Standardisierte Herstellungsverfahren

5.2.1. Herstellung DAPPG-beschichteter Mikroarrays 5.2.1.1. Vorbehandlung der Glasobjektträger

Zur Unterscheidung der modifizierten und der unmodifizierten Objektträgerseite wurde mit einem Glasdiamantstift eine Chargennummer eingeritzt. Die nummerierte Seite stellt in allen folgenden Schritten die unbeschichtete Seite des Glasobjektträgers dar.

Um Rückstände und Verunreinigungen, die von der Herstellung herrühren, vollständig zu entfernen, wurden die Glasträger in einer 200-mL-Färbeschale gefüllt mit einer 2 %-igen Hellmanexlösung für eine Stunde ins Ultraschallbad gestellt. Anschließend wurden sie für 18 h bei einer leichten Schüttelbewegung auf den Schüttler gestellt und danach 1 h erneut ins

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Ultraschallbad gestellt. Anschließend wurden die Glaschips mit 1 L destilliertem Wasser gespült, im Stickstoffstrom vollständig getrocknet und einer visuellen Kontrolle unterzogen.

5.2.1.2. Anätzen der Oberfläche

Die getrockneten, kontrollierten Glaschips wurden in einer Färbeschale mit 200 mL einer frisch vorbereiteten Mischung aus 37 % HCl und Methanol (1:1) für eine Stunde eingetaucht und auf dem Schüttler bei mäßiger Schüttelbewegung geschüttelt. Danach wurden die Glaschips mit 1 L Reinstwasser gespült und anschließend für 1 Stunde in einer Färbeschale mit 200 mL konzentrierter Schwefelsäure bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Schluss wurden die Objektträger mit 1 L Reinstwasser gespült und danach gründlich im Stickstoffstrom getrocknet.

5.2.1.3. Silanisierung mit GOPTS

Zur Silanisierung wurde die Sandwich-Technik verwendet. Dafür wurden zwei Objektträger mit der markierten Seite nach unten in eine große Petrischale gelegt, je Chip 600 µl GOPTS darauf pipettiert und dann mit einem weiteren Glasträger (mit der markierten Seite nach oben) belegt.

In geschlossenen Petrischalen wurden diese Sandwich-Chips 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Sandwich-Chips manuell in Ethanol getrennt und in eine Färbeschale mit 200 mL Ethanol überführt. Darin wurden sie 15 min bei Raumtemperatur im Ultraschallbad gereinigt. Anschließend wurde Ethanol durch Methanol ersetzt und der Schritt wiederholt. Zu guter Letzt wurden die Chips erneut in eine Färbeschale mit 200 mL Ethanol gegeben und 15 min im Ultraschallbad gereinigt. Abschließend wurden die Mikroarray-Chips im Stickstoffstrom getrocknet und visuell auf Schlieren kontrolliert.

5.2.1.4. Beschichtung mit DAPPG

Für die Beschichtung von ca. 40 hergestellten Glaschips wurden ca. 20 g DAPPG im auf 98 °C vorgeheizten Trockenschrank geschmolzen. Die Chips wurden mit der markierten Seite nach unten in die Petrischalen gelegt. Für die Beschichtung wurde erneut die Sandwich-Technik angewendet. Es wurden pro Chip 600 µL flüssiges DAPPG aufpipettiert und darauf ein weiterer

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Chip mit markierter Seite nach oben gelegt. Diese Sandwiches wurden in verschlossenen Petrischalen für 15 h bei 98 °C im Trockenschrank inkubiert. Anschließend wurden die Glaschips im heißen Zustand in Reinstwasser getrennt, in Färbeschalen gefüllt mit Reinstwasser überführt und darin zweimal (unter Austausch des Wassers) für 15 min zur Reinigung ins Ultraschallbad gestellt. Danach folgten eine letzte Spülung mit 1 L Reinstwasser sowie die anschließende Trocknung im Stickstoffstrom. Nach visueller Kontrolle können die DAPPG- belegten Glaschips in Plastikbehältern im Exsikkator aufbewahrt werden.

5.2.2. Aktivierung der Chips mit DSC

Zur Aktivierung der Oberfläche wurden 600 μL einer Lösung von 180 mg DSC, 10 mg DMAP und 225 μL Triethylamin in trockenem DMF (3 mL) auf jeden DAPPG-Glasträger aufgegeben. Nach dem Sandwich-Prinzip wurden erneut zwei Chips aufeinander positioniert. Die Inkubation erfolgte für 4 h bei RT in Petrischalen. Nach dem Trennen der Chips in Methanol wurden sie sofort in eine mit Methanol gefüllte Färbeschale überführt und zweimal für 5 min im Ultraschallbad gereinigt, wobei zwischen den beiden Reinigungsschritten das Methanol durch frisches ersetzt wurde. Nach Trocknung der Chips im Stickstoffstrom wurden sie erneut visuell auf Schlieren kontrolliert und kurzzeitig unter Stickstoffatmosphäre aufbewahrt.

5.2.3. Immobilisierung der Antikörper

Nach der Durchführung aller bisherigen Schritte war die Oberfläche der Glasobjektträger so aktiviert, dass Antikörper kovalent an der Oberfläche gebunden werden konnten und damit immobilisiert wurden.

Zur Mikrodosierung wurde das Gerät BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer verwendet.

Die Luftfeuchtigkeit wurde auf 50 % festgelegt, die Auflagefläche der Glasträger auf 15 °C gekühlt. Folgende Lösungen wurden bei der Herstellung des Mikroarrays verwendet:

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 pAb anti-HRP (100 μg / mL in Spottingpuffer) = Positivkontrolle

 Spottingpuffer = Negativkontrolle

 pAb oder mAb anti-L. pneumophila in Spottingpuffer (Verdünnung 1:1)

Von diesen Lösungen wurden jeweils Aliquota von 35 μL in eine Kavität einer 384-well-Mikrotiterplatte überführt. Diese wurde an der dafür vorgesehenen Stelle des MiniArrayers platziert. Die Übertragung auf die aktivierten Glaschips erfolgte mit einer Mikrokontaktnadel.

Dabei wurde jeweils etwa 1 nL Antikörperlösung aufgebracht.

Der Abstand zwischen den einzelnen Replikaten derselben Antikörper-Lösung betrug 1100 μm, der Abstand zwischen Reihen mit unterschiedlichen Antikörper-Lösungen betrug 1500 μm.

Nach dem Aufbringen der Antikörperlösungen wurden die Mikroarrays über Nacht bei Umgebungstemperatur in geschlossenen Petrischalen gelagert, die 500 μL Reinstwasser enthielten. Um freie Bindungsstellen auf der Mikroarray-Oberfläche abzusättigen und Hintergrundeffekte zu verringern, wurden die Glasträger für 15 min in einer TRIS-HCl-Lösung (pH 8,5) geschüttelt. Nach einem kurzen Spülschritt mit ultrareinem Wasser und anschließend Methanol wurden die Glaschips im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurden sie zu fertigen Chips weiterverarbeitet.

5.2.4. Kleben der Antikörper-Mikroarrays

Um einen Messvorgang durchführen zu können, war das Fertigen einer Durchflusszelle erforderlich. Eine doppelseitig klebende PE-Folie, aus der zwei Messkanäle (Flusszellen) mit einem Volumen von ca. 50 µL ausgeschnitten waren, wurde an einen planaren Kunststoffträger (PMMA) gekoppelt. Die aktivierte, danach gespottete und anschließend geblockte Antikörper-Mikroarray-Chipoberfläche wurde so auf den PMMA-Kunststoffträger gekoppelt, dass die beschichtete Chipseite direkt auf dem Träger haftete. Danach wurden in jeden Kanal des Chips 60 µL von 1 %-igem BSA (w/v) in PBS (pH 7,6) gefüllt und rückseitig mit Klebefolie verschlossen.

Somit konnte ein Abblocken der freien Bindungsstellen sichergestellt werden. Die fertigen

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Antikörper-Mikroarrays (siehe Abbildung 68) wurden bis kurz vor ihrer Verwendung in PBS bei 4

°C aufbewahrt.

Abbildung 68: Schematische Abbildung des Mikroarray-Chips für die Messungen am MCR 3 SLT [gemäß Kloth et al., 2009 – modifiziert]

Der Chip wurde in der beheizbaren Schublade direkt an das fluidische System angeschlossen und besitzt deshalb Einlass- bzw. Auslassöffnungen. Der so hergestellte, dreiteilige Mikroarray-Chip mit zwei getrennten Flusszellen konnte nun zur Messung in die Schublade der Messeinheit am MCR 3 eingelegt werden.