllinie gewählt, da der Wildtyp dieser Zelllinie weder murines GM-CSF noch hGM-CSF bindet. Die Expression der GMR und der GMR in Ba/F3-Zellen konstituiert einen funktionellen hGMR, der die Langzeitproliferation der Zellen in Abhängigkeit von hGM-CSF ermöglicht (KITAMURA et al. 1991).

Zur funktionellen Evaluation des Transgenplasmides R780 GMR in vitro wurden IL3-abhängig wachsende Ba/F3-Zellen mit dem R780 GMR transduziert (MOI 2) und anschließend in RPMI-Medium mit 1 % P/S, 10 % FCS und 10 % WEHI-3B konditioniertem Medium in einer 24-Loch-Platte kultiviert und bei Bedarf passagiert. An Tag 17 nach der Transduktion mit dem R780 GMR wurden die Ba/F3 R780 GMR-Zellen mit PBS gewaschen und in RPMI-Medium mit 1 % P/S, 10 % FCS entweder mit 10 % WEHI-3B konditioniertem Medium oder mit 20 ng/ml hGM-CSF kultiviert. Zur Kontrolle wurden Ba/F3 R780 GMR-Zellen in dem beschriebenen Zellkulturmedium ohne Zytokine kultiviert. An Tag 20 nach der Transduktion folgte eine lichtmikroskopische Beurteilung der Zellen und eine durchflusszytofluorometrische Messung zur Bestimmung des prozentualen Anteils der transduzierten, GFP positiven Zellen.

Zur funktionellen Evaluation des Transgens für die GMR V449E wurden IL3-abhängig wachsende Ba/F3-Zellen mit den entsprechenden viralen Vektoren transduziert und anschließend in RPMI-Medium mit 1 % P/S, 10 % FCS und 10 % WEHI-3B konditioniertem Medium kultiviert. An Tag vier nach der Transduktion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend in RPMI-Medium mit 1 % P/S und 10 % FCS mit und ohne Zusatz von 10 % WEHI-3B konditioniertem Medium kultiviert. Zur Kontrolle wurden nichttransduzierte Ba/F3-Zellen in den gleichen Medien kultiviert. An Tag 7 nach der Transduktion erfolgte eine lichtmikroskopische Beurteilung der Zellen und eine durchflusszytofluorometrische Messung zur Bestimmung des prozentualen Anteils der transduzierten, GFP positiven Zellen.

Zur Generierung 100 % GFP-positiver Klone wurden Ba/F3 R780 GMR V449E-Zellen, die vorher ohne IL3-Zusatz kultiviert wurden, 12 Tage nach der Transduktion mit PBS gewaschen und in RPMI-Medium mit 1 % P/S und 10 % FCS aufgenommen. In einem Ansatz mit limitierender Verdünnung wurden insgesamt 20 Zellen in dem beschriebenen Medium in

einer 96-Loch-Platte ausgesät und für 8 Tage im Brutschrank kultiviert. Die entstandenen Zellpopulationen wurden passagiert und im Durchflusszytofluorometer auf GFP-Expression untersucht.

Da für die Signaltransdukion der GMR I374N die Interaktion mit der -Kette des hGMR Voraussetzung ist, konnte die Funktionalität des Transgens R780 GMR I374N in Ba/F3-Zellen nicht getestet werden, da diese Zellen die -Kette des hGMR nicht exprimieren.

3.3.6.4 Funktionelle Evaluation von R780 GMR in murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden mit R780 GMR transduziert und in X-Vivo-Medium mit 1% P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin mit mSCF, mIL3 und mIL6 (Konzentrationen siehe Tab. 8) kultiviert. An Tag 4 nach der Transduktion wurden die transduzierten Zellen mit PBS gewaschen und in X-Vivo-Medium mit 1% P/S, 1 % Glutamax und 1 % humanem Serumalbumin mit mSCF, mIL3 und mIL6 mit und ohne 20 ng/ml hGM-CSF kultiviert. An Tag 8 nach der Transduktion erfolgte die Bestimmung des prozentualen Anteils der transduzierten, GFP-positiven Leukozyten im Durchfluss-zytofluorometer.

3.3.6.5 Funktionelle Evaluation der verwendeten Transgene in Kolonie-Assays

Zum Nachweis der Funktionalität der Transgenplasmide R780 GMR, R780 GMR V449E und R780 GMR I374N wurden murine lineage-negative Knochenmarkszellen mit entsprechenden retroviralen Vekrtoren transduziert. Zur Kontrolle wurden nichttransduzierte oder mit den viralen Vektoren SEW oder R780 transduzierte, murine lineage-negative Knochenmarkszellen untersucht. An Tag 1 nach der Transduktion wurden 1 x 10³ transduzierte, murine lineage-negative Knochenmarkszellen in 1,5 ml Methylzellulose mit Zytokinen (rmSCF, rmIL3, rmIL6, rhEPO), in 1,5 ml Methylzellulose ohne Zytokine und zum Teil in 1,5 ml Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CSF (Tab. 10) pipettiert, 5 Sekunden auf einem Rüttelmischer gemischt und in eine 35 mm x 10 mm Petrischale überführt. Nach Inkubation der Kolonie-Assays bei 37 °C in einem ausreichend feuchten Brutschrank konnte

die Anzahl der entstandenen Kolonien und die Anzahl der GFP-positiven Kolonien unter einem Fluoreszenzmikroskop zwischen Tag 7 und Tag 14 bei 10-facher Vergrößerung gezählt werden. Nichttransduzierte, murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden am Tag der Gewinnung in den Kolonie-Assay gegeben. In dieser Arbeit wurden Kolonien ab einer Größe von 10 Zellen gezählt, die nach METCALF (1984) als Cluster bezeichnet werden; eine Unterscheidung in Kolonien und Cluster wurde in dieser Arbeit nicht durchgeführt.

Zur Untersuchung, ob die Kolonienbildung entsprechend transduzierter, muriner lineage-negativer Knochenmarkszellen in Methylzellulose bei Zugabe von hGM-CSF oder in Methylzellulose ohne Zytokine mit der Zeit durch verstärkte Genexpression zunimmt, wurden Kolonie-Assays mit murinen lineage-negative Knochenmarkszellen nach einer Transduktion mit R780 GMR (Versuch 8), R780 GMR V449E (Versuch 3) oder R780 GMR I374N (Versuch 3) an Tag 1, Tag 2, Tag 3, Tag 4 und Tag 8 nach der Transduktion angesetzt und nach 14-tägiger Kultivierung ausgewertet. In diesem Versuch wurden die in Tabelle 10 beschriebenen Methylzellulosen für alle drei Transgenplasmide verwendet. Zusätzlich wurde die GFP-Expression der transduzierten murinen lineage-negativen Zellen in Suspensionskultur an Tag 2, Tag 3, Tag 4 und Tag 8 im Durchflusszytofluorometer gemessen.

Tabelle 10: Zur Durchführung von Kolonie-Assays verwendete Methylzellulosen mit unterschiedlichen Zytokingehalten.

Methylzellulose enthaltene Zytokine zugesetzte Zytokine Methocult GF M3434 50 ng/ml rmSCF,

10 ng/ml rmIL3, 10 ng/ml rhIL6, 3 U/ml rhEPO

-

Methocult H 4230 - 20 ng/ml hGM-CSF

Methocult H 4230 - -

Abkürzungen: rmSCF = rekombinanter, muriner Stammzellfaktor; rmIL = rekombinantes, murines Interleukin;

rhIL = rekombinantes, humanes Interleukin; rhEPO = rekombinantes, humanes Erythropoietin; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor;

Da die Grünfluoreszenz der Kolonien im Fluoreszenzmikroskop sehr schwach zu erkennen war, wurden neun Kolonien, die von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach der Transduktion mit dem Transgenplasmid R780 GMR I374N in Methylzellulose ohne Zytokine gebildet wurden, an Tag 15 der Kultivierung im Kolonie-Assay gewonnen, DNA aus den Zellen isoliert und qualitativ mithilfe einer Real-Time-DNA-PCR untersucht.