Methoden der In-vivo-Versuche

3.3.8.1 Injektion des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors

Mäuse, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit R780 transplantiert wurden (R780-Mäuse), Mäuse, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit SEW transplantiert wurden (SEW-Mäuse), Mäuse, die mit murinen lineage-negativen, R780 GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden (R780 GMR-Mäuse) und Mäuse, die mit murinen lineage-negativen, R702 GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurden (R702 GMR-Mäuse) bekamen subkutane Injektionen mit PBS oder hGM-CSF gelöst in PBS. Dabei wurden die Mäuse am Schwanz leicht fixiert und die Substanzen in eine dorsal aufgezogene Hautfalte appliziert. Die Injektionen erfolgten immer an 7 Tagen hintereinander; die verschiedenen Dosierungen werden bei der Methodenbeschreibung der einzelnen Versuchen angegeben.

3.3.8.2 Blutentnahme bei der Maus

Zur Blutentnahme wurden die Mäuse nach einer Betäubung mit Diethylether im Nacken fixiert und mithilfe einer Ethylendiamintetraessigsäure-beschichteten 20 µl Glaskapillare vom medialen Augenwinkel aus retrobulbär in der Regel 40–80 µl, im Ausnahmefall maximal 120 µl Blut entnommen und dieses in mit Ethylendiamintetraessigsäure beschichteten Microvetten aufgefangen und geschwenkt.

3.3.8.3 Untersuchung des Blutes

Im Hämatologiesystem wurde aus dem Blut ein Blutbild erstellt (Tab. 11; Tab. 63, Tab. 64 und Tab 65, Anhang). Reichte der voreingestellte Messbereich des Hämatologiesystems nicht aus, so wurde die Blutprobe 1:10 mit PBS verdünnt und erneut gemessen. Die so ermittelten Werte mussten anschließend mit 10 multipliziert werden. Im Durchflusszytofluorometer konnte die GFP-Expression der Leukozyten nach Optilyse des Vollblutes nach Herstelleranweisung ermittelt werden. Die Optilyse wurde zur Beseitigung der Erythrozyten durchgeführt.

Außerdem wurden Blutausstriche auf Objektträgern angefertigt, nach Pappenheim gefärbt und mikroskopisch beurteilt. Dabei wurden 100 Leukozyten differenziert und ein Differentialblutbild erstellt mit Angabe des prozentualen Anteils der Lymphozyten, der segmentkernigen, neutrophilen Granulozyten, der stabkernigen, neutrophilen Granulozyten, der eosinophilen und basophilen Granulozyten und der Monozyten. Zusätzlich zu den 100 differenzierten Zellen wurde die Anzahl der Normoblasten angegeben. Da die Zellen des Mausblutes fragil sind, waren viele Zellen im Blutausstrich defekt. Es wurde nur die Zellen differenziert, die eindeutig zuzuordnen waren.

Tabelle 11: Im Hämatologiesystem der scil animal care company gemessene Blutparameter bei der Untersuchung des Mausblutes mit den entsprechenden Einheiten und den vom Hersteller des Gerätes angegebenen Referenzbereichen für Mausblut.

Messgröße Einheit Referenzbereich

Leukozytenzahl 10³/µl 3,0–15,0

Erythrozytenzahl 10⁶/µl 5,0–12,0

Hämoglobin g/dl 11,1–18,0

Hämatokrit % 36,0–52,0

Thrombozytenzahl 10³/µl 140–600

3.3.8.4 Untersuchung getöteter Tiere

Die Mäuse wurden am Ende der Versuche oder wenn sie früher erkrankten nach Betäubung mit Diethylether durch zervikale Dislokation getötet und pathologisch-anatomisch untersucht.

Für eine histologische Untersuchung wurden Proben von Milz, Nieren, Leber, Lungen, Thymus, Sternum und auffälligen Organen entnommen, zurechtgeschnitten und in 4%-iger Formalinlösung für mindestens 48 Stunden konserviert. Eine histologische Untersuchung angefertigter Schnitte nach Hämatoxylin-Eosin-Färbung erfolgte durch Mitarbeiter des Institutes für Zell- und Molekularpathologie der Medizinischen Hochschule Hannover.

Außerdem wurden Knochenmarkszellen aus Femur und Tibia ausgespült und nach Optilyse nach Herstelleranweisung im Durchflusszytofluorometer auf GFP-Expression untersucht.

Zusätzlich wurden Kolonie-Assays mit 5 x 10⁴ und 1 x 10⁵ Knochenmarkszellen in Methylzellulose mit rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO, in Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CFS und in Methylzellulose ohne Zytokine angesetzt. Die übrigen Knochenmarkszellen wurden in X-Vivo-Medium mit 1 % P/S, 1 % Glutamax, 1 % humanem Serumalbumin und 10 % Dimethylsulfoxid bei -80 °C für 48 Stunden eingefroren und anschließend bei -196 °C konserviert.

3.3.8.5 Nachweis der viralen Transduktion hämatopoetischer Stammzellen im Knochenmarkstransplantationsmodell

Murine lineage-negative Knochenmarkszellen wurden mit dem lentiviralen Vektor SEW und mit dem retroviralen Vektor R702 GMR transduziert. Mit 1 x 10³ transduzierten Knochenmarkszellen wurden an Tag 1 nach der Transduktion Kolonie-Assays in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6 und rhEPO) in Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CSF und in Methylzellulose ohne Zytokine angesetzt und an Tag 11 der Kultivierung unter einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Die Gesamtzahl der Kolonien und die Anzahl der GFP-positiven Kolonien wurde gezählt. Außerdem wurden konditionierte Empfängertiere mit den transduzierten, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen transplantiert. Sechs Monate nach der Transplantation wurde den Mäusen Blut entnommen, das Blut untersucht und die Tiere getötet. Nach Isolation von Knochenmarkszellen aus Femur und Tibia und Optilyse nach Herstelleranweisung erfolgte eine durchflusszytofluorometrische Messung zur Bestimmung des prozentualen Anteils der

GFP-positiven Zellen im Knochenmark. Die Fähigkeit Kolonien zu bilden wurde mit 5 x 10⁴ und 1 x 10⁵ nicht aufgereinigten Knochenmarkszellen (ohne vorhergehende Optilyse) in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO) und in Methylzellulose mit ausschließlich 20 ng/ml hGM-CSF untersucht. Die Anzahl der Kolonien und die Anzahl der GFP-positiven Kolonien wurde an Tag 8 der Kultivierung bei 37 °C mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. An Tag 15 der Kultivierung wurden aus 17 Kolonien, die in Methylzellulose mit 20 ng/ml hGM-CSF gewachsen sind, DNA isoliert und in einer Real-Time-DNA-PCR untersucht. Die PCR-Produkte wurden außerdem zusammen mit dem DNA Molekular Gewichts Marker V und einer 10-Basenpaar-DNA-Leiter auf ein 2%-iges Agarosegel aufgetragen und durch Elektrophorese aufgetrennt. Zusätzlich wurde das aus den getöteten Mäusen gewonnene Knochenmark ohne Aufreinigung seriell in konditionierte Empfängermäuse transplantiert. Den seriell transplantierten Tieren wurde 6 Wochen nach der Transplantation Blut entnommen und untersucht. Die Tiere wurden anschließend getötet, seziert und Knochenmark aus Femur und Tibia gewonnen. Die Knochenmarkszellen wurden im Durchflusszytofluorometer nach Optilyse untersucht. 5 x 10⁴ nicht aufgereinigte Knochenmarkszellen wurden im Kolonie-Assay in Methylzellulose mit einem Zytokincocktail (rmSCF, rmIL3, rhIL6, rhEPO) in Methylzellulose ohne Zytokine und in Methylzellulose mit ausschließlich 20 ng/ml hGM-CSF 10 Tage kultiviert und die Gesamtzahl der Kolonien und die Anzahl der GFP-positiven Kolonien unter einem Fluoreszenzmikroskop ermittelt.