3. Ergebnisse und Diskussion
3.3. Charakterisierung der einzelnen Antikörper
3.3.1. Polyklonaler Antikörper
3.3.1.1. Kalibrierung von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, mit polyklonalem Fänger-
Zur Verifizierung des Sandwich- Mikroarray-Immunoassay für L. pneumophila mit polyklonalem, unmarkierten Fänger-Antikörper und biotinyliertem, polyklonalen Detektionsantikörper wurde eine Kalibrierung von L. pneumophila SG 1, St Bellingham in ultrareinem Wasser aufgenommen.
Die hergestellte Stammlösung wurde zuerst mittels Durchflusszytometrie quantifiziert und danach hitzeinaktiviert. Die so ermittelten Konzentrationen der anschließend am MCR 3 gemessenen Kalibrierlösungen waren 0 KBE/mL, 1,6 × 10² KBE/mL, 1,6 × 10³ KBE/mL, 1,6 × 104 KBE/mL, 1,6 × 105 KBE/mL, 1,6 × 106 KBE/mL, 1,6 × 107 KBE/mL und 1,6 × 108 KBE/mL. Durch semilogarithmische Auftragung der Chemilumineszenz-Signale gegen die Legionellenkonzentration wurde eine sigmoidale Kalibrierfunktion erhalten (siehe Abbildung 38).
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Abbildung 38: Detektion von verschiedenen Konzentrationen von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham (hitzeinaktiviert in ultrareinem Wasser) mit polyklonalem Fänger-Antikörper (pAb); Kalibrierkurve mit sigmoidaler Fitfunktion.
Die Nachweisgrenze (NWG) definiert sich aus CL-Signal der Nullprobe (Blank) plus 3-facher Standardabweichung, die Bestimmungsgrenze (BSTG) hingegen wurde mit Nullprobe und 10-facher Standardabweichung bestimmt. Als Nachweisgrenze für den polyklonalen Fänger-Antikörper wurde eine L. pneumophila SG 1, ST Bellingham-Konzentration von 6,1 × 10³ KBE/mL, ermittelt. Die Bestimmungsgrenze lag bei einer Konzentration von 2,9 × 104 KBE/mL.
Die Steigung des linearen Bereichs der Kalibrierkurve belief sich auf 0,44. Der Testmittelpunkt betrug 6,8 × 106 KBE/mL.
Andere ELISA-Testformate, bei denen die Detektion mit einem polyklonalen Antikörper durchgeführt wird, können Nachweisgrenzen von 103 bis 104 KBE/mL liefern. Es ist ersichtlich, dass der etablierte CL-SMIA in dieser Konstellation im gleichen Konzentrationsbereich der Nachweisgrenze liegt. Er ist also generell geeignet, um eine Quantifizierung von L. pneumophila SG 1 durchzuführen. Jedoch ist lediglich eine Ja/Nein-Antwort in Bezug auf das Vorkommen von L. pneumophila SG 1 möglich. Im Rahmen eines Schnell-Nachweisverfahrens ist dieses Assay-Format jedoch einer Kultivierung auf Selektiv-Nährmedium vorzuziehen, allein wegen der
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Zeitersparnis von mehreren Tagen im Vergleich zu einer Detektion mit Kultur. Aufgrund des eingeschränkten Arbeitsbereiches innerhalb von einer Logstufe sollte zusätzlich zur Detektion mit Sandwich-Mikroarray-Immunoassay immer eine weitere Vergleichsmethode zur Quantifizierung benutzt werden.
3.3.1.2. Kalibrierung von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, mit polyklonalem Fänger-Antikörper in Oberflächenwasser
Um zu überprüfen, ob die Antikörper-Kombination aus unmarkiertem polyklonalen Fänger-Antikörper und biotinyliertem, polyklonalen Detektionsantikörper auch auf andere Wasser-Matrices übertragbar ist, wurde die gleiche Kalibrierung in Oberflächenwasser (Flusswasser aus der Würm) durchgeführt. Es ist davon auszugehen, dass bei der Blindprobe ein höheres CL-Signal erwartet werden kann, weil L. pneumophila-LPS scheinbar natürlicherweise im Oberflächenwasser vorkommen.
Für die Kalibrierung wurde eine Stammlösung von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, erstellt, am Durchflusszytometer quantifiziert und anschließend hitzeinaktiviert. Die hergestellte Kalibrierlösung wurde am Durchflusszytometer quantifiziert. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen der Kalibrierlösung hergestellt. Die so eingestellten Konzentrationen waren 0 KBE/mL, 10 KBE/mL, 1,0 × 102 KBE/mL, 1,0 × 103 KBE/mL, 1,0 × 104 KBE/mL, 1,0 × 105 KBE/mL, 1,0 × 106 KBE/mL, 1,0 × 107 KBE/mL und 1,0 × 108 KBE/mL. Die am Messtag vor der Versuchsreihe gesammelten Würm-Oberflächenwasserproben wurden mit den Kalibrierlösungen aufgestockt. Die somit erhaltenen Oberflächenwasserproben mit verschiedenen Konzentrationen an L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, wurden für die Messungen am MCR 3 eingesetzt. Durch semilogarithmische Auftragung der Chemilumineszenz-Signale gegen die Legionellenkonzentration wurde eine sigmoidale Kalibrierfunktion erhalten (siehe Abbildung 39).
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Abbildung 39: Detektion mit polyklonalem Fänger-Antikörper (pAb) von verschiedenen Konzentrationen von L. pneumophila SG 1, ST Bellingham (hitzeinaktiviert), zugegeben in Oberflächenwasser (Fluss Würm); Kalibrierkurve mit sigmoidaler Fitfunktion.
Für die Kalibrierung des polyklonalen Fänger-Antikörpers in Oberflächenwasser wurde die Nachweisgrenze bei einer L. pneumophila SG 1, ST Bellingham-Konzentration von 2,6 × 10³ KBE/mL ermittelt. Die Bestimmungsgrenze wurde bei einer Konzentration von 1,2 × 104 KBE/mL gefunden. Der ermittelte Testmittelpunkt der Kalibrierkurve lag bei 4,7 × 106 KBE/mL und die Steigung des linearen Bereichs der Kalibrierung betrug 0,27.
Um beide Kalibrierkurven zu vergleichen und damit zu beurteilen, ob der polyklonale Fänger-Antikörper in Oberflächenwasser die gleiche Performance bietet wie in ultrareinem Wasser, wurden beide Kalibrierkurven in einer Tabelle gegenübergestellt (siehe Tabelle 9).
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Tabelle 9: Gegenüberstellung von NWG, BSTG, Testmittelpunkt und Steigung der beiden Kalibrierkurven des polyklonalen Fänger-Antikörpers aufgenommen in Reinstwasser und Oberflächenwasser.
Wenn man beide Kalibrierkurven miteinander vergleicht, wird deutlich, dass der Testmittelpunkt der Kalibrierkurve in Oberflächenwasser sich um den Faktor 1,4 nach links geschoben hat. Die Nachweisgrenze des polyklonalen Fänger-Antikörpers in ultrareinem Wasser lag bei 6,1 × 10³ KBE/mL, wohingegen im Oberflächenwasser eine Nachweisgrenze von 2,6 × 10³ KBE/mL erreicht werden konnte.
Die verminderte Signalintensität für den polyklonalen Fänger-Antikörper in ultrareinem Wasser hat mehrere mögliche Ursachen: Zum ersten wurden die Experimente mit dem polyklonalen Antikörper pAb in ultrareinem Wasser zu einem früheren Zeitpunkt als die Experimente mit pAb in Oberflächenwasser durchgeführt. Es kann also sein, dass sich die Lagerungsbedingungen des Antikörpers zum Messzeitpunkt unterschieden haben. Weiterhin wurde für die Messungen zwar wieder ein Stamm L. pneumophila SG 1, ST Bellingham, verwendet, jedoch wurde für die Kalibrierkurve in Oberflächenwasser eine andere Stammlösung verwendet. Dies war nötig, um Alterungserscheinungen bei den verwendeten Stammlösungen auszuschließen. Es ist auch denkbar, dass bei einer Kultivierung von lebenden Zellen mal mehr und mal weniger LPS an der Zellmembran generiert wird (je nach optimalen Wachstumsbedingungen). Die Anzahl der gebildeten LPS-Strukturen an der Membranoberfläche entscheidet über die Signalintensität bei den Messungen, da der Antikörper die LPS-Strukturen an der Bakterienmembran detektiert. Die Methode funktioniert in Oberflächenwasser nicht schlechter als in ultrareinem Wasser.
Eine quantitative Aussage kann nur mit hochselektiven monoklonalen Antikörpern erfolgen, weil über den verwendeten polyklonalen Fänger-Antikörper immer der Summenparameter an L. pneumophila SG 1 – 12 detektiert wird.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Das Verwenden eines polyklonalen Antikörpers bringt Risiken mit sich. Bei dem hier verwendeten polyklonalen Detektions-Antikörper ist lediglich eine Ja/Nein-Aussage über das Vorkommen von L. pneumophila SG 1 – 12 möglich. Es ist keine Differenzierung in Subgruppen möglich. Die notwendige Konzentration für ein CL-Signal mit dem verwendeten Fänger-Antikörper wurde durch die Bestimmung der Nachweisgrenze mit der Kalibrierung definiert.
Somit ist eine quantitative Aussage auch mit einer Screening-Methode möglich, wenn die vorab definierten Schwellenwerte überschritten werden. Weiterhin weist der polyklonale Fänger-Antikörper Kreuzreaktivitäten mit anderen Serogruppen auf. Er ist kommerziell für die Detektion von L. pneumophila SG 1 – 12 erhältlich. Das heißt jedoch, dass bei einer unbekannten Umweltprobe keine Aussage über L. pneumophila SG 1 getroffen werden kann.
Der Screening-Charakter dieser Methode bleibt davon jedoch unberührt. Eine Subtypisierung ist nur durch die Verwendung von monoklonalen Fänger-Antikörpern möglich, die selektiv bestimmte L. pneumophila SG 1-Subgruppen detektieren.
Der verwendete polyklonale Fänger-Antikörper wurde bisher nur für Patientenurin eingesetzt.
Mit der Kalibrierkurve in Oberflächenwasser konnte nachgewiesen werden, dass mit dem etablierten CL-SMIA unter Verwendung des polyklonalen Fänger-Antikörpers auch Umweltproben vermessen werden können. Als nächster Schritt wird daher untersucht, ob neben hitzeinaktivierten L. pneumophila auch lebende Mikroorganismen in Oberflächenwasser detektiert werden können.