Untersuchung der Translokation von NFκB in den Zellkern

Ist der NFκB-Signalweg aktiviert, transloziert NFκB in den Zellkern. Dort steuert der Transkriptionsfaktor die Expression einer Vielzahl von Genen. Im Zytoplasma liegt NFκB stets gebunden an IκBα und somit inaktiv vor (Neumann and Naumann, 2007).

Die Lokalisation von NFκB lässt daher Rückschlüsse auf die Aktivierung des Signal-weges zu. Bislang liegen keine Daten über die Aktivierung der Signalkaskade in FLT3-Zellen mit einer TKD1-ITD vor. Die Behandlung der Ba/F3-FLT3-ITD-627E mit dem IKKβ-Inhibitor IMD-0354 (s. 4.2.1) hat ergeben, dass die Zellen für ihr Überleben eine Abhängigkeit von der Aktivierung des NFκB-Signalwegs besitzen. Auch die getesteten Ba/F3-FLT3-ITD Zellen zeigten, dass sie für das Überleben vom NFκB-Signal abhän-gig sind. Um nun die NFκB-Aktivierung in Ba/F3-FLT3-ITD-627E und Ba/F3-FLT3-ITD Zellen direkt nachzuweisen, sollte die Lokalisation von NFκB untersucht werden. Der Transkriptionsfaktor NFκB ist ein Dimer aus verschieden Rel-Proteinen, wobei im Fol-genden p65 als häufigster Partner im Dimer analysiert wird (Perkins and Gilmore, 2006).

Die Bestimmung der Lokalisation eines Proteins mittels Western Blot erfordert es, eine fraktionierte Proteinisolierung durchzuführen, wodurch die zytoplasmatische und nuk-leäre Proteinfraktion voneinander getrennt werden (s. 3.2.1). Als Ladungskontrolle für das Zytoplasma diente GAPDH, ein Protein, das nicht nukleär lokalisiert ist. Für die Kernfraktion wurde als Beladungskontrolle die Histon-Deactylase-1 (HDAC-1) ver-wendet. Bei HDAC-1 handelt es sich um ein Histon modifizierendes Enzym, welches an der Regulation der Transkription beteiligt ist (Brehm et al., 1998). Die Expression von HDAC-1 ist auf den Nukleus begrenzt. Alle Versuche wurden wie folgt durchge-führt: die Zellen wurden vor jedem Versuch dreimal mit PBS gewaschen, um FCS- oder IL-3-Rückstände zu entfernen und anschließend in Medium aufgenommen, wel-ches nur 0,5% FCS und kein IL-3 enthielt. Dies sollte eine unspezifische Aktivierung der p65-Signaltransduktion durch die im FCS enthaltenen Zytokine verhindern.

Zunächst wurde in unbehandelten Zellen geprüft, ob p65 im Kern vorliegt, was Folge einer Aktivierung der NFκB-Signaltransduktion wäre. Als Kontrolle für eine Zelllinie, bei welcher kein p65 im Kern vorliegen sollte, wurden die Ba/F3-FLT3-WT Zellen mitge-führt. Das Ergebnis der Western Blot Analyse ist in Abbildung 60 dargestellt.

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Abbildung 60: In den untersuchten Ba/F3 Zellen ist p65 im Zellkern lokalisiert.

Es wurden 15x10⁶ Zellen für die fraktionierte Proteinisolierung eingesetzt. Aufgetragen sind 15 µg der fraktionierten Proteinlysate von unbehandelten und 4 Stunden IL-3 entzogenen Ba/F3-FLT3-ITD (I), Ba/F3-FLT3-ITD-627E (E) und Ba/F3-FLT3 WT-Zellen (W). Die Zellen wurden während der 4 Stunden auf Hungermedium mit nur 0,5% FCS gehalten, um eine Aktivierung von p65 durch Zytokine zu verhindern.

Nach der Dehybridisierung der Phospho-Antikörper wurden totale Antikörper hybridisiert, um die Lage der phosphorylierten Proteine zu verifizieren. GAPDH und HDAC-1 dienten als Kontrollen für die gleiche Proteinbeladung der Spuren.

Es zeigte sich, dass p65 bei allen drei untersuchten Zelllinien sowohl im Zytoplasma als auch im Kern vorlag, was auf eine generelle Aktivierung des NFκB-Weges in Ba/F3-Zellen hindeutete. Es waren Unterschiede hinsichtlich der Menge an p65 im Kern zu erkennen, wobei in den Ba/F3-FLT3-ITD-627E-Zellen eine starke Aktivierung der NFκB-Signaltransduktionswege vorzuliegen scheint, da sich in dieser Probe ein starkes Signal von p65 im Kern erkennen ließ. Bei der Betrachtung der Beladungskon-trollen GAPDH und HDAC-1 wurde deutlich, dass Zytoplasma- und Kernfraktion sau-ber voneinander getrennt wurden. Der Nachweis von HDAC-1 ergab in der nukleären Fraktion ein starkes Signal, während sich das GAPDH Signal überwiegend im Zyto-plasma zeigte. Bei den P-FLT3 Signalen im Kern handelt es sich um unspezifische Banden des Antikörpers, wie gut durch den Nachweis von totalem FLT3 im Kern er-sichtlich wurde. Hier zeigte sich, dass die detektierten Banden im Kern eine andere Höhe aufweisen, als die Banden im Zytoplasma.

Um im Folgenden die spezifische Aktivierung von NFκB durch den FLT3-Rezeptor zu untersuchen, wurden die Zellen mit Midostaurin behandelt. Eine Midostaurin-Behandlung führt zur Inhibition des FLT3-Rezeptors und damit auch zur Inhibition der nachgeschalteten Signalwege. Sollte die p65-Translokation in den Kern FLT3-ITD

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abhängig sein, sollte die Menge an p65 im Kern durch Midostaurin-Behandlung redu-ziert werden. Das Ergebnis der 16-stündigen Behandlung mit einer Midostaurin-Konzentration (100 nM) oberhalb der IC50-Konzentration ist in Abbildung 61 zusam-mengefasst.

Abbildung 61: Die p65-Translokation in den Zellen ist abhängig von der Aktivität eines FLT3-ITD-Rezeptors.

Es wurden 15x10⁶ Zellen für 16 Stunden mit 100 nM Midostaurin behandelt. Aufgetragen sind 15 µg Pro-tein der jeweiligen ProPro-teinfraktion. Zytoplasma und Kernfraktion wurden auf zwei getrennten Membranen analysiert. Die Zellen wurden bereits 2 Stunden vor und während der Behandlung auf Hungermedium mit nur 0,5% FCS gehalten, um eine unspezifische Aktivierung der p65-Signalwege durch Zytokine zu mini-mieren. Nach der Dehybridisierung der Phospho-Antikörper wurden totale Antikörper hybridisiert, um die Lage der phosphorylierten Proteine zu verifizieren. Für das Zytoplasma erfolgte keine Hybridisierung von HDAC-1 und für die Kernfraktion keine Hybrisierung von GAPDH.

Zunächst konnte der Erfolg der Midostaurin-Inkubation durch die fehlende FLT3- so-wie STAT5-Phosphorylierung in diesen Proben festgestellt werden. In der Kernfraktion konnte kein FLT3-Signal detektiert werden. Bei den sichtbaren Banden handelt es sich um unspezifische Banden des Antikörpers. In den Midostaurin behandelten Proben zeigte sich sowohl in Ba/F3-FLT3-ITD als auch in Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zellen, eine deutliche Reduktion des Signals im Kern, was auf eine Abhängigkeit der p65-Translokation von der FLT3-Signaltransduktion schließen lässt. Es ist jedoch unklar, ob p65 im Zytoplasma retiniert wird, da keine Zunahme der p65-Menge im Zytoplasma erkennbar war. Erneut wurde deutlich, dass die Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zelllinie bei gleicher Proteinbeladung höhere p65-Mengen im Kern aufweist als Ba/F3-FLT3-ITD

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Zellen. Aufgrund der Tatsache, dass eine Abnahme von p65 im Zellkern zu beobach-ten war, stellte sich die Frage nach der Kinetik der NFκB-Translokalisation. Auf einen Nachweis der Ladungskontrolle HDAC-1 im Zytoplasma sowie von GAPDH in der Kernfraktion wurde verzichtet, da in vorangegangenen Experimenten gezeigt werden konnte, dass die Präparation zu einer guten Trennung der beiden Fraktionen führt.

Es ist bekannt, dass die Translokation von p65 in den Kern z.B. nach TNFα-Stimulation innerhalb weniger Minuten erfolgt (Brown et al., 1993). Über die Kinetik der p65 Relokalisation ins Zytoplasma ist bekannt, dass diese in erster Linie von neusyn-thetisertem IκBα vermittelt wird (Arenzana-Seisdedos et al., 1997). Eine weitere Mög-lichkeit zur Termination der p65 Aktivität im Kern stellt die proteosomale Degradation des Faktors dar (Saccani et al., 2004). Beide Vorgänge zeigen nach TNFα-Stimulus eine rasche Kinetik (Maine et al., 2007). Um auszuschließen, dass die Relokalisation von p65 bereits nach kurzer Zeit vollzogen ist und stärkere Effekte aufgrund dessen nicht detektiert wurden, wurde eine Kinetik für die Midostaurin-Behandlung durchge-führt. Dabei wurde die Lokalisation von p65 über einen Zeitraum von 0–12 Stunden überprüft. Da es Hinweise gibt, die eine Abhängigkeit der p65-Translokation von der FLT3-ITD-Aktivierung beschreiben (Grosjean-Raillard et al., 2008), wurde diese Kine-tik zunächst für Ba/F3-FLT3-ITD Zellen durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 62 zusammengefasst.

Abbildung 62: Die p65-Translokation zeigt eine Abhängigkeit von der FLT3-ITD-Aktivität.

Es wurden 15x10⁶ Ba/F3-FLT3-ITD Zellen für die angegeben Zeitpunkte mit 100 nM Midostaurin behan-delt. Die Zellen wurden während der Behandlung in Zellkulturmedium mit 0,5%igem FSC gehalten. Aufge-tragen sind 15 µg der entsprechenden Proteinfraktion. Zytoplasma und Kernfraktion wurden auf separa-ten Gelen aufgetragen. P-FLT3- und FLT3-Antikörper wurden nicht auf Membran mit der Kernfraktion hybridisiert. Nach der Dehybridisierung der Phospho-Antikörper wurden totale Antikörper hybridisiert, um die Lage der phosphorylierten Proteine zu verifizieren. Als Beladungskontrolle wurde für die Zytoplasma-Fraktion GAPDH und für die Kern-Zytoplasma-Fraktion HDAC-1 verwendet. Für das Zytoplasma erfolgte keine Hybri-disierung von HDAC-1 und für die Kernfraktion keine HybriHybri-disierung von GAPDH.

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Die Effektivität der Midostaurin-Behandlung konnte über Reduktion der FLT3-Phosphorylierung und der Inhibition der nachgeschalteten STAT5-Aktivierung in der Zytoplasma-Fraktion festgestellt werden. Bei der Analyse von p65 im Kern wurde deutlich, dass die Lokalisation nur eine geringe Abhängigkeit von der Behandlung mit Midostaurin und damit von der FLT3-Aktivierung zeigt. Es wurde nach 10-12 Stunden Midostaurin-Exposition eine leichte Abnahme des p65-Signals im Zellkern detektiert.

Die Beladungskontrolle HDAC-1 ergab eine gleichmäßige Proteinbeladung in den re-levanten Proben. Trotz der Abnahme von p65 im Zellkern konnte keine Zunahme von p65 im Zytoplasma zu diesem Zeitpunkt festgestellt werden. Auf einen Nachweis der Ladungskontrolle HDAC-1 im Zytoplasma sowie von GAPDH in der Kernfraktion wur-de verzichtet, da in vorangegangenen Experimenten gezeigt werwur-den konnte, dass die Präparation zu einer guten Trennung der beiden Fraktionen führt.

In einem nächsten Ansatz sollte nun überprüft werden, ob auch für Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zellen eine Abhängigkeit der p65-Translokation vom FLT3-Signal besteht. Dazu wurde auch mit diesen Zellen eine Midostaurin-Kinetik erstellt. Das Ergebnis ist in Ab-bildung 63 zu sehen.

Abbildung 63: Unter Midostaurin-Exposition zeigt sich in Ba/F3-FLT3-ITD-627E-Zellen eine Reduktion von p65 im Kern.

Die 15x10⁶ Zellen wurden bereits vor Beginn der Behandlung für 2 Stunden mit Zellkulturmedium inku-biert, das nur 0,5% FCS enthielt. Zytoplasma und Kernfraktion wurden auf einem Gel aufgetragen. 1 p65) Gemeinsame Detektion des Signals im Zytoplasma und im Kern. 2 p65) Alleinige Detektion des p65-Signals, die Zytoplasma-Signale wurden nicht analysiert. Die Proteinisolierung erfolgte direkt nach Ende der TKI-Inkubation. Aufgetragen sind 15 µg der Proteinfraktion. Die Proteinfraktionen wurden gemeinsam auf einer Membran analysiert.

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Die Effektivität der Midostaurin-Behandlung konnte durch die Inhibition der FLT3- und STAT5-Phosphorylierung nachgewiesen werden. Bei den Banden für P-FLT3 und FLT3 in der Kernfraktion handelt es sich um unspezifische Banden des Antikörpers.

Bei der Analyse der p65-Lokalisation in den Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zellen konnte ebenfalls eine gewisse Abhängigkeit der p65-Lokalisation von einer Midostaurin-Behandlung und damit von einer FLT3-Aktivierung beobachtet werden. Nach 6 Stun-den zeigte sich eine leichte Reduktion der p65-Menge im Kern. Die gleichmäßige Pro-teinbeladung der Spuren zu diesem Zeitpunkt wurde durch den Nachweis von HDAC-1 verifiziert. Es zeigte sich bei der Betrachtung der jeweiligen Beladungskontrollen für das Zytoplasma und die Kernfraktion, dass beide Fraktionen ohne größere Verunreini-gungen voneinander getrennt werden konnten. Der Nachweis von HDAC-1 ergab in der nukleären Fraktion ein starkes Signal, während sich das GAPDH Signal überwie-gend im Zytoplasma zeigte. Trotz der Reduktion von p65 im Kern konnte keine Zu-nahme von p65 im Zytoplasma festgestellt werden.

Insgesamt konnte mittels fraktionierter Proteinisolierung im Western Blot eine Abhän-gigkeit der p65-Translokation von der FLT3-Aktivierung für die Zelllinien Ba/F3-FLT3-ITD sowie Ba/F3-FLT3-Ba/F3-FLT3-ITD-627E festgestellt werden. Dabei scheint die Reduktion der p65-Menge im Kern einer zeitlich langsamen Kinetik zu unterliegen, da eine Abnahme erst nach 6 Stunden detektiert werden konnte.