Aufkonzentrierungsmethoden für Bakterien im Trinkwasser

Oftmals reicht bereits ein Keim oder der Bruchteil eines Mikroorganismus im Trinkwasser aus, um bei einem Menschen eine Infektion auszulösen [WHO, 2011]. Da es die Nachweisgrenze von Standard-Analysemethoden oft nicht ermöglicht, diesen einen Keim zu detektieren, müssen größere Probenvolumina aufkonzentriert werden, um eine Detektion zu bewerkstelligen. Dabei macht man sich oftmals die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Mikroorganismen zunutze, um diese aus großem Volumen zu separieren. Um sicherzustellen, dass die

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Detektionsmethode alle beinhalteten Mikroorganismen erfasst, ist es wichtig, ein großes Probenvolumen aufzukonzentrieren. Der damit erreichte Aufkonzentrierungsfaktor sollte also möglichst groß sein. Eine zügige Verarbeitung der Proben ist besonders wichtig, damit es zu keiner Vermehrung der Mikroorganismen im untersuchten Wasser kommt. Dafür förderlich sind nährstoffreiches Wasser und erhöhte Temperaturen, wobei hier auch Zimmertemperatur ausreichend ist. Weiterhin wäre es sinnvoll, wenn das Probenwasser ohne Vorbereitung direkt zur Untersuchung eingesetzt werden könnte.

Um Aufkonzentrierungsfaktoren jenseits der 10⁴ zu erreichen, werden sehr oft verschiedene Verfahren miteinander kombiniert. Eine Möglichkeit für den ersten Prozessschritt ist beispielsweise die Ultrafiltration [Cashdollar et al., 2013]. Nachfolgend kann dann zum Beispiel die Oberflächenladung von Pathogenen ausgenutzt werden, um eine weitere Aufkonzentrierung zu erreichen. Eine Aufkonzentrierung über Größenausschluss ist ebenso eine Möglichkeit.

2.5.1. Monolithische Adsorptions-Filtration

Als Adsorption bezeichnet man den physikalischen Prozess der Anreicherung von Stoffen aus Flüssigkeiten an der Oberfläche eines Festkörpers, der sogenannten Phasen-Grenzfläche. Bei der Adsorptions-Filtration macht man sich genau diese Adsorptionskräfte zunutze, um eine Aufkonzentrierung der im Wasser enthaltenen Mikroorganismen zu erreichen. Die Monolithische Adsorptions-Filtration nutzt als Festkörper einen Monolithen. Darunter versteht man chromatographische Trennphasen aus einem durchgehenden Material. Der Name

„Monolith“ stammt aus dem Griechischen und bedeutet „einheitlicher Stein“. In der zweiten Hälfte der 1980er Jahre wurden Monolithe das erste Mal als Separationsphasen eingeführt und galten sehr schnell als vielversprechende Alternative zu den bisher standardmäßig verwendeten partikulären Säulen [Xie et al., 2002; Jungbauer et al., 2004]. Die Aufkonzentrierung geschieht hierbei hauptsächlich durch ionische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Oberfläche des Monolithen [Peskoller et. al, 2009; Pei et al., 2012]. Ein weiterer Vorteil der eingesetzten Monolithen ist auch, dass die Limitierungen überwunden werden, die oft bei gepackten Säulen auftreten. In konventionellen Chromatographie-Säulen werden die zu separierenden Moleküle aufgrund von Diffusion sehr langsam transportiert. Dafür ist ein langer Kontakt zwischen

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Molekül und aktivierter Oberfläche notwendig. Bei der Separation mit einem Monolithen wird die Flüssigkeit durch die Kanäle gepresst, sodass die zu trennenden Moleküle durch Konvektion an die aktive Oberfläche der Kanäle transportiert werden. Somit ist eine schnelle und effektive Trennung der Moleküle auf Basis von hohen Flussraten und niedrigem Rückdruck möglich [Podgornik et al., 2000]. Je nach gewähltem Mikroorganismus, der untersuchten Matrix und den herrschenden Arbeitsbedingungen können unterschiedliche funktionelle Gruppen an die Oberfläche des Monolithen gebunden werden.

2.5.2. Zentrifugale Ultrafiltration

Von einer zentrifugalen Ultrafiltration spricht man, wenn man sich die Zentrifugalkraft wie z.B.

in einer Laborzentrifuge für die Aufkonzentrierung zunutze macht. Dabei wird eine Suspension aus Flüssigkeit und Feststoffen durch eine durchlässige Membran geleitet, wo je nach Größe der Poren die Feststoffe zurückgehalten werden. Die Probe trennt sich in Filtrat und Retentat. Die Unterscheidung erfolgt hierbei nach Porengröße, wobei die Ultrafiltration eine Porengröße von 2 – 100 nm in der Membran aufweist. Somit können Moleküle zu einer Molekülmasse von mit bis 5.000 kDa von der Flüssigkeit abgetrennt werden.

2.5.3. Kombination aus Monolithischer Adsorptionsfiltration und Zentrifugaler Ultrafiltration zur Aufkonzentrierung von L. pneumophila-haltigen Realproben Um L. pneumophila auch in Realproben nachzuweisen und zu zeigen, dass der entwickelte Sandwich-Mikroarray-Immunoassay auch für Oberflächenwasser und Abwasser funktioniert, wurde in Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen-Mitgliedern an einem kombinierten Verfahren aus Monolithischer Adsorptions-Filtration (MAF) und Zentrifugaler Ultrafiltration (ZeUF) gearbeitet. Da sowohl Oberflächen-, als auch Abwasser eine sehr komplexe Zusammensetzung aufweist, ist es für eine anschließende Detektion durchaus sinnvoll, die enthaltenen Bakterien aufzukonzentrieren und Matrixeffekte so weit wie möglich zu minimieren. Nach Durchführung von MAF und ZeUF wurde der entwickelte CL-SMIA am MCR 3 als Detektionsmethode nachgeschaltet. Oberstes Ziel sollte sein, Legionellen in Realproben aufzukonzentrieren, Matrixeffekte durch Begleitflora zu reduzieren, schwebende Partikel und

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Wasserverunreinigungen u. ä. zu minimieren und eine anschließende Antikörper-basierte Detektion durchzuführen. Es wurde weiterhin darauf hingearbeitet, den von der aktuell geltenden Trinkwasserverordnung (TrinkwV) vorgeschriebenen Maßnahmenwert von 1 KBE/mL als Nachweisgrenze für die Kombimethode zu erreichen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Epoxy-basierte Polymer-Monolithe hergestellt und zur Aufkonzentrierung von L. pneumophila verwendet. Sie bestehen aus einer festen Phase, die von einem Netzwerk aus Poren und Durchflusskanälen mit einem Durchmesser von ca. 20 µm durchzogen ist (siehe Abbildung 29).

Abbildung 29: REM-Aufnahme der makroporösen Struktur des Monolithen; gewählte Vergrößerung: 1.000x [gemäß Peskoller et al., 2009].

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Epoxy-Gruppen an der Oberfläche hydrolysiert. Die dabei entstehenden Hydroxylgruppen wirken als ein schwacher Kationenaustauscher, die bei dem eingesetzten pH-Wert von 3 eine negative Oberflächenladung aufweisen. Aufgrund von elektrostatischen Interaktionen auf der Oberfläche können Mikroorganismen an die Oberfläche des Monolithen binden, weil sie aufgrund der leicht positiven Ladung der LPS-Strukturen an ihrer Zellmembran eine spezifische Oberflächenladung aufweisen. L. pneumophila kann an der Oberfläche eine polare Flagelle ausbilden [Cianciotto et al., 2001; Rodgers et al., 1979]. Diese polare Ladung hängt vom pH-Wert der Umgebungsmatrix ab. Bei der Probenvorbereitung vor der Monolithischen Adsorptions-Filtration (MAF) wurde dieser sauer auf pH 3 eingestellt.

Als zweiter Aufkonzentrierungsschritt wurde die erhaltene Probenlösung mit einer Zentrifugalen Ultrafiltration (ZeUF) weiter aufkonzentriert [Kunze et al., 2015]. Anschließend konnte die Messung mit dem etablierten CL-SMIA am MCR 3 erfolgen.