Entwicklung und Aufbau einer Bioaerosolkammer

In der Vergangenheit kam es immer wieder zu Legionellose-Ausbrüchen, die in Zusammenhang mit Infektionen über kontaminierte Duschen stehen. Da durch wasserführende Anlagen mit einer Temperatur zwischen 25 und 45 °C besonders für immunsupprimierte Menschen ein erhöhtes Infektionsrisiko besteht, wurde der Charakterisierung von Duschwasser und dem dabei ebenso entstehenden Aerosol eine erhöhte Aufmerksamkeit gewidmet. Duschwasser wird in der Dusche vernebelt und bildet so ein leicht zu inhalierendes Aerosol. Wenn in dem vernebelten Wasser lebende und infektiöse Legionellen vorkommen, können diese durch die feinen Verästelungen der Lunge sehr leicht in die Bronchien gelangen. Im Rahmen eines LGL-geförderten Projektes wurde in Zusammenarbeit mit Frau Bettina Kiwull (Aerosol-Arbeitsgruppe am IWC) eine Bioaerosolkammer entwickelt, die Untersuchungen von L. pneumophila-haltigen Duschbioaerosolen ermöglicht, die der Risikogruppe 2 angehören. Es sollte unter anderem untersucht werden, wie ein Duschaerosol generiert wird und ob nach dem Duschvorgang überhaupt noch lebende Mikroorganismen detektiert werden können. Da die Entwicklungsarbeit der Duschbioaerosolkammer einen Großteil der Aufgaben von Frau Kiwull betrifft, werden nur die Arbeiten im Ergebnisteil aufgeführt, welche gemeinsam durchgeführt wurden. Der Aufbau der Kammer sowie die Vorcharakterisierung der entstehenden Bioaerosole sind dementsprechend nur in der Doktorarbeit von Frau Kiwull zu finden.

3.5.1. Dichtigkeitsüberprüfung - Ultrareines Wasser mit Escherichia coli

Um Duschaerosole auf ihre Größe und Zusammensetzung hin analysieren zu können, wurde eine Bioaerosolkammer konstruiert. Zur Gewährleistung eines sicheren Umgangs mit gesundheitsgefährdenden luftgetragenen Mikroorganismen wurde diese Kammer in Kombination mit einer Biosicherheitskammer verwendet (Kammer-in-Kammer-Prinzip). Dies war notwendig, um sicher mit Organismen der Sicherheitsstufe Bio 2 arbeiten zu können. Dabei ist es ausschlaggebend, dass sowohl die äußere Sicherheitskammer als auch die innere Aerosolkammer frei von Leckagen sind. Auf diese Weise ist die Laboratmosphäre über eine doppelte Trennwand von dem potentiell infektiösen Aerosol isoliert. Zur Überprüfung der

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

Bioaerosolkammer auf Undichtigkeiten wurden Duschaerosole erzeugt, die E. coli als Modellorganismus enthielten. Über Kultivierung auf Agarplatten wurden pro Platte 0 bis 8 Kolonien nachgewiesen (siehe Abbildung 61).

Abbildung 61: Beispiel einer gewachsenen E. coli-Kolonie auf einer Agar-Platte; Experiment mit E. coli-haltigem Duschaerosol.

Bei der Detektion von E. coli in der Biosicherheitskammer ist vor allem zu beachten, dass weniger als 1 % der Oberfläche der Sicherheitskammer betrachtet wurde. Geht man von einer vollständigen Abscheidung und gleichmäßigen Verteilung von Bakterien-haltigen Aerosolpartikeln auf der Oberfläche der äußeren Biosicherheitskammer aus, so lässt sich die Konzentration in der Sicherheitskammer berechnen. Es ergeben sich im Vergleich zur maximal möglichen Konzentration Verdünnungsfaktoren von 3 × 10⁵ und 4 × 10⁵ für Bakterien aus.

Dieser Befund lässt die Schlussfolgerung zu, dass sich in der Bioaerosolkammer noch Leckagen befanden und eine Optimierung des Aufbaus für eine Anwendung von Aerosolen, die Legionellen enthalten, erforderlich war.

In einem finalen Schritt wurden die Endstopfen, welche die Löcher in der Bioaerosolkammer abdichten sollen, bei denen keine Bioaerosolprobenahme erfolgt, als ein Hauptverursacher identifiziert und ausgewechselt. Durch Verwendung von Dichtringen wurde diese Undichtigkeit behoben. Zusätzlich dazu wurden sowohl die Dichtung als auch Halterung der Frontscheibe der Bioaerosolkammer optimiert. Eine nachfolgende Wiederholung der Experimente mit E. coli

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zeigte, dass aus der Bioaerosolkammer keine ungewollten Bioaerosole mehr entweichen konnten.

Nach Verwendung bakterienhaltiger Wasserproben wurden Oberflächen und wasserführende Bestandteile des Systems mit 70 %-igem Ethanol beziehungsweise Natriumhypochlorit-Lösung, gereinigt. Es zeigte sich, dass für Probenahmestellen, an denen zuvor mittels Abklatschprobe E. coli nachgewiesen werden konnten, nach Desinfektion ein negativer Befund vorlag. Auch im Abwasser des Duschmodells ergab der Colilert-Wassertest einen negativen Befund. Vor der Dekontamination ergab sich im Abwasser eine Konzentration von 2 × 10⁴ – 2 × 10⁵ KBE/L. Es erfolgte also eine Reduktion um den Faktor 10⁴ bis 10⁵. Bei der Oberflächenreinigung wurden schwer zugängliche Stellen nicht beachtet. Hier ist eine Vernebelung von 30 %-iger Wasserstoffperoxid-Lösung von Vorteil. Dafür kann z.B. ein Ultraschall-Zerstäuber, der mit wässriger Wasserstoffperoxid-Lösung betrieben wird, in die Biosicherheitskammer integriert werden.

3.5.2. E. coli als Modellorganismus für Dusch-Bioaerosole

Im Projekt wurde auf lebende E. coli als Modellorganismus für Legionellen zurückgegriffen, um erste Untersuchungen von Duschbioaerosolen durchzuführen. Dabei wurden E. coli-haltige Duschaerosole mit einer Konzentration von 7 × 10⁷ Zellen/L (photometrisch über optische Dichte bestimmt) im Leitungswasser erzeugt. Über eine Pumpe wurde Luft mit einer Ansaugflussrate von 98 L/min über den Coriolis-Probenahmekopf angesaugt, wodurch Aerosolpartikel über Impingement in einem mit Flüssigkeit gefüllten Sammelgefäß abgeschieden werden konnten. Über den E. coli-Test (Colilert) wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in der Sammelflüssigkeit bestimmt und über das gesammelte Luftvolumen (686 L) die Konzentration an E. coli in der Aerosolphase der Bioaerosolkammer errechnet.

In dem vorgelegten Sammelgefäß konnte eine Konzentration von 8.726 KBE/100 mL bestimmt werden. Während der Sammlung wurde auch Duschwasser angesaugt. Somit vergrößerte sich das Volumen im Sammelgefäß um den Faktor 2,5. Die Sammeleffizienz des Coriolis µ wurde laut Carvalho et al. für Aerosole mit Durchmessern zwischen 2 µm und 6 µm auf 41 % bis 84 %

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definiert [Carvalho et al., 2008]. Im Rahmen einer früheren Studie wurde für den Coriolis µ eine Sammeleffizienz von 42 % bestimmt. Auf Basis eines Sandwich-Immunoassay wurden hierfür 3 m³ Luft mit einem Ansaugstrom von 300 L/m³ gesammelt [Langer et al., 2012]. Mit diesen beiden Werten konnte die Konzentration der E. coli-haltigen Duschaerosole mit 3 × 10⁴ KBE/m³ berechnet werden. Auf Grundlage der angenommenen Aerosolpartikelgröße von 2 µm wurde der Verteilungskoeffizient definiert (siehe Formel 5:

𝑉𝑒𝑟𝑡𝑒𝑖𝑙𝑢𝑛𝑔𝑠𝑘𝑜𝑒𝑓𝑓𝑖𝑧𝑖𝑒𝑛𝑡 = 𝑚𝑖𝑡𝑡𝑙𝑒𝑟𝑒 𝐵𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑒𝑛𝑑𝑖𝑐ℎ𝑡𝑒 𝑖𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝐿𝑢𝑓𝑡 [𝐶𝐹𝑈 × 𝑚⁻³] 𝑚𝑖𝑡𝑡𝑙𝑒𝑟𝑟𝑒 𝐵𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑒𝑛𝑑𝑖𝑐ℎ𝑡𝑒 𝑖𝑚 𝑊𝑎𝑠𝑠𝑒𝑟 [𝐶𝐹𝑈 × 𝐿⁻¹ ]

(Formel 5) Formel 5: Berechnung des Verteilungskoeffizienten gemäß: [Schoen et al., 2011]

Er wurde bei 4 × 10^-4 KBE m^-3/Zellen L^-1 bestimmt. Bei einem Duschvorgang von 7 min (Fließgeschwindigkeit 7 L/min) konnte man also davon ausgehen, dass insgesamt 0,6 ‰ aller E. coli aus dem Leitungswasser als Bioaerosol gesammelt werden konnten. Bei der Annahme einer Aerosolpartikelgröße von 6 µm sinkt dieser Wert auf 0,3 ‰. Für eine genauere Gefährdungsbeurteilung müsste jedoch die Sammeleffizienz in Abhängigkeit der Partikelgröße beurteilt werden. In bisherigen Studien wurde bisher nur ein Vorhersagemodell für Legionella spp. in wasserführenden Anlagen bestimmt [Schoen et al., 2011]. In einer Altenheimstudie wurde eine nicht größenselektive Sammelmethode verwendet [Bauer et al., 2008], die auch größere, nicht lungengängige Partikel quantifiziert. Derselbe Effekt kann beobachtet werden, wenn, wie auch in dieser Studie, die Sammlung der Aerosolpartikel mit dem Coriolis µ erfolgt.

Die Frage nach der Lungengängigkeit ist nur zu beantworten, wenn eine Größenverteilung der Aerosolpartikel vorliegt. Anhand derer lässt sich beurteilen, wie groß der Anteil der lungengängigen Aerosole ist. Entsprechend muss zukünftig untersucht werden, wie die Bakterien in den Größenfraktionen von Aerosolpartikeln verteilt sind.

ERGEBNISSE UND D^ISKUSSION

3.6. Etablierung eines Sandwich-Immunoassay-Mikroarrays zur Detektion von Cronobacter