Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie (engl.: flow cytometry, FCM) ist ein optisches Messverfahren, das sowohl in Biologie und Chemie, als auch in der Medizin Anwendung findet. Es werden hierbei mit Fluoreszenzfarbstoff angefärbte Partikel oder Probenzellen analysiert, die einzeln, in einem laminaren Hüllstrom eingeschlossen, mit sehr hoher Geschwindigkeit an einem Lichtstrahl vorbeigeleitet werden. Alternativ wird die Widerstandsänderung über eine Kapillare beim Durchgang einer Zelle gemessen. Es findet eine starke Verdünnung der Probenlösung statt, was zu einer Verjüngung des Probenstromes und schließlich zur Vereinzelung der enthaltenen Zellen führt. Biochemische und physikalische Parameter der Zellen, z.B. Fluoreszenz, Granularität und relative Zellgröße können dabei simultan bestimmt werden [Robinson et al., 2004; Sack et al.,

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

2007]. Bei einem standardmäßigen Zytometer gibt das detektierte Streulicht Auskunft über die Eigenschaften der untersuchten Zellen. Die Intensität des Vorwärtsstreulichts (engl. forward scatter, FSC) hängt von der relativen Größe der Zelle ab. Das Seitwärtsstreulicht (engl. side scatter, SSC), welches im rechten Winkel streut, steht als Maß für die interzelluläre Granularität der untersuchten Zellen. Bei diesen Zytometern werden auch hauptsächlich Vakuumpumpen für die Injektion der Probensuspension in das Durchflusszytometer verwendet.

Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Cell Lab Quanta von Beckmann Coulter (Abbildung 9) injiziert eine Spritzenpumpe ein definiertes Volumen der Probenlösung bei stabilem und konstantem Fluss in die Flusszelle.

Abbildung 9: In der Arbeit verwendetes Durchflusszytometer Cell Lab Quanta SC (Beckman Coulter).

Somit kann die Konzentration der enthaltenen Bakterienzellen direkt in Abhängigkeit der Zeit bestimmt werden. Der laminare Hüllstrom leitet die Probenzellen in eine trianguläre Flusszelle (siehe Abbildung 10).

Abbildung 10: Schematischer Aufbau der triangulären Flusszelle des verwendeten Durchflusszytometers (entnommen aus Handbuch Cell Lab Quanta, 2005).

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Durch die Vereinzelung der Zellen aufgrund des laminaren Hüllstromes passiert nur eine Zelle pro Zeiteinheit den Laserstrahl. Beim verwendeten Zytometer stehen zur Detektion drei verschiedene Photomultiplier zur Verfügung. Diese detektieren jedoch nur jeweils in einem ganz bestimmten Wellenlängenbereich (FL 1: 525 nm, FL 2: 575 nm und FL 3: > 670 nm; + X in Abhängigkeit vom eingesetzten Filter) (siehe Abbildung 11).

Abbildung 11: Aufbau der Optik sowie Strahlengang des verwendeten Durchflusszytometers (gemäß Handbuch Cell Lab Quanta, 2005).

Beim verwendeten Zytometer von Beckman Coulter wird die Zellgröße durch das Coulter-Prinzip bestimmt. Dieses beruht auf der Veränderung des elektrischen Widerstandes, welche durch den Durchtritt der Zelle in der Elektrolytlösung durch die Flusszelle verursacht wird. Wenn sich eine Zelle in der Flusszelle befindet, erhöht sich der elektrische Widerstand; wenn die Flusszelle leer ist, ändert sich der Widerstand. Diese Widerstandsänderung wird detektiert und gibt Aufschluss über die Zellgröße. Die erhaltenen Messdaten werden als Punktwolke dargestellt.

Bei der Punktwolkendarstellung wird die Intensität zweier Messparameter für das gleiche Ereignis auf den beiden Diagramm-Achsen aufgetragen. Die Datenpunkte für Zellen desselben

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Typus erscheinen damit immer in der gleichen Diagrammregion. Das bedeutet, dass Ereignisse, die in derselben Diagrammregion auftreten und eine gemeinsame Punktwolke bilden, durch die genaue Definition einer Region zusammengefasst werden können. Das bedeutet faktisch, sie können ein und demselben Analyten zugeordnet werden.

Eine Quantifizierung von Zellen kann erfolgen, wenn einerseits die Häufigkeit fR [Ereignisse/min]

von Ereignissen, die der Region R zugeordnet werden, und andererseits die Flussrate Q [mL/min] bekannt ist. In diesem Fall kann die Konzentration c [Ereignisse/mL] anhand von Formel 1 berechnet werden:

𝑐 = 𝑓_𝑅 × 𝑄 (Formel 1)

Die routinemäßige Anwendung von Durchflusszytometrie hat besonders in der klinischen Diagnostik eine große Bedeutung. In der Hämatologie und Immunologie [Shapiro et al., 2005;

Jennings et al., 1998] finden besonders Geräte Anwendung, welche in der Lage sind, Bakterien zu detektieren, welche mitunter 1/1000 der Größe von eukaryotischen Zellen entsprechen. Im Rahmen von mikrobiologischen Untersuchungen werden hauptsächlich Wasserproben und Lebensmittel zytometrisch untersucht [Vives-Rego et al., 2000; Flint et al., 2006]. Entweder die Zellen werden nur gezählt, um eine quantitative Aussage zu erhalten. Eine andere Möglichkeit ist die Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen, welche zusätzliche Aussagen über physiologische und biochemische Eigenschaften der Analyten ermöglichen [Veal et al., 2000].

Die Verwendung der Durchflusszytometrie zum Nachweis von Legionella spp. wurde bereits in verschiedenen Studien beschrieben. In der Studie von Ingram et al. [1982] wurden L. pneumophila mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert und anschließend mit Durchflusszytometrie detektiert. Eine Kombination aus Kultivierung, Markierung der L. pneumophila-Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten polyklonalen Antikörper, Aufkonzentrierung der Bakterienlösung über Membranfiltration und anschließender Detektion über Durchflusszytometrie fand für L. pneumophila ebenso Anwendung [Füchslin et al., 2010].

Mit dieser Methode konnte für L. pneumophila eine Nachweisgrenze von 500 Zellen/L erreicht werden.

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Fluoreszenzfarbstoff SYTO 9 [Gaio et al., 2008]

verwendet. Er durchdringt die Zellmembran jeder lebenden Zelle und lagert sich in der im Zellkern befindlichen Zell-DNA an. Der Farbstoff, gebunden an die Zell-DNA, absorbiert das Laser-Licht bei einem Maximum von 480 nm. Das Emissionsmaximum wird bei 500 nm erreicht.

Daher wurde ein Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm eingesetzt. Die mit SYTO 9 angefärbten Zellen fluoreszieren deutlich geringer. Nicht angefärbte, d.h. meist tote Zellen und solche mit zerstörter Zellmembran, weisen eine deutlich geringere Intensität auf. Das hängt unmittelbar mit der erhöhten Quantenausbeute aufgrund der DNA-Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffes zusammen [Stocks et al., 2004]. Aufgrund dieser Eigenschaft ist nur eine eindeutige Fluoreszenzdetektion von Legionellen möglich, wenn diese die einzigen lebenden Zellen in der zu untersuchenden Probe sind. Davon kann man nur bei einer frischen Bakterienlösung ausgehen, wenn man die Zellen in autoklaviertem ultrareinem Wasser suspendiert. Aus diesem Grund kann diese Methode zur Herstellung von Kalibrierstandards eingesetzt werden, indem die Zellzahl in einer Reinstkultur bestimmt wird. Der spezifische Nachweis einzelner Spezies ist nur mit einem spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörper möglich.

Ein Nachteil der Durchflusszytometrie ist die fehlende Spezifizität. Alle lebenden Bakterien werden mit der Methode nachgewiesen, der Farbstoff interkaliert unspezifisch. Eine Quantifizierung ist bei Realproben somit nicht möglich. Lediglich aufgestockte Bakterienlösungen einer Reinkultur können über eine Kalibrierung mit vorab vermessener Verdünnungsreihe quantifiziert werden.