In-vitro- und In-vivo-Funktionsanalyse
von hGM-CSF-Zytokinrezeptor-Varianten
in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Verterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Stephanie A. Odenbrett
aus Wesel
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Apl.-Prof. Dr. M. Eder
1. Gutachter: Prof. Dr. R. Mischke
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Hedrich
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2005
Für meine Eltern
1. Einleitung ... 17
2. Literaturübersicht ... 20
2.1 Hämatopoese ... 20
2.1.1 Das Stammzellmodell der Hämatopoese... 20
2.1.2 Die Hämatopoese der Maus... 24
2.2 Ausgewählte Aspekte zur Untersuchung genetisch veränderter ... hämatopoetischer Zellen im Mausmodell ... 25
2.2.1 Vorteile des Mausmodells ... 25
2.2.2 Nachteile des Mausmodells... 25
2.2.3 Aufbau retroviraler Vektoren ... 26
2.2.4 Retroviraler Gentransfer... 27
2.2.5 Bestrahlung und Knochenmarkstransplantation bei der Maus ... 28
2.2.6 Einsatzmöglichkeiten des grünfluoreszierenden Proteins als Marker... 30
2.3 Zytokine und Zytokinrezeptoren... 30
2.3.1 Zytokine als Wachstumsfaktoren ... 30
2.3.2 Zytokinrezeptoren ... 31
2.4 Der Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- ... stimulierenden Faktor und sein Ligand... 33
2.4.1 Aufbau und Wirkung des Liganden ... 33
2.4.2 Aufbau des Rezeptors... 34
2.4.3 Effekte des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden ... Faktors in der Maus ... 35
2.5 Der chimäre Rezeptor GMR ... 38
2.5.1 Aufbau ... 38
2.5.2 Funktion in vitro ... 40
2.5.3 Funktion in vivo... 41
2.6 Konstitutiv aktive Mutationen der GMR ... 42
2.6.1 Aufbau ... 42
2.7.2 Befunde einer leukämischen Erkrankung in der Maus ... 46
2.7.3 Klassifikation nichtlymphatischen, hämatopoetischen Neoplasien bei der Maus ... 47
2.7.3.1 Nichtlymphatische Leukämien... 47
2.7.3.2 Nichtlymphatische hämatopoetische Sarkome ... 48
2.7.3.3 Myeloische Dysplasie ... 48
2.7.3.4 Myeloische nichtreaktive Proliferationen ... 49
3. Material und Methoden ... 50
3.1 Materialien ... 50
3.1.1 Geräte ... 50
3.1.2 Verbrauchsmaterial ... 52
3.1.3 Medien für die Zellkultur ... 53
3.1.4 Puffer und Stammlösungen ... 53
3.1.5 Chemikalien ... 54
3.1.6 Zelllinien ... 57
3.1.7 Bakterien ... 57
3.1.8 Plasmide ... 57
3.1.9 Software ... 57
3.2 Versuchstiere ... 58
3.2.1 Spendertiere... 58
3.2.2 Empfängertiere ... 58
3.2.3 Haltung der Versuchstiere... 58
3.3 Methoden ... 59
3.3.1 Gewinnung von Plasmiden ... 59
3.3.1.1 Kultivierung von Bakterien... 59
3.3.1.2 Transformation kompetenter Bakterien ... 59
3.3.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ... 59
3.3.1.4 DNA-Spaltung mit Restriktionsenzymen ... 60
3.3.1.5 Agarose-Gelelektrophorese... 60
3.3.2.2 Allgemeine Methoden der Zellkultur ... 62
3.3.2.3 Präparation viraler Überstände ... 62
3.3.2.4 Titerbestimmung der viralen Überstände ... 63
3.3.2.5 Transduktion von Zellen einer murinen Pro-B-Zelllinie... 64
3.3.2.6 Kultivierung transduzierter Zellen einer murinen Pro-B-Zelllinie... 64
3.3.3 Durchflusszytofluorometrische Analysen ... 65
3.3.3.1 Prinzip ... 65
3.3.3.2 Zellmarkierung mithilfe von Antikörpern ... 66
3.3.4 Quantitative Real Time-Polymerase-Kettenreaktion... 67
3.3.4.1 Prinzip ... 67
3.3.4.2 Durchführung ... 67
3.3.5 Isolierung von Stammzellen ... 68
3.3.5.1 Gewinnung von murinem Knochenmark ... 68
3.3.5.2 Gewinnung muriner lineage-negativer Knochenmarkszellen ... 69
3.3.5.3 Kultivierung von murinen lineage-negativen Zellen ... 70
3.3.5.4 Durchflusszytofluorometrische Analyse zur Bestimmung der Reinheit ... der depletierten, murinen Knochenmarkszellen ... 70
3.3.5.5 Transduktion von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen ... 72
3.3.6 Methoden der In-vitro-Versuche ... 73
3.3.6.1 Kultivierung von transduzierten, murinen lineage-negativen Knochenmarks- ... zellen bei unterschiedlichen Zytokinbedingungen zur Ermittlung einer ... geeigneten Zytokinbedingung ... 73
3.3.6.2 Kultivierung von Zellen einer murinen Pro-B-Zelllinie, die den ... GMR exprimieren, mit verschiedenen Konzentrationen des humanen... Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors ... 74
3.3.6.3 Funktionelle Evaluation der verwendeten Transgene in Zellen einer murinen ... Pro-B-Zelllinie... 75
3.3.7 Methoden der Knochenmarkstransplantation ... 78
3.3.7.1 Bestrahlung der Empfängermäuse ... 78
3.3.7.2 Antibiotische Versorgung ... 78
3.3.7.3 Knochenmarkstransplantation... 78
3.3.8 Methoden der In-vivo-Versuche... 79
3.3.8.1 Injektion des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden ... Faktors... 79
3.3.8.2 Blutentnahme bei der Maus ... 79
3.3.8.3 Untersuchung des Blutes... 80
3.3.8.4 Untersuchung kranker und gestorbener Tiere ... 81
3.3.8.5 Nachweis der viralen Transduktion hämatopoetischer Stammzellen im ... Knochenmarkstransplantationsmodell ... 81
3.3.9 Versuche mit transplantierten Mäusen... 82
3.3.9.1 Gabe des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden ... Faktors während des frühen Engraftments... 83
3.3.9.2 Gabe des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden ... Faktors ab 5 Wochen nach der Transplantation ... 83
3.3.9.3 Durchführung eines Over-Cross-Experimentes ... 84
3.3.9.4 Tansplantation von die GMR V449E und die GMR I374N ... exprimierenden Knochenmarkszellen ... 85
3.3.10 Statistik... 86
4. Ergebnisse ... 88
4.1 In-vitro-Versuche... 88
4.1.1 Proliferation von Ba/F3 GMR-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen ... des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors ... 88
4.1.2 Funktionelle Evaluation der verwendeten Transgenplasmide in Zellen einer ... murinen Pro-B-Zelllinie ... 89
4.1.2.1 Funktionelle Evaluation von R780 GMR V449E ... 89
4.1.3.1 Reinheitsbestimmung ... 93
4.1.3.2 Verschiedene Zytokinbedingungen zur Kultivierung und Transduktion ... 94
4.1.3.3 Transduktionseffizienz von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen ... 95
4.1.4 Funktionelle Evaluation der verwendeten Transgenplasmide in murinen ... lineage-negativen Knochenmarkszellen... 95
4.1.4.1 Koloniebildung von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen ... 95
4.1.4.2 Funktionelle Evaluation von R780 GMR... 95
4.1.4.3 Funktionelle Evaluation von R780 GMR V449E ... 102
4.1.4.4 Funktionelle Evaluation von R780 GMR I374N ... 102
4.2 In-vivo-Experimente... 106
4.2.1 Etablierung eines Knochenmarkstransplantationsprotokolls und Nachweis ... der In-vitro-Funktionalität des GMR nach Knochenmarkstransplantation... 106
4.2.2 Transplantation von den GMR exprimierenden lineage-... negativen Knochenmarkszellen... 112
4.2.2.1 Effekt von subkutanen Injektionen mit dem humanen Granulozyten-... Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor während des frühen Engraftments 112 4.2.2.2 Stimulation transplantierter Mäuse mit dem humanen Granulozyten-... Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor ab 5 Wochen nach ... Transplantation ... 115
4.2.2.3 Ergebnisse des Over-Cross-Experimentes ... 118
4.2.2.4 Verlust von für das grün fluoreszierende Protein positiven Zellen im Blut... 118
4.2.3 Untersuchung der getöteten R780-Mäuse und R780 GMR-Mäuse ... 121
4.2.4 In-vivo-Induktion einer hämatopoetischen Erkrankung ... 123
4.2.4.1 Transplantation von die GMR V449E exprimierenden, murinen lineage- ... negativen Knochenmarkszellen... 123
4.2.4.2 Transplantation von die GMR I374N exprimierenden, murinen lineage- ... negativen Knochenmarkszellen... 125
4.3 Untersuchung von Kontrollmäusen ... 131
“ = Zoll
µg = Mikrogramm µl = Mikroliter µmol = Mikromol Abb. = Abbildung
AML = akute myeloische Leukämie*
APC = Allophycocyanin B = B-Lymphozyt *
Ba/F3 R780 GMR-Zellen = Ba/F3-Zellen nach Transduktion mit R780 GMR
Ba/F3 GMR-Zellen = Ba/F3-Zellen, die einen chimären Rezeptor für den humanen Granulozyten-makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor stabil exprimieren
Ba/F3-Zellen = Zellen einer IL3-abhängig wachsenden, murine Pro-B-Zelllinie Baso = basophiler Granulozyt *
BFU = burst forming unit bzw. = beziehungsweise
CD = cluster of differentiation, international standardisierte Nomenklatur für Antigene auf Zelloberflächen
CD11b = myeloisches Differenzierungsantigen
CFU = colony forming unit, Kolonie-bildende Einheit *
c-kit = Antigen auf hämatopoetischen Stammzellen und myeloerythroiden und lymphozytären Vorläufern
CLP = common lymphoid progenitor, gemeinsamer lymphoider Vorläufer * CMP = common myeloid progenitor, gemeinsamer myeloischer Vorläufer * d.h. = das heißt
dl = Deziliter *
DMEM = Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA = Desoxyribonukleinsäure
Eo = eosinophiler Granulozyt * EPO = Erythropoietin
ErP = Erythrozytenprogenitor * et al. = et altera, und andere
FACS = Fluorescence-activated cell sorter, Durchflusszytofluorometer FCS = fetal calf serum, fetales Kälberserum
FITC = Fluoresceinisothiocyanat FLT3 = FLT3-Ligand *
FSC = forward light scatter, Vorwärtsstreulicht g = Gramm
G = neutrophiler Granulozyt *
gag = Gen für retrovirale, gruppenspezifische Antigene G-CSF = Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor*
GEMM = Granulozyt-Erythrozyt-Makrophage-Megakaryozyt ges. = Gesamtzahl *
GFP = Grün-fluoreszierendes Protein
GFP+ = positiv für das grün fluoreszierende Protein *
GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor GMP = Granulozyten-Makrophagen-Progenitorzelle*
h = human
HEPES = 4-(2-Hydroxyethyl)1-Piperazinethansulfonsäure
hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
hGMR = Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor
I374N-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, die GMR I374N exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde
IF = Interferon *
IL = Interleukin k = Kilo
KBE = Kolonie-bildende Einheit
KMT = Knochenmarkstransplantation * L = Lymphozyt *
LTR = long terminal repeat M = Makrophage *
m = murin
MACS = magnetic cell sorting, magnetische Zellsortierung mCD45 = gemeinsames Antigen auf murinen Leukozyten mCD45/B220 = Antigen auf murinen B-Lymphozyten mCD5 = Antigen auf murinen T-Lymphozyten
M-CSF = Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor*
Meg = Megakariozyt*
MEP = Megakaryozyten-Erythrozyten-Progenitor * mg = Milligramm
mGM-CSF = muriner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor*
MK = Megakaryozyt *
MkP = Megakaryozytenprogenitor * ml = Milliliter
mLy6G/Gr1 = Antigen auf murinen Monozyten und Granulozyten mm = Millimeter
MOI = multiplicity of infection, Anzahl der Viruspartikel pro Zelle mol/l = Mol (6,023 x 1023 Atome oder Moleküle) pro Liter
MPS = myeloproliferatives Syndrom*
mTer119 = Antigen auf murinen Erythrozyten ng = Nanogramm
nGZ = neutrophile Granulozyten*
pmol = pikomol
P/S = Penicillin/Streptomycin
PBS = phosphat buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung PCR = polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PE = Phycoerythrin
PI = Propidiumjodid
pol = Gen für die retrovirale reverse Transkriptase, die Protease und die Integrase r = rekombinant
R702 = retrovirales Plasmid
R702 GMR-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, R702 GMR exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde
R780 = retrovirales Plasmid
R780 GMR = retrovirales Plasmid mit dem Transgen für den chimären Rezeptor GMR R780-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, R780
exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde
R780-Mäuse = Mäuse, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit R780 transplantiert wurden
RNA = Ribonukleinsäure
RPMI-Medium = Roswell Park Memorial Institute-Medium S. = Seite(n)
SA = Streptavidin *
sca1 = Antigen auf multipotenten hämatopoetischen Stammzellen SCF = stem sell factor, Stammzellfaktor
SEW = lentivirales Plasmid
SEW-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen nach Transduktion mit SEW transplantiert wurde
SSC = sideward light scatter, Seitwärtsstreulicht T = T-Lymphozyt *
V449E-Maus = Maus, die mit murinen lineage-negativen, die GMR V449E exprimierenden Knochenmarkszellen transplantiert wurde
vsv.g = Hülle des vesikulären Stomatitisvirus
WEHI-3B konditioniertes Medium = Zellüberstand einer Zelllinie, die mIL3 ins Medium abgibt
GMR = die Alphakette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor
GMR = der chimärer Rezeptor aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette und dem zytoplasmatischen Teil der -Kette des Rezeptors für den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors
GMR = die Betakette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktor
GMR I374N = die Betakette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor mit einer Punktmutation in der Transmembranregion
GMR V449E = die Betakette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor mit einer Punktmutation in der extrazellulären Region
1. Einleitung
Mausmodelle bieten grundsätzlich gute Möglichkeiten zur Untersuchung der Pathogenese von humanen Leukämien, insbesondere der chronischen myeloischen Leukämie. Für diese Leukämie wurden bisher in erster Linie Mausmodelle mit dem Transgen für ein Fusionsgen auf Chromosom 22 (bcr-abl, Philadelphiachromosom) benutzt, da die chronische myeloische Leukämie des Menschen bei 90 % der Patienten mit dieser Chromosomentranslokation (bcr-abl) assoziiert ist (SHET et al. 2002, VAN ETTEN 2002). Mithilfe dieser Chromosomenaberration wurden murine Leukämiemodelle für die humane chronische myeloische Leukämie entwickelt. Nachteilig bei diesem Modell ist die fehlende Induzierbarkeit und die schnelle Progression der Erkrankung bei den Versuchstieren.
Transgene Tiere erkranken bereits kurz nach der Geburt; mit bcr-abl exprimierenden Knochenmarkszellen transplantierte Tiere erkranken 3–5 Wochen nach der Transplantation (LIN et al. 2001).
Das durch eine Chromosomentranslokation zwischen Chromosom 9 und 22 entstandene Fusionsgen bcr-abl kodiert für eine durch die Fusion aktivierte Tyrosinkinase, die das Zellwachstum reguliert. Dadurch werden verschiedenen Signaltransduktionswege aktiviert, die auch von den humanen Zytokinenen Stammzellfaktor (SCF), Thrombopoietin, Interleukin (IL) 3 und (humaner) Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (hGM-CSF) benutzt werden (SATTLER u. SALGIA 1997).
Auch Veränderungen an Zytokinrezeptoren kommt eine Rolle bei der Entstehung von Leukämien zu. So zeigten ALEXANDER und NICOLA (1999) experimentell das leukämogene Potential mutierter Zytokinrezeptoren und klinisch konnte bei myeloischen Leukämiene eine aktivierende Mutation von einem Antigen auf hämatopoetischen Stammzellen und myeloerythroiden und lymphozytären Vorläufern (c-kit) nachgewiesen werden (KIMURA et al. 1997, ASHMAN et al. 2000). Außerdem kann der hGM-CSF die Proliferation von Tumorzellen akuter und chronischer myeloischer Leukämie sowie von malignen Plasmazellen und zusätzlich das Wachstum einiger nichthämatopoetischer Tumorzelllinien stimulieren (BALDWIN et al. 1991, RIVAS et al. 1998, TSURATA et al.
1998, VILLUNGER et al. 1998). Eine autokrine hGM-CSF-Produktion von leukämischen
Zellen bei chronischen und akuten myeloischen Leukämien beschrieben McCORMACK und GONDA (1999).
Der Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (hGMR) besteht aus einer -Kette, die den Liganden mit geringer Affinität bindet und Differenzierungssignale vermittelt, und einer -Kette, die zusammen mit der -Kette den Liganden mit hoher Affinität bindet und Überlebens- und Proliferationssignal vermittelt. Von EDER et al. (1994) wurde ein chimärer Rezeptor aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette und dem zytoplasmatischen Teil der -Kette des hGMR generiert ( GMR). Dieser Rezeptor vermittelte in einer murinen Pro-B-Zelllinie (Ba/F3-Zellen) in Abhängigkeit von hGM-CSF Überlebens- und Proliferationssignale, so dass es lohnend erschien, diesen Rezeptor im Mausmodell näher zu untersuchen.
Ziel war die Generierung eines Modells für eine induzierbare Leukämie in der Maus, um die Pathogenese von humanen chronischen myeloischen Leukämien weiter zu untersuchen. Des weiteren war die mögliche Nutzung des chimären GMR zur In-vivo-Selektion genetisch veränderter Zellen Gegenstand der vorliegenden Arbeit, da die geringe Transduktionseffizienz ein großes Problem beim retroviralen Gentransfer ist. Bisher wurde ein neuartiges, selektives Verstärkergen mit dem Erythropoietin-Rezeptor als Schalter als Möglichkeit der In-vivo- Selektion entwickelt (NAGASHIMA et al. 2004). Neben dem von EDER et al. (1994) generierte chimäre GMR wurden in der vorliegenden Arbeit als Positivkontrollen zwei konstitutiv aktive -Kettenrezeptormutanten in vivo und in vitro untersucht.
Folgende Fragestellungen sollten bearbeitet werden:
1. Kann der chimäre GMR in Abhängigkeit von hGM-CSF in der murine Pro-B- Zelllinie Ba/F3 und in murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen Überleben und Proliferation vermitteln?
2. Welchen Effekt hat der chimäre GMR in Abhängigkeit von hGM-CSF in vivo während des frühen Engraftments und 5–33 Wochen nach der Transplantation auf die Leukozytenzahl und den prozentualen Anteil transduzierter Zellen im Blut der transplantierten Tiere?
3. Eignet sich der GMR zur In-vivo-Selektion genetisch veränderter Zellen oder kann mit dem chimären GMR ein ligandenabhängiges Leukämiemodell entwickelt werden?
2. Literaturübersicht
Zum Verständnis der Funktion verschiedener Varianten des Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (hGMR) in hämatopoetischen Zellen sind Kenntnisse zum Aufbau des hämatopoetischen Systems und zur Wirkung von Zytokinen auf hämatopoetische Zellen wichtig. Außerdem soll in der vorliegenden Literaturübersicht auf die in dieser Arbeit verwendeten Rezeptorvarianten, ausgewählte Aspekte des Mausmodells und maligne hämatopoetische Erkrankungen bei der Maus eingegangen werden.
2.1 Hämatopoese
2.1.1 Das Stammzellmodell der Hämatopoese
Nach WILLIAMS (1995) und GASPER (2000) teilen sich pluripotente Stammzellen, reifen dabei zu multipotenten Vorläuferzellen, die weiter zu spezifischen Zellen ausdifferenzieren.
METCALF (1984) beschreibt das Stammzellmodell der Hämatopoese mit drei Kompartimenten:
1. die Stammzellen
2. die Progenitor- bzw. Vorläuferzellen
3. die differenzierten und morphologisch unterscheidbaren Zellen des Blutes.
Eine begrenzte Anzahl blutbildender Stamm- und Vorläuferzellen bilden durch zum Teil asymmetrische Zellteilungen die ständig benötigten reifen Blutzellen und erhalten gleichzeitig eine ausreichende Anzahl an pluripotenten, undifferenzierten Stamm- und Vorläuferzellen.
An der Spitze des hierarchisch aufgebauten Modells befinden sich die pluripotenten Stammzellen mit hoher Proliferationskapazität (mit anschließender Differenzierung zu funktionellen Zellen des Blutes) und der Fähigkeit zur Selbstreplikation (zum Erhalt des Stammzellkompartiments). Pluripotente Stammzellen können in alle Zellen der hämatopoetischen Reihe differenzieren (METCALF 1984).
Abbildung 1: Schematische Darstellung verschiedener Kolonie-bildender Einheiten der Hämatopoese.
Abkürzungen: KBE = Kolonie-bildende Einheit; GEMM = Granulozyt-Erythrozyt-Makrophage-Megakaryozyt;
L = Lymphozyt; BFU = burst forming unit; E = Erythrozyt; MK = Megakaryozyt; G = neutrophiler Granulozyt;
M = Makrophage; Baso = basophiler Granulozyt; Eo = eosinophiler Granulozyt; T = T-Lymphozyt;
B = B-Lymphozyt
Unter 0,01 % der Knochenmarkszellen haben Stammzelleigenschaften (BRECHER et al.
1988). Neben der Fähigkeit zur Selbsterhaltung haben Stammzellen auch die Fähigkeit, ihre Population zu vergrößern (BENVENISTE et al. 2003). Die Zellen des Kompartiments der Progenitorzellen besitzen nur noch eine geringe Fähigkeit zur Selbstreplikation und sind in ihrer Ausreifungskapazität auf wenige oder nur eine Differenzierungslinie des hämatopoetischen Systems beschränkt. Zellen des Progenitorkompartiments können in vitro in Methylzellulose, einem semisoliden Medium, nach 7–14-tägiger Kultur Kolonien bilden.
Diese Vorläuferzellen werden als Kolonie-bildende Einheit (KBE) bezeichnet und durch Angabe der gebildeten Zellen näher charakterisiert (METCALF 1984, Abb. 1). Die Proliferation von Vorläuferzellen führt zu Zellen, die morphologisch einer hämatopoetischen Reihe zugeordnet werden können. Diese Zellen bilden das dritte Kompartiment.
Abbildung 2: Entwicklung der hämatopoetischen Stammzellen: aus Stammzellen mit der Fähigkeit zur Langzeitrekonstitution entstehen Stamzellen mit der Fähigkeit zur Kurzzeitrekonstitution, die über multipotente Progenitorzellen ausdifferenzieren (modifiziert nach REYA et al. 2001).
Abkürzungen: CLP = common lymphoid progenitor, gemeinsame lymphoide Vorläuferzelle; CMP = common myeloid progenitor, gemeinsame myeloische Vorläuferzelle; NK-Zelle = natürliche Killerzelle;
GMP = Granulozyten-Monozyten-Progenitorzelle; MEP = Megakaryozyten-Erythrozyten-Progenitor;
MkP = Megakaryozytenprogenitor, ErP = Erythrozytenprogenitor
Aufgrund dieses hierarchischen Aufbaus des hämatopoetischen Systems können Stammzellen nach einer Transplantation das hämatopoetische System des Empfängers regenerieren (METCALF 1984). AKASHI et al. (2000) und REYA et al. (2001) beschreiben ein Modell der Hämatopoese, in dem die hämatopoetischen Stammzellen mit der Fähigkeit zur Langzeit- rekonstitiution zu hämatopoetischen Stammzellen mit der Fähigkeit zur Kurzzeit- rekonstitiution differenzieren, die sich weiter zu multipotenten Progenitorzellen entwickeln (Abb. 2). Die multipotenten Progenitorzellen machen 0,05 % der murinen Knochenmarkszellen aus (REYA et al. 2001). Anschließend erfolgt die erste Trennung der lymphoiden Differenzierungsreihe von der myeloischen Differenzierungsreihe. Aus den hämatopoetischen Stammzellen mit der Fähigkeit zur Kurzzeitrekonstitiution können gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung in B-Lymphozyten, T-Lymphozyten oder natürliche Killerzellen entstehen (AKASHI et al.
2000, REYA et al. 2001). Auch die Differenzierung in gemeinsame myeloische Vorläuferzellen ist möglich. Diese Vorläufer können weiter differenzieren in Granulozyten- Monozyten-Progenitorzellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung in Monozyten und Granulozyten oder in Megakaryozyten-Erythrozyten-Progenitoren mit der Fähigkeit zur Differenzierung in Megakaryozyten und Erythrozyten.
Stammzellen können im Mausmodell untersucht werden
Progenitorzellen können im Kolonie-Assay und im Mausmodell untersucht werden
Abbildung 3: Mögliche Untersuchungsmöglichkeiten von Stammzellen (grau) und Progenitorzellen (schwarz).
AKASHI et al. (2000) und REYA et al. (2001) beschreiben darüber hinaus den Immunphänotyp dieser verschiedenen Zellen, der eine präparative Aufreinigung ermöglicht.
Während die Progenitorzellen gut im Kolonie-Assay zu untersuchen sind, ist die Untersuchung von Stammzellen nur in vivo, beispielsweise in der Maus nach Knochenmarkstransplantation, möglich (METCALF 1984, 1989, Abb.3).
2.1.2 Die Hämatopoese der Maus
Die ersten reifen, hämatopoetischen Zellen entstehen bei 7 Tage alten Mausembryonen aus mesodermalem Gewebe im extraembryonalen Dottersack. Die dort vorhandenen hämatopotischen Zellen haben nur ein reduziertes Differenzierungspotential und es fehlt ihnen die Fähigkeit zur Langzeitrekonstitution bestrahlter Empfängertiere. Ab dem 9. Tag der Ontogenese sind hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen in der Region um die dorsale Aorta (Aorta-Gonaden-Mesonephron-Region), die sich aus dem splanchopleuralem Mesoderm entwickelt, zu finden. Später werden Leber und Knochenmark besiedelt.
Rekonstituierungsexperimente zeigten, dass Stammzellen aus der Aorta-Gonaden- Mesonephron-Region, aus der fetalen Leber und aus dem fetalen Knochenmark das hämatopoetische System bestrahlter Mäuse rekonstituieren können und somit funktionell äquivalent sind (MULLER et al. 1994, CUMANO et al. 1996, MEDVINSKY u. DZIERZAK 1996, BONIFER et al. 1998). Die Hämatopoese im adulten Tier findet im Knochenmark und in der Milz statt, pathologisch auch in der Leber und in den Lymphknoten (PATTENGALE 1994). Die Knochenmarksräume bei der Maus sind vollständig mit Knochenmarkszellen ausgefüllt; eine Hyperplasie des Knochenmarks ist daher kaum möglich (FACCINI et al.
1990). Ein zusätzlicher Bedarf an Hämatopoese führt daher zu einer Milzhyperplasie.
2.2 Ausgewählte Aspekte zur Untersuchung genetisch veränderter hämatopoetischer Zellen im Mausmodell
2.2.1 Vorteile des Mausmodells
Mausmodelle werden häufig in der humanen Leukämieforschung eingesetzt, da In-vitro- Methoden nur unzureichend das Verhalten leukämischer Zellen in vivo vorhersagen (REN 2002). In-vivo-Versuche eignen sich besonders zur Untersuchung genetisch veränderter Stammzellen. Tiermodelle helfen, die Pathophysiologie humaner Leukämien in ihren komplexen Zusammenhängen im Detail zu verstehen und überzeugen durch die Möglichkeit, den Phänotyp humaner Leukämien präzise in vivo auszubilden (VAN ETTEN 2002). Darüber hinaus können spezifische Gene verändert bzw. exprimiert werden, so dass eine gezielte Erforschung definierter Gene oder Genveränderungen im Mausmodell möglich wird (BERNADI et al. 2002). So wurde die mit der chronischen myeloischen Leukämie des Menschen häufig assoziierte Chromosomentranslokation zwischen Chromosom 9 und 22 (bcr-abl) im Mausmodell untersucht (VAN ETTEN 2002).
2.2.2 Nachteile des Mausmodells
Mausmodelle mit genetisch veränderten Stammzellen sind ein sehr variables System, abhängig von dem verwendeten Mausstamm, den retro- oder lentiviralen Konstrukten, dem Virustiter und dem Transduktionsprotokoll (REN 2002). Eine Standardisierung der verwendeten Protokolle zur Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist notwendig. Nachteilig ist in bestimmten Situationen auch die durch die notwendige Bestrahlung zur Konditionierung der Empfängermäuse für die Knochenmarkstransplantation hervorgerufene Immunsuppression (REN 2002). RYGAARD (1994) und SALEN (1994) bewerten generell die Übertragbarkeit von Versuchsergebnissen im Tiermodell auf den Menschen kritisch.
2.2.3 Aufbau retroviraler Vektoren
Retrovirale Vektoren, die auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, basieren unter anderem auf dem Moloney Murine Leukemia Virus (HALENE et al. 1999). Die in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten ecotropen Retroviren infizieren Zellen von Nagern. Da der retrovirale Präintegrationskomplex die intakte Kernmembran nicht passieren kann, infizieren Retroviren nur proliferierende Zellen (THOMAS et al. 2003). Infektiöse Retroviren bestehen aus einem diploiden Genom mit zwei einzelsträngigen Ribonukleinsäure (RNA)- Molekülen (7–10 kBasenpaare), einem Kapsid und einer Hülle (FALKE u. GERKEN 1999).
Das Genom enthält die für Virusproteine codierenden Gene gag, pol und env, wobei das Gen gag die gruppenspezifischen Antigene des Kapsids, das Gen pol die reverse Transkriptase, die Proteasen und die Integrase und das Gen env Oberflächen- und Transmembranproteine der Hülle kodiert (FALKE 1999).
Abbildung 4: Der retrovirale Replikationszyklus (modifiziert nach SCHINDLER u.
HÖHN 2002).
Bei der Fusion des Retrovirus mit der Zellmembran wird das Kapsid freigesetzt. Die reverse Transkriptase katalysiert unter Verwendung der viralen RNA als Matrize die Umschreibung in doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (DNA), das Provirus entsteht. Das Enzym Integrase katalysiert die Integration des Provirus in das Genom der Wirtszelle (ALBERTS et al. 1997, LEWIN 1998, FALKE u. GERKEN 1999). Nach Transkription und Translation der viralen Gene lagern sich die Viruskomponenten an der Plasmamembran zusammen und die Freisetzung der Viren folgt (SCHINDLER u. HÖHN 2002). Der retrovirale Replikationszyklus ist in Abbildung 4 dargestellt.
2.2.4 Retroviraler Gentransfer
Retroviren können als Vektoren für den Gentransfer verwendet werden. Dabei werden virale Gene durch das gewünschte Transgen ersetzt. Replikationsinkompetente Viren entstehen, die die Zielzelle einmal infizieren können, aber auf Grund des Fehlens viraler Gene nicht in der Lage sind, sich intrazellulär zu vermehren (THOMAS et al. 2003). Um das Risiko genetischer Rekombinationen zu senken, werden üblicherweise die benötigten retroviralen Sequenzen getrennt und die Sequenzen für Strukturproteine, Enzyme und die long terminal repeat (LTR)-Regionen auf unterschiedlichen Plasmiden kodiert. Daher umfasst das retrovirale Gentransfersystem mehrere Komponenten (ROTHENBERG u. NOLAN 1997, THOMAS et al. 2003):
• das Transgenplasmid (ein Plasmid mit dem Verpackungssignal ψ, der retroviralen 5‘- und 3’-LTR, dem zu übertragenen Gen sowie gegebenenfalls einem Selektionsmarker),
• die Verpackungszelllinie, die die retroviralen Proteine, die für die Verpackung der Vektor-RNA und somit zur Erzeugung retroviraler Partikel notwendig sind, zur Verfügung stellt (z.B. NX-eco-Zellen [sie stammen von der humanen Zelllinie 293 ab und haben das zusätzliches Gen eco, das für Oberflächen- und Transmembranproteine der Hülle kodiert]),
• weitere Plasmide, so fern sie nicht in der Verpackungszelllinie vorhanden sind, die die retroviralen Gene gag, pol und env zur Verfügung stellen.
2.2.5 Bestrahlung und Knochenmarkstransplantation bei der Maus
In verschiedenen Forschungsgruppen wurden Protokolle für die Knochenmarkstransplantation in Mäusen des Stammes C57BL/6 etabliert (Tab. 1). Dabei handelt es sich um ein syngenes Maustransplantationsmodell, das Tiere eines Inzuchtstammes verwendet. In einer Veröffentlichung, in der konkrete Angaben zur Bestrahlungskontrolle zu finden waren, wurden 300 Mäuse des Stammes C57BL/6 mit 8,25 Gray ohne anschließende Transplantation bestrahlt und 100 % der Tiere verstarben (BRECHER et al. 1988).
Tabelle 1: Übersicht über die von verschiedenen Arbeitsgruppen verwendeten Bestrahlungsdosen zur Konditionierung, die Art und die Anzahl der transplantierten Zellen bei der Knochenmarkstransplantation in Mäuse des Stammes C57BL/6.
Bestrahlungsdosis
Anzahl der transplantierten
Zellen
Art der transplantierten
Zellen Literaturangabe 8,25 Gray 1–2 x 104 Knochenmarkszellen BRECHER et al.
(1988) 6 Gray und 4,5 Gray
im Abstand von 24 Stunden
2–4 x 106 mononukleäre Zellen CHALLITA und KOHN (1993)
2 x 4 Gray im Abstand von 4 Stunden
1–1,5 x 107 mononukleäre Zellen GRANDE et al.
(1999)
10 Gray 3–5 x 106 mononukleäre Zellen HALENE et al.
(1999)
9,5 Gray 1,2–2 x 106 mononukleäre Zellen WAHLERS et al.
(2001) 10 Gray 1–3,3 x 106 mononukleäre Zellen LI et al.
(2002)
9,5 Gray 2 x 106 mononukleäre Zellen WAHLERS et al.
(2002 ) 9–10 Gray 5 x 104 lineage-negative
Zellen
LI et al.
(2003) Gray = Joule/kg
Die Einzigen, die die Effizienz des Engraftments von murinen, hämatopoetischen Stammzellen nach Transplantation untersucht haben, sind BENVENISTE et al. (2003).
Hämatopoetische Stammzellen engraften in der Maus mit einer Effizienz von 90 %. Dabei konnte kein Nachteil der transplantierten Stammzellen gegenüber den eigenen Zellen des Empfängers, die eine Bestrahlung überlebt hatten, festgestellt werden. Allerdings konnten BENVENISTE et al. (2003) zeigen, dass nur 25 % der engrafteten Zellen an der Langzeithämatopoese beteiligt sind.
ZHONG et al. (2002) untersuchten die Proliferation von Knochenmarkstransplantaten in konditionierten und nicht konditionierten Mäusen. Spenderzellen proliferierten ab dem 3. Tag gut in konditionierten Mäusen und erreichten nach 3–4 Wochen ein Plateau im Blut (> 90 % Spenderzellen im Blut am Tag 20–140). In nicht konditionierten Tieren waren bei gleicher Anzahl transplantierter Zellen kaum Spenderzellen im Blut nachweisbar (0,002 %). Bei diesen Tieren erfolgte kein Engraftment der Spenderzellen. Als mögliche Ursache kann die fehlende Schwächung des Immunsystems diskutiert werden (SHARABI et al. 1990, WAER et al. 1990). Des weiteren besteht eine Abhängigkeit der Anzahl der Spenderzellen im Blut von der Höhe der Bestrahlung und der Anzahl der transplantierten Zellen (GOEBEL et al. 2002, Tab. 2).
Tabelle 2: Anzahl der Spenderzellen im Blut von transplantierten Mäusen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis und der Anzahl der transplantierten Knochenmarkszellen (GOEBEL et al. 2002).
Bestrahlungsdosis
Anzahl transplantierter Knochenmarkszellen
Spenderzellen im Blut (stabil über 12 Monate)
11 Gray 2 x 106 > 90 %
3 Gray 2 x 107 71,9 % (±12)
1,6 Gray 2 x 107 53,6 % (±11,4)
Gray = Joule/kg
2.2.6 Einsatzmöglichkeiten des grünfluoreszierenden Proteins als Marker
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) ist ein natürlich vorkommendes, fluoreszierendes Protein der Qualle Aequorea victoria, das durch UV-Licht der Wellenlänge 395 nm angeregt wird und durch Photolumineszenz Licht der Wellenlänge 508 nm emittiert (BAGLEY et al.
1998). GFP eignet sich zur Detektion und gegebenenfalls zur Selektion transduzierter Knochenmarkszellen in vitro, zur Kontrolle der Transduktionseffizienz in vitro, zur durchflusszytofluorometrischen Sortierung, zur Selektion transduzierter Zellen im Blut über mindestens 26 Wochen, zur Analyse der Expression in multiplen Blutzellen und zu Langzeitstudien der In-vivo-Expression (BAGLEY et al. 1998). CHERRY et al. (2000) fanden eine stabile GFP-Expression in B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Granulozyten nach Knochenmarkstransplantation und serieller Knochenmarkstransplantation GFP- exprimierender Zellen bei der Maus. Nach WERTHEIM et al. (2002) beeinflusst der Marker GFP nicht die Hämatopoese.
2.3 Zytokine und Zytokinrezeptoren
2.3.1 Zytokine als Wachstumsfaktoren
Hämatologische Wachstumsfaktoren (Zytokine) sind Glykoproteine, die in niedriger Konzentration (10-10-10-12 mol/l) wirksam sind. Diese Zytokine sind Regulatoren der Hämatopoese (METCALF 1989, LÖFFLER 1998, Abb. 5). Sie vermitteln Überleben, Proliferation und Differenzierung in hämatopoetischen Zellen und/oder funktionelle Aktivität in ausgereiften Zellen und haben oft eine synergistische Wirkung (METCALF 1989, FAUSER 1997). Zytokine werden von verschiedenen Zellen gebildet, unter anderem von T-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Knochenmarks- stromazellen und auch von Leber- und Nierenzellen (GASPER et al. 2000).
Abbildung 5: Die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen wird von Zytokinen gesteuert (modifiziert nach LÖFFLER 1998).
Abkürzungen: CFU = colony forming unit, Kolonie-bildende Einheit; GEMM = Granulozyt-Erythrozyt- Makrophage-Monozyt; BFU-E = burst forming unit-Erythrozyt; E = Erythrozyt; Meg = Megakariozyt;
Eo = eosinophiler Granulozyt; Baso = basophiler Granulozyt; GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor; IL = Interleukin; IF = Interferon; TNF = Tumornekrosefaktor; EPO = Erythropoietin;
G-CSF = Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor; M-CSF = Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
2.3.2 Zytokinrezeptoren
Zytokine vermitteln ihre Wirkung über eine Bindung an membranständige Zytokinrezeptoren.
Die Familie der Zytokinrezeptoren wird auf Grund von Sequenzhomologien und enzymatischer Aktivität in drei Klassen unterteilt (BAZAN 1990, ULLRICH u.
SCHLESSINGER 1990):
Klasse 1: Zytokinrezeptoren im engeren Sinne Klasse 2: Interferonrezeptoren
Klasse 3: Rezeptoren mit intrinsischer Tyrosinkinase-Aktivität
Die Familie der Zytokinrezeptoren der Klasse 1 umfasst die Rezeptoren für den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), den Granulozyten- Kolonie-stimulierenden Faktor, das Erythropoietin (EPO), das Thrombopoietin, den Leukämie inhibierenden Faktor, das Wachstumshormon, Oncostatin M, Leptin, Prolaktin, die Interleukine (IL) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 21, 23, 27, thymic stroma-derived lymphopoietin, ciliary neurotrophic factor und cardiotrophin (VOSSHENRICH u.SANTO 2002). Zytokin-Rezeptoren können als Einzelkettenrezeptor oder als Komplex aus verschiedenen Rezeptoreinheiten vorliegen, in denen unterschiedliche Rezeptoren gemeinsame Rezeptorketten enthalten können. Die Rezeptoren für EPO, Thrombopoietin, Prolaktin, das Wachstumshormon und den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor gehören zu den Einzelkettenrezeptoren, die Rezeptoren für GM-CSF, IL3 und IL5 gehören zu den Zweikettenrezeptoren mit einer gemeinsamen -Kette. Die Rezeptoren für IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL15, ciliary neurotrophic factor, Oncostatin M, den Leukämie inhibierenden Faktor, Interferon , Interferon und Interferon γ gehören zu den Mehr-Ketten- Rezeptoren (IHLE 1995).
BAZAN et al. (1990) identifizierten ein cirka 200 Aminosäuren großes Zytokin-Rezeptor- Modul aus zwei Fibronectin-III-ähnlichen Domänen mit jeweils 7 -Faltblattstrukturen.
Klasse 1-Zytokinrezeptoren weisen zusätzlich konservierte Cysteinreste in den extrazellulären Domänen sowie ein charakteristisches W-S-X-W-S-Motiv (Tryptophan-Serin-beliebige Aminosäure-Tryptophan-Serin) im extrazellulären Teil des Rezeptors auf (BAZAN 1990, BAGLEY et al. 1997, WOODCOCK et al. 1997, WHEADON et al. 1999, D`ANDREA u.
GONDA 2000). Zytokinrezeptoren im engeren Sinne, beispielsweise der Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (hGM-CSF), haben zytoplasmatisch keine Sequenzen, die bekannte enzymatische Aktivität, z.B.
Tyrosinkinaseaktivität, vermitteln (D`ANDREA u. GONDA 2000).
2.4 Der Rezeptor für den humanen Granulozyten-
Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor und sein Ligand
2.4.1 Aufbau und Wirkung des Liganden
Der hGM-CSF ist ein 20–22 Kilodalton großes Glykoprotein, das multiple myeloische Zellen stimuliert, jedoch keinen biologischen Effekt auf pluripotente Stammzellen hat. Der hGM-CSF wird nach Stimulation von T-Lymphoyten, Monozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Mastzellen und thymischen Epithelzellen gebildet und hat Funktionen im Rahmen der Regulation der Hämatopoese sowie von Immun- und Entzündungsreaktionen (COHEN et al. 1996, FAUSER 1997). Er stimuliert das Koloniewachstum von Kolonie- bildenden Einheiten Granulozyt-Erythrozyt-Monozyt-Megakaryozyt (KBE-GEMM), Kolonie-bildenden Einheiten Granulozyt-Monozyt (KBE-GM), Kolonie-bildenden Einheiten eosinophile Granulozyt (KBE-Eo), burst forming unit-Erythrozyt (BFU-E) und Kolonie- bildenden Einheiten Megakaryozyt (KBE-Mk) (WILLIAMS 1995). Weiterhin kann der hGM- CSF die Proliferation von akuten und chronisch myeloischen Leukämiezellen sowie von malignen Plasmazellen und zusätzlich das Wachstum einiger nichthämatopoetischer Tumorzelllinien stimulieren (BALDWIN et al. 1991, RIVAS et al. 1998, TSURATA et al.
1998, VILLUNGER et al. 1998). Eine autokrine hGM-CSF-Produktion von leukämischen Zellen bei chronischen und akuten myeloischen Leukämien beschreiben McCORMACK und GONDA (1999). Der hGM-CSF vermittelt das Überleben hämatopoetischer Progenitorzellen und reifer Zellen, die Proliferation von Progenitorzellen der neutrophilen Granulozyten, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Erythrozyten und Megakaryozyten, die Differenzierung von monozytären Zellen, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten und die funktionelle Aktivierung von reifen, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen (Phagozytose, Zytotoxizität), Monozyten, eosinophilen Granulozyten, basophilen Granulozyten und Langerhans-Zellen (METCALF et al. 1989, FAUSER 1997, JANEWAY u.
TRAVERS 1997, EDER 2000)
2.4.2 Aufbau des Rezeptors
Der hGMR, der den hGM-CSF als Liganden bindet, besteht aus einer cirka 85 Kilodalton großen -Kette ( GMR) und einer cirka 120 Kilodalton großen -Kette ( GMR), die den Rezeptoren für IL3, IL5 und hGM-CSF gemeinsam ist (Abb. 6). Nach Abspaltung der Signalsequenz ist die GMR 378 Aminosäuren lang mit einer Transmembranregion aus 27 Aminosäuren von Glycin320 bis Phenylalanin346 und besitzt eine Zytokinrezeptordomäne. Die GMR besitzt nach Abspaltung der Signalsequenz eine Größe von 881 Aminosäuren mit einer Transmembranregion aus 27 Aminosäuren und zwei extrazellulären Zytokinrezeptordomänen, wobei die membrannahe Zytokinrezeptordomäne für die Interaktion mit dem hGM-CSF essentiell ist (GEARING et al. 1989, HAYASHIDA et al. 1990). CARR et al. (2001) beschrieben die Struktur der extrazellulären Region der - Kette, die zu den Klasse 1-Rezeptoren mit einem W-S-X-W-S-Motiv gehört. Die GMR liegt nach CARR et al. (2001) als stabiles Dimer vor und besteht aus vier Fibronectin III-ähnlichen Domänen mit jeweils 7 -Faltblattstrukturen (A–G). Die Domänen 1 und 3 interagieren über Disulfidbrücken. Eine Verzahnung der beiden -Ketten erfolgt zwischen den G-Strängen der
-Faltblattstrukturen in Domäne 1 der einen GMR und Domäne 3 der zweiten GMR. Bei Ligandenbindung interagiert das GMR-Dimer mit wahrscheinlich zwei GMR und wird über Disulfidbrücken stabilisiert. Die GMR ist wie die GMR ein Klasse 1-Zytokinrezeptor.
Die GMR bindet den Liganden initial mit geringer Affinität, die GMR vermag den Liganden nicht zu binden. Die Anlagerung des Liganden induziert bzw. stabilisiert (durch Liganden-Rezeptor-Interaktion und über Disulfidbrücken) die Aggregation der GMR mit der
GMR und es entsteht ein funktionell aktiver, hoch affiner Komplex aus wahrscheinlich zwei GMR, zwei GMR und zwei Molekülen hGM-CSF (TAVERNIER et al. 1991, QUELLE et al. 1994, BAGLEY et al. 1997, WOODCOCK et al. 1997).
Die Rezeptordimerisierung ist ein wichtiger Schritt bei der Rezeptoraktivierung (ULLRICH u. SCHLESSINGER 1990, HELDIN 1995, STOMSKI et al. 1995). In dem funktionell aktiven, hoch affinen Komplex bindet die GMR extrazellulär den Liganden, initiiert die Signaltransduktion und die zytoplasmatische Domäne der GMR vermittelt zytokinspezifische Differenzierungssignale (EVANS et al. 2002).
Abbildung 6: Der physiologische Rezeptor für den humanen Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor besteht aus einer -Kette (links) und einer -Kette (rechts).
Die zytoplasmatische Domäne der GMR vermittelt nach Ligandenbindung an die GMR und Aktivierung des Rezeptors die Signaltransduktion durch Aktivierung der Januskinase 2, Tyrosinphosphorylierung und Serin-Phosphorylierung und vermittelt Überlebens- und Proliferationssignale (TAVERNIER et al. 1991, QUELLE et al. 1994, BAGLEY et al. 1997, WOODCOCK et al. 1997). Eine genaue Beschreibung der Signaltransduktion des hGM-CSF veröffentlichte EDER (2000).
2.4.3 Effekte des humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktors in der Maus
Der murine Rezeptor für den murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor bindet kein hGM-CSF. Der hGM-CSF hat in der normalen Maus keinen Effekt auf die Hämatopoese (NISHIJIMA et al. 1995, 1997, EVANS et al. 2002). Daher ist die Untersuchung verschiedener Rezeptorvarianten des hGMR durch Injektionen von hGM-CSF in der transgenen Maus möglich.
GMR GMR
--- extrazelluläre Region
--- Zellmembran
--- intrazelluläre Region
NISHIJIMA et al. (1997) injizierten verschiedene Konzentrationen von hGM-CSF subkutan in für den hGMR transgene Mäuse. Bei einer Injektion von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich über 7 Tage war ein Anstieg der Leukozytenzahl im Blut transgener Mäuse auf 24,5 x 103/µl feststellbar (Kontrolle: 3,4–3,7 x 103/µl, Tab. 3). Im Differentialblutbild stieg der prozentuale Anteil der Lymphozyten an. Hämatokrit und Anzahl der Erythrozyten blieben relativ konstant.
Folgen einer Stimulation des hGMR in der transgenen Maus waren eine Leukozytose, eine Retikulozytose, eine Splenomegalie, die Infiltration von Milz und Leber mit erythroiden Progenitorzellen sowie eine Verringerung der Zellzahl im Knochenmark und Thymus (NISHIJIMA et al. 1997). Im Kolonie-Assay mit Knochenmarkszellen transgener Tiere entstanden bei Zugabe von hGM-CSF Kolonien aus Granulozyten, Makrophagen, eosinophilen Granulozyten, Mastzellen, Megakaryozyten, Blasten, erythroiden Zellen und gemischte Kolonien (NISHIJIMA et al. 1995).
Tabelle 3: Blutanalyse von normalen Mäusen und von für den hGMR transgenen Mäusen nach Injektionen mit hGM-CSF zweimal täglich über 7 Tage (NISHIJIMA et al. 1997). normale Maus transgene Maus Blutmessgröße 0 ng500 ng0 ng20 ng100 ng500 ng2500 ng Leukozytenzahl (103 /µl)3.7 ± 0.84.0 ± 0.73.4 ± 0.63.9 ± 2.65.3 ± 0.224.5 ± 8.664.5 ± 28.8 stabkernige nGZ-Zahl (%) 0.5 ± 0.51.8 ± 1.21.5 ± 0.62.0 ± 0.71.8 ± 1.01.0 ± 1.10.3 ± 0.3 segmentkernige nGZ-Zahl (%) 34.7 ± 4.136.7 ± 4.531.1 ± 4.636.5 ± 0.727.3 ± 5.813.7 ± 8.214.8 ± 3.3 Lymphozytenzahl (%) 64.0 ± 4.460.0 ± 5.665.8 ± 4.360.0 ± 2.169.0 ± 6.186.1 ± 4.782.8 ± 4.1 eosinophile Granulozytenzahl (%) 0 ± 00.8 ± 0.30.5 ± 0.40.5 ± 0.70.3 ± 0.30.8 ± 0.60.7 ± 0.3 Monozytenzahl (%) 0.8 ± 0.60.7 ± 0.31.1 ± 0.61.0 ± 01.5 ± 0.91.6 ± 0.81.3 ± 0.6 Erythrozytenzahl (105 /µl)86.0 ± 1.983.3 ± 3.586.3 ± 3.486.5 ± 2.589.2 ± 0.588.0 ± 5.682.8 ± 4.3 Hämatokrit (%) 45.6 ± 0.443.0 ± 2.345.0 ± 1.945.2 ± 1.147.5 ± 0.149.0 ± 3.147.1 ± 2.3 Hämoglobin (g/dl)14.9 ± 0.213.8 ± 0.814.4 ± 0.614.3 ± 0.514.8 ± 0.114.6 ± 0.813.6 ± 0.5 Retikulozytenzahl (% der Gesamt- erythrozyten) 2.2 ± 0.51.9 ± 0.72.5 ± 1.03.4 ± 0.84.2 ± 0.88.6 ± 2.76.3 ± 1.6 Thrombozytenzahl (103 /µl)918 ± 68.6988 ± 51.0997 ± 121.91028 ± 113.1920 ± 25.4433 ± 128.8551 ± 47.0 Abkürzungen: hGMR = Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; hGM-CSF = humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolo stimulierender Faktor; g = Gramm; dl = Deziliter; nGZ = neutrophile Granulozyten
2.5 Der chimäre Rezeptor GMR
2.5.1 Aufbau
Zur Analyse der Funktion einzelner Rezeptordomänen wurde von EDER et al. (1994) ein chimärer, niedrig-affiner Einzelkettenrezeptor hergestellt (Abb. 7, Abb. 8; Abb. 24, Anhang).
Die Generierung erfolgte durch die Einführung einer EcoRI-Restriktionsschnittstelle am Übergang der transmembranen Region von der GMR zur zytoplasmatischen Region der
GMR. Dabei wurde durch ein zusätzliches Triplett eine für die Funktion essentielle Glutaminsäure zwischen Leucin345 und Phenylalanin346 in die GMR eingefügt. Die zytoplasmatische Region der GMR, beginnend mit Tyrosin466, wurde unverändert an Phenylalanin346 der GMR angefügt.
Abbildung 7: Schematische Darstellung des chimären Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor. Die transmembrane Region der -Kette ( GMR) ist mit der zytoplasmatischen Region der
-Kette (
GMR) fusioniert. Die Zahlen kennzeichnen die von GEARING at al. (1989) und HAYASHIDA et al. (1990) angegebenen Aminosäuren. Die Sequenz der Fusionsstelle inklusive der zusätzlich eingefügten Glutaminsäure ist rechts gezeigt (EDER et al. 1994).
Abkürzungen: a = Adenin, g = Guanin, c = Cytosin, t = Thymin; Val, Leu, Gly, Phe, Glu, Tyr, Arg = Abkürzungen für Aminosäuren
a)
b)
Abbildung 8: a) Der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor besteht aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette (oberer Bereich) und dem zytoplasmatischen Teil der -Kette (unterer Bereich).
b) Zum Vergleich der physiologische Rezeptor für den hGM-CSF bestehend aus einer - Kette (links) und einer -Kette (rechts).
Der chimäre GMR ist in Abwesenheit der GMR in Abhängigkeit von hGM-CSF funktionell. Er bindet den Liganden mit geringer Affinität und vermittelt nach Ligandenbindung Überlebens- und Proliferationssignale durch Aktivierung der Januskinase 2 (EDER et al. 1994, KAFERT et al. 1999).
--- extrazelluläre Region
--- Zellmembran
--- intrazelluläre Region
--- extrazelluläre Region
--- Zellmembran
--- intrazelluläre Region
GMR
GMR
GMR
2.5.2 Funktion in vitro
EDER et al. (1994) generierten 7 verschiedene Zellpopulationen einer IL3-abhängig wachsenden, murinen Pro-B-Zelllinie (Ba/F3, PALACIOS et al. 1985) mit dem Transgen
GMR, die über 8 Wochen im Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium mit hGM-CSF als einzige Zytokinquelle kultivierbar waren. Diese Zellen proliferierten maximal bei einer Konzentration von 10 ng/ml hGM-CSF. Ba/F3-Zellen, die den chimären GMR stabil exprimieren (Ba/F3 GMR-Zellen) veränderten ihre Morphologie unter Einwirkung von hGM-CSF. Außerdem wurden 4- und 1-Integrin-Rezeptoreinheiten verstärkt exprimiert und die Akt-Kinase serinspezifisch phosphoryliert (KAFERT et al. 1999). Im Gegensatz zu dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten chimären GMR vermitteln ähnliche chimäre Rezeptoren aus der GMR und der GMR nur in Anwesenheit von der
GMR Überlebens- und Proliferationssignale (KAFERT et al. 1999, EDER 2000, EVANS et al. 2002). Aus Versuchen von MUTO at al. (1995) mit chimären Rezeptoren wurde die essentielle Bedeutung der GMR für die Signaltransduktion deutlich: Ba/F3-Zellen mit einem chimären GMR (Rezeptor aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette und dem zytoplasmatischen Teil der -Kette des hGMR) und der GMR proliferierten bei Zugabe von hGM-CSF als Zytokinquelle; Ba/F3-Zellen mit dem GMR (Rezeptor aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette und dem intrazellulären Teil der -Kette) und der GMR proliferierten unter diesen Bedingungen nicht. Deletionsstudien belegten die essentielle Rolle von der GMR bei der Signaltransduktion (ITOH et al. 1996, OKUDA et al. 1997, DOYLE u. GASSON 1998, WAGNER et al. 2001). Die zusätzliche Aminosäure Glutaminsäure in dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten chimären Rezeptor stellte sich für die von der GMR unabhängige Signaltransduktion als essentiell heraus. Ba/F3-Zellen, die den GMR ohne die zusätzliche Glutaminsäure oder den GMR mit Substitution der zusätzlichen Glutaminsäure durch Glutamin exprimieren, konnten in Anwesenheit von hGM-CSF nicht überleben, sondern nur bei Koexpression der GMR (KAFERT et al. 1999).
2.5.3 Funktion in vivo
WATANABE et al. (2000) führten In-vivo-Versuche in Koexpression mit der GMR mit einem transgenen GMR durch, dem im Unterschied zu dem in dieser Arbeit verwendeten
GMR die zusätzliche Glutaminsäure in der transmembranen Region von der GMR fehlt.
WATANABE et al. (2000) übernahmen die Dosierung von hGM-CSF (0,5 µg 2 x täglich) von NISHIJIMA et al. (1997) für ihre Versuche. Bei einer Injektion von 0,5 µg hGM-CSF 2 x täglich über 7 Tage war ein Anstieg der Leukozytenzahl im Blut von für den GMR transgenen Mäusen auf 3,5 x 103/µl feststellbar (Kontrollen: 2,47–2,83 x 103/µl, Tab. 4). Im Differentialblutbild stieg der prozentuale Anteil der Granulozyten an. Weitere Effekte des GMR in vivo waren eine Splenomegalie mit erhöhter Zellzahl in der Milz und eine Verringerung der Zellzahl im Knochenmark und im Thymus.
Tabelle 4: Blutanalyse von normalen Mäusen, von für GMR/ GMR transgenen Mäusen und von für den hGMR transgenen Mäusen nach subkutanen Injektionen mit hGM-CSF zweimal täglich über 7 Tage (WATANABE et al. 2000).
normal
GMR /
GMR hGMR
Blutmessgröße 500 ng 0 ng 500 ng 0 ng 500 ng Leukozytenzahl (103/µl) 2.47 ± 6.7 2.83 ± 3.8 3.5 ± 6.0 2.8 ± 1.7 3.87 ± 6.8 Granulozytenzahl (%) 41.6 ± 6.1 37.1 ± 1.5 46.2 ± 2.6 38.4 ± 3.3 46.2 ± 2.6 Monozytenzahl (%) 2.0 ± 0.7 1.2 ± 1.07 2.0 ± 0.6 1.3 ± 1.1 1.1 ± 1.0 Lymphozytenzahl (%) 56.4 ± 6.5 61.7 ± 0.8 51.8 ± 2.9 59.0 ± 0.8 60.6 ± 2.4 Erythrozytenzahl ( 105/µl) 83.2 ± 1.6 77.2 ± 7.2 84.6 ± 3.9 89.7 ± 9.2 84.7 ± 4.8 Hämatokrit (%) 40.7 ± 0.2 42.9 ± 5.3 45.2 ± 4.5 40.7 ± 1.8 41.8 ± 2.3 Hämoglobin (g/dl) 14.7 ± 0.7 12.6 ± 2.9 15.8 ± 0.5 15.3 ± 0.6 15.4 ± 0.6 Thrombozytenzahl (103/µl) 994± 38.5 1130 ± 29.9 1228 ± 82.0 999 ± 100.0 1115 ± 67.0
Abkürzungen: GMR = der chimäre Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktor aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der -Kette und dem zytoplasmatischenTeil der -Kette; GMR = die -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; hGMR = Rezeptor für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor
2.6 Konstitutiv aktive Mutationen der GMR
2.6.1 Aufbau
GONDA et al. (1997) beschrieben konstitutiv aktive Zytokinrezeptormutationen. JENKINS et al. (1995) identifizierten durch Zufallsmutagenese mithilfe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anschließender retroviraler Expression der generierten DNA in einer myeloischen Zelllinie (FDC-P1-Zellen) zwei konstitutiv aktive Punktmutationen der GMR: V449E in der Transmembranregion und I374N im membrannahen, extrazellulären Abschnitt (Abb. 9;
Abb. 25, Anhang).
Bei der GMR V449E ist in der Transmembranregion Valin449 durch Glutaminsäure substituiert. Diese Punktmutation bewirkt eine konstitutive Rezeptoraktivierung in allen myeloischen und erythroiden Zellen ohne Ligandenbindung und ohne Interaktion mit der GMR; eine Interaktion mit der normalen GMR wird diskutiert (JENKINS et al. 1995, McCORMACK u. GONDA 1997, 1999). Bei der GMR I374N wurde in der Extrazellulärregion Isoleucin374 durch Asparagin substituiert. Dadurch entsteht ebenfalls ein konstitutiv aktiver Rezeptor unabhängig von einer Ligandenbindung; hier ist die Interaktion mit der GMR aber Voraussetzung für die Signaltransduktion. Die GMR I374N bewirkt Wachstum von Progenitorzellen der neutrophilen Granulozyten und Monozyten, die die murine -Kette des Rezeptors für den murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktor exprimieren, ohne Zugabe von Zytokinen (JENKINS et al. 1995, 1999, McCORMACK u. GONDA 1997, 1999). In humanen Zellen wird eine Interaktion mit der humanen GMR diskutiert (JENKINS et al. 1999).
2.6.2 Funktion in vitro und in vivo
McCORMACK und GONDA (1997, 2000) untersuchten die Funktion der konstitutiv aktiven
GMR V449E und I374N in einer myeloischen Zelllinie (FDC-P1-Zellen), in IL3-abhängig wachsenden Ba/F3-Zellen und in einer Zelllinie, die bei Zugabe von mIL 3 proliferiert und bei Zugabe von muriner Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor differenziert (FDB-Zellen) (Tab. 5). Sie fanden unterschiedliche Funktionen der beiden Rezeptoren. Diese Daten legen unterschiedliche Aktivierungsmechanismen der beschriebenen
Varianten der GMR durch Interaktion mit Zelllinienspezifischen Signalmolekülen nahe (D`ANDREA u. GONDA 2000, McCORMACK u. GONDA 2000).
a)
b)
Abbildung 9: a) Zwei konstitutiv aktive Punktmutationen der -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor GMR V449E (links) und GMR I374N mit der -Kette (rechts).
b) zum Vergleich der physiologische Rezeptor für den humanen Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor bestehend aus einer -Kette (links) und einer
-Kette (rechts).
Abkürzungen: GMR = die -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktor; GMR = die -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor
--- extrazelluläre Region
--- Zellmembran
--- intrazelluläre Region
GMR
GMR V449E
GMR
I374N Punktmutation
GMR
--- extrazelluläre Region
--- Zellmembran
--- intrazelluläre Region
GMR
Tabelle 5: Funktion der konstitutiv aktiven Varianten V449E und I374N der -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor in verschiedenen Zelllinien mit Angabe der Interaktion mit der -Kette und dem In-vivo-Effekt (EDER 2000).
GMR I374N GMR V449E Funktion in einer myeloischen
Zelllinie (FDC-P1)
konstitutiv aktiv konstitutiv aktiv Funktion in der murinen Pro-
B-Zelllinie Ba/F3
nicht aktiv konstitutiv aktiv Funktion in einer Zelllinie, die
bei Zugabe von murinem Interleukin 3 proliferiert und bei Zugabe von mGM-CSF differenziert (FDB-Zellen)
Differenzierung Proliferation
Interaktion mit der GMR notwendig nicht notwendig
Effekt in vivo MPS AML
Abkürzungen: GMR = die -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierenden Faktor; GMR = die -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor; I374N und V449E = Punktmutationen in der -Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor; mGM-CSF = muriner Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; MPS = myeloproliferatives Syndrom; AML = akute myeloische Leukämie
Das Wachstum transduzierter Knochenmarkszellen ohne Zugabe von Zytokinen wurde von McCORMACK und GONDA (1999) in Kolonie-Assays untersucht. Die GMR V449E und
GMR I374N exprimierende Knochenmarkszellen bildeten wider Erwarten ohne Zugabe von Zytokinen keine Kolonien. Transduzierte, die GMR V449E exprimierende, hämatopoetische Zellen aus der fetalen Leber bildeten eine immortalisierte Zellkultur mit erhöhtem Anteil an frühen myeloischen Zellen durch erhöhte Proliferation oder durch mangelnde Differenzierung. Diese immortalisierten Zellen bildeten nach subkutaner Injektion in Mäuse zu maximal 25 % Tumoren. Daher wird eine zusätzliche Mutation zur Tumorgenese angenommen (McCORMACK u. GONDA 1997).
