Analytische Mikroarrays

Analytische Mikroarrays werden eingesetzt, um die Nachteile von konventionellen Analysemethoden zu beseitigen. So können die aufwendige Aufarbeitung der Probe, eine eindimensionale Fokussierung auf einen Analyten, sowie zu kostenintensive Techniken vermieden werden. Durch die parallele Untersuchung von mehreren Analyten finden Mikroarrays besonders in der Lebensmittel- und Trinkwasseranalytik Anwendung [Rodriguez-Mozaz et al., 2006]. Auch in der klinischen Diagnostik kann eine Multiplex-Anwendung eine große Erleichterung im Arbeitsaufwand bewirken. Konventionelle Untersuchungsmethoden können durch analytische Mikroarrays ergänzt oder bestenfalls ersetzt werden. Besonders bei hohem Probendurchsatz und/oder einer aufwendigen Probenaufarbeitung kann mit einem Mikroarray eine Kostenreduktion und deutliche Zeitersparnis erreicht werden. Eine Mikroarray-Plattform bietet eine Vielzahl an Verwendungsmöglichkeiten und ist aufgrund ihrer zuverlässigen und robusten Ergebnisse in der Welt der Analytik sehr geschätzt. Da ein Mikroarray mit Standard-Detektionsmethoden kombiniert werden kann, findet er immer mehr Anwendung.

Ein analytischer Mikroarray hat eine Grundfunktion, die Quantifizierung von mehreren Analyten aus einer Probe [Seidel und Niessner, 2008]. Für eine quantitative Aussage müssen für jeden Analyten Kalibrierungen mit definierten Analyt-Standards durchgeführt werden. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, ist ein analytischer Mikroarray immer nach dem gleichen Grundprinzip aufgebaut: Zuerst werden die Fängermoleküle auf eine homogene Matrix aufgebracht. Die Immobilisierung der Fänger-Antikörper kann z.B. durch Mikrokontaktdruck

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geschehen. Danach erfolgt die Detektion des Mikroarray mit anschließender Datenauswertung (siehe Abbildung 22).

Abbildung 22: Schematisches Prinzip eines analytischen Mikroarrays: (A) Chip-Herstellung mittels Kontakt-Printer, (B) Auslesen des Chips über eine CCD-Kamera, (C) Erstellen einer Kalibrierung mittels einer Auswertesoftware [gemäß Seidel und Niessner, 2008].

Die nachfolgende Auswertung des analytischen Mikroarrays kann sehr vielseitig erfolgen.

Standardmäßig werden Fluoreszenz, Chemilumineszenz, elektrochemische Markierungen oder auch markierungsfreie Detektionsformen eingesetzt.

Wenn beispielsweise Bakterien über einen DNA-Mikroarray detektiert und quantifiziert werden sollen, ist meist eine DNA-Sonde als Gegenstück zu einem PCR-Fragment eines hochkonservierenden Gens auf dem Mikroarraychip immobilisiert. Damit wird eine eindeutige und hochspezifische Zuordnung zu dem entsprechenden Bakterienstamm ermöglicht. Bei der Hybridisierung werden markierte, einzelsträngige DNA-Fragmente auf dem Glasträger immobilisiert. Nach einem Waschschritt, der nicht gebundene Sequenzen entfernt, kann das Signal mittels eines Imaging-Verfahrens ausgelesen werden. Dieses Auslesen kann mithilfe eines Lasers, mit Chemilumineszenz oder Elektrodenarrays erfolgen. Das erhaltene Signal wird anschließend normiert und ausgewertet.

Bei einem Protein-Mikroarray werden im Gegensatz zur DNA-Variante auf jedem Spot kleinste Mengen an proteinhaltigem Probenmaterial fixiert [Malone et al., 2011]. Zur Immobilisierung des zu untersuchenden Probenmaterials ist ein spezielles Gerät notwendig. Weil der Protein-Chip nur eine kleine Testfläche und geringe Abstände zwischen den Probenspots aufweist, ist höchste Präzision beim Spotting-Vorgang erforderlich. Das kann am besten durch den Einsatz von Spotting-Robotern bzw. Mikrodosier-Maschinen gewährleistet werden. Das Immobilisieren

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des Probenmaterials auf dem Glasträger kann mittels zwei möglicher Verfahren erfolgen, kontaktlos [Barbulovic-Nad et al., 2006] oder durch Kontaktdrucken. Am Institut wird eine Immobilisierung von Antikörpern mit einem Kontaktdrucker durchgeführt. Je nach gewählter Detektionsmethode ist dann eine Unterscheidung zwischen den Spots mit und ohne Antigen-Protein-Wechselwirkung möglich. Die dabei detektierte Signalintensität ist von der Selektivität und Sensitivität der Antikörper abhängig.

Wenn der kontaktlose Spotting-Prozess angewandt wird, gelangt die Moleküllösung nicht durch direkten Kontakt auf die aktivierte Oberfläche, sondern durch die Erzeugung von einzelnen Tröpfchen. Diese fallen auf eine vorher definierte Position auf dem Mikroarraychip herunter.

Eine Erzeugung dieser Tröpfchen kann durch thermische-, Magnet- oder piezoelektrische Pumpen erfolgen. Vorteilhaft ist die wesentlich kürzere Dauer des Spotting-Prozesses, trotz wesentlich höheren technischen Aufwands. Weiterhin ist eine Verstopfung der Spotter-Düsen möglich, da oft mit salz- oder proteinhaltigen Spotting-Lösungen gearbeitet wird.

2.4.2.1. Statische analytische Mikroarrays

Bei statischen analytischen Mikroarrays findet die Reaktion auf der Oberfläche statt. Alle benötigten Reagenzien werden auf den Mikroarray dosiert und nach einer bestimmten Inkubationszeit wieder heruntergewaschen. Da keine Fluidik vorhanden ist, muss mit Zugabe der Lösungen sichergestellt werden, dass alle Reagenzien dort sind, wo die zu detektierende Reaktion des Analyten stattfinden soll. Die Verwendung von statischen Mikroarrays ist für Routineanwendungen nicht praktikabel, weil sowohl die Inkubation als auch die nachfolgenden Waschschritte alle manuell durchgeführt werden müssen. Um robuste, vertrauenswürdige und vor allem vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, müssten diese Vorgänge immer gleich durchgeführt werden. Statisch inkubierte Assays in Mikrotiterplatten oder kleinen Reaktionsgefäßen wären als alternative Lösung denkbar.

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2.4.2.2. Flussbasierte analytische Mikroarrays

Für die Detektion von L. pneumophila wurde im Rahmen dieser Arbeit ein flussbasierter analytischer Mikroarray verwendet. Zur Detektion wurde hierbei auf die Auswertung eines Chemilumineszenzsignals über eine CCD-Kamera zurückgegriffen.

Die Technik des flussbasierten Mikroarrays mit einer Detektion über Chemilumineszenz-Imaging wurde erstmals am Lehrstuhl für Analytische Chemie der TU München publiziert [Weller et al., 1999]. Der Mikroarray besteht aus einem oberflächenchemisch behandelten Glasträger, der Mikrokanäle enthält und auf dem verschiedene Antikörper immobilisiert sind. Der Durchfluss über den Mikroarraychip wird durch eine Mikrofluidik, durch die alle benötigten Reagenzien und Probenlösungen geleitet werden, gewährleistet. Die Pumpen und Ventile des Gerätes können mit einer Software programmiert werden. Die Etablierung von eigenen Messprogrammen, abgestimmt für verschiedene Analyten auf Basis von verschiedenen Assay-Formaten, ist problemlos möglich. Das beschriebene Messgerät MCR 3 wurde im Laufe der Jahre am Institut immer weiter verbessert und für verschiedene Anwendungen etabliert [Seidel et al., 2014]. In der Baureihe, mit der in dieser Arbeit gearbeitet wurde, ergänzen eine Probenschleife und eine beheizbare Flusszelle das Geräteportfolio. Die Bezeichnung MCR 3 SLT steht für Munich Chip Reader der 3. Generation, 'SL' bedeutet dabei sample loop und 'T' Temperatur. Die Detektionseinheit besteht aus einer CCD-Kamera, die das emittierte Chemilumineszenzsignal aufzeichnet. Eine Ergebnisauswertung kann dann mittels der Software erfolgen, die auch für das Programmieren der Pumpen und Ventile der Analysenplattform eingesetzt wird. Basis für die Immobilisierung der Analyten ist eine immer gleichbleibende Oberflächenchemie, mit der eine einheitliche Produktion der verwendeten Glasträger gewährleistet werden konnte. Diese ist im folgenden Abschnitt in allen einzeln durchgeführten Schritten beschrieben.