Vergleich der Nachweisstärke von BINAX®E.I.A. und CL-SMIA mittels Testung von

In weiteren Experimenten sollte untersucht werden, inwieweit die Sensitivitäten der beiden L. pneumophila Nachweismethoden für Urin, BINAX®E.I.A. und CL-SMIA am MCR 3, miteinander vergleichbar sind. Es wurde untersucht, bis zu welcher LPS-Konzentration die Standards verdünnt werden konnten, sodass die beiden angewandten Untersuchungsmethoden immer noch ein positives Ergebnis lieferten. Dafür wurden die LPS-Standards in verschiedenen Stufen verdünnt und anschließend mit BINAX®E.I.A. und CL-SMIA am MCR 3 vermessen. Auf dem Legionellen-Chip wurden die monoklonalen Antikörper mAb 10/6, mAb 8/4 und mAb 3 sowie der polyklonale Fänger-Antikörper pAb immobilisiert. Aufgrund der geringen Menge an künstlichem LPS konnte pro Verdünnungsstufe nur eine Einfachbestimmung durchgeführt werden. Die BINAX®E.I.A. ratio ist die Nachweisgrenze, welcher durch den Hersteller des Tests vorgegeben ist. Die Korrelation zwischen CL-Signal der Fänger-Antikörper sowie BINAX®E.I.A.

ratio ist für jeden monoklonalen Antikörper separat in einer Abbildung gegenübergestellt. Die BINAX®E.I.A.-Nachweisgrenze wird in der Anleitung der Testpackung bei 3 definiert. Die Nachweisgrenzen der drei monoklonalen Fänger-Antikörper wurden aus den vorherigen Untersuchungen der Blank-Urine übernommen (Blank-Urine gemittelt plus dreifache Standardabweichung derselben). Sie wurden bei 494 a.u. für mAb 10/6, 477 a.u. für mAb 8/4, 526 a.u. für mAb 3 und 655 a.u. für pAb bestimmt.

Zuerst wurden die Nachweis-Sensitivitäten von monoklonalem Fänger-Antikörper mAb 10/6 mit pAb und BINAX®E.I.A. verglichen. Dafür wurde der künstliche LPS-Standard in Urin von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham in verschiedenen Stufen verdünnt und mit beiden Methoden vermessen. Die Nachweisgrenzen von mAb 10/6 und pAb sind zu 494 bzw. 655 a.u.

bestimmt worden. Um die drei Experimente miteinander vergleichen zu können, wurde die Nachweisgrenze der entsprechenden Endotoxin-Konzentration des L. pneumophila-Stammes betrachtet. Die erhaltenen Nachweisgrenzen an detektierbarer LPS-Konzentration sind in nachfolgenden Abbildungen für mAb 10/6, pAb und BINAX®E.I.A. aufgeführt (siehe 58 A, B und C).

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

Abbildung 58 A, B und C: Vergleich der Nachweisstärke von mAb 10/6, pAb und BINAX®E.I.A. für den künstlich generierten LPS-Standard von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham.

Mittels BINAX®E.I.A.-Nachweis war eine Detektion von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham-LPS bis zu einer Konzentration von 8,8 EU/mL möglich. Bei Anwendung des CL-SMIA am MCR 3 wurde eine Nachweisgrenze für den monoklonalen Antikörper mAb 10/6 von 7,9 EU/mL und für den polyklonalen Fänger-Antikörper von 2,4 EU/mL bestimmt. Es wurde also bestätigt, dass sich beide Fänger-Antikörper sowie der BINAX®E.I.A. für den Nachweis von LPS direkt im Urin eignen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass der etablierte CL-SMIA am MCR 3 für L. pneumophila viel nachweisstärker ist. Vergleichend hierzu lag die Nachweisgrenze von pAb für L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, in ultrareinem Wasser, bei 6,1 × 10³ KBE/mL. Die Nachweisgrenze für L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, detektiert mit mAb 10/6 wurde bei 2,8 × 10³ KBE/mL bestimmt. Der LAL-Test für die Korrelation zwischen EU/mL und KBE/mL wurde nur einmalig durchgeführt. Daher lässt sich anhand der Größenordnung der Bakterienkonzentration trotzdem die Aussage treffen, dass eine Detektion des künstlich generierten LPS mit einer höheren Nachweisstärke möglich zu sein scheint. Um diese Aussage zu untermauern müssen mehr vergleichende Untersuchungen zwischen LAL und CL-SMIA durchgeführt werden.

Um zu überprüfen, ob die Nachweisstärke des CL-SMIA auch für andere monoklonale Fänger-Antikörper höher lag, als vergleichsweise für den BINAX®E.I.A., werden die gleichen Untersuchungen für die monoklonalen Fänger-Antikörper mAb 8/4 und mAb 3 durchgeführt. Es sollte untersucht werden, ob der BINAX®E.I.A. für jeden L. pneumophila-Organismus andere Nachweisstärken aufweist.

Für den monoklonalen Fänger-Antikörper mAb 8/4 wurden Verdünnungen des künstlichen LPS-Standards von L.pneumophila SG 1, ST OLDA mit BINAX®E.I.A. und CL-SMIA (mAb 8/4 und pAb) untersucht. Die ermittelten Ergebnisse für mAb 8/4, pAb und BINAX®E.I.A. für OLDA sind in nachfolgenden Abbildungen 59 A, B und C aufgeführt:

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

Abbildung 59 A, B und C: Vergleich der Nachweisstärke von mAb 8/4, pAb und BINAX®E.I.A. für den künstlich generierten LPS-Standard von L. pneumophila SG 1, ST OLDA.

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

Mittels CL-SMIA-Nachweis am MCR 3 durch mAb 8/4 ist eine Detektion von L. pneumophila SG 1, ST OLDA-LPS bis zu einer Konzentration von 593,9 EU/mL möglich. Der BINAX®E.I.A.- Schnelltest weist eine Nachweisgrenze von 36 EU/mL auf. Eine noch Nachweisstärke wurde mit dem polyklonalen Fänger-Antikörper pAb im CL-SMIA erreicht. Hierbei wurde eine Nachweisgrenze von 24,19 EU/mL bestimmt. Auch für diesen LPS-Standard konnte im Urin gezeigt werden, dass sich sowohl der monoklonale Fänger-Antikörper mAb 8/4, der polyklonale Fänger-Antikörper als auch BINAX®E.I.A. für den Nachweis von LPS direkt im Urin eignen. Es zeigte sich, dass der polyklonale Fänger-Antikörper für OLDA-LPS ähnliche Sensitivitäten wie der Antikörper im BINAX®E.I.A. aufweist. Die höchste Nachweisgrenze konnte mit dem monoklonalen Fänger-Antikörper mAb 8/4 ermittelt werden. Vergleichend hierzu kann man Rückschlüsse ziehen auf die Nachweisgrenze des monoklonalen Antikörpers mAb 8/4 in ultrareinem Wasser, für den hitzeinaktivierte L. pneumophila SG 1, ST OLDA, untersucht wurden. Dafür wurde eine Nachweisgrenze von 4,5 × 10⁴ KBE/mL bestimmt. Inwiefern diese mit den gemessenen 593,9 EU/mL korrelieren, müsste in weiteren Studien untersucht werden. Die Bestimmung von Bakterienkonzentration im Vergleich zu Endotoxin-Einheiten (EU/mL) wurde bisher nur einmal durchgeführt.

In einer letzten Untersuchung wurde ermittelt, ob die Nachweisstärke des CL-SMIAs für den monoklonalen Fänger-Antikörper mAb 3 im Vergleich zu BINAX®E.I.A. höher ist. Hierfür werden Verdünnungen des künstlichen LPS-Standards von L. pneumophila SG 1, ST Heysham, mit BINAX®E.I.A. und CL-SMIA (mAb 3 und pAb) untersucht. In nachfolgenden Abbildungen 60 A, B und C sind die Nachweisgrenzen für die Konzentration an Heysham-LPS für die Detektion mit mAb 3, pAb und BINAX®E.I.A. aufgeführt.

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

Abbildung 60: Vergleich der Sensitivität von mAb 3, pAb und BINAX®E.I.A. für den künstlich generierten LPS-Standard von L. pneumophila SG 1, ST Heysham.

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION LPS-Strukturen nachweisstärker detektiert als der BINAX®E.I.A. Bei den Untersuchungen von hitzeinaktivierten L. pneumophila SG 1, ST Heysham, detektiert mit mAb 3, wurde eine Nachweisgrenze von 6,7 × 10² KBE/mL bestimmt. Die Korrelation zwischen der bestimmten Bakterien- und Endotoxin-Konzentration muss in weiteren Experimenten untersucht werden, weil im Rahmen dieser Studie der LAL-Nachweis nur einmal durchgeführt wurde. Somit kann nur die Aussage getroffen werden, dass 63,7 EU/mL der Nachweisgrenze 6,7 × 10² KBE/mL gegenüberstehen.

Wenn man alle drei durchgeführten Vergleichsexperimente betrachtet, schneidet die Detektion von LPS mittels CL-SMIA auf dem MCR 3 immer am besten ab. Der kommerziell erhältlich polyklonale Fänger-Antikörper pAb bietet konstant die höchste Nachweisstärke. Die verwendeten monoklonalen Fänger-Antikörper können mit dem Schnellnachweisverfahren BINAX®E.I.A. aber mithalten. Aus diesem Grund macht es Sinn, neben dem polyklonalen Fänger-Antikörper auch die einzelnen monoklonalen Fänger-Antikörper auf den Mikroarray-Chip mit zu immobilisieren.

Zusammenfassend lässt sich auf jeden Fall eindeutig erkennen, dass eine Detektion von künstlichem LPS sowohl mittels BINAX®E.I.A. als auch mittels CL-SMIA am MCR 3 möglich ist.

Weiterhin kann man schlussfolgern, dass der Vergleich der LPS-Standards über den LAL Endotoxin-Test zu bewerten sehr sinnvoll ist. Denn damit können verschiedene Testsysteme miteinander verglichen werden. Solch ein Vergleich ist mit hitzeinaktivierten Zellen nämlich nicht möglich.