Überprüfung des IL-3-unabhängigen Wachstums

Die murine pro-B-Lymphozyten Zelllinie Ba/F3 ist für ihr Wachstum auf IL-3 angewie-sen (Palacios and Steinmetz, 1985). Die Transfektion von Onkogenen in parentale Ba/F3-Zellen bewirkt eine Aktivierung verschiedener Signaltransduktionswege, was in einer onkogenen Transformation der Zellen resultiert und den Zellen die Fähigkeit zu klonalem und IL-3-unabhängigen Wachstum verleiht (Mizuki et al., 2000; Kelly et al., 2002). Lediglich Zellen, die die Plasmid-DNA aufgenommen haben und das Onkogen

Ergebnisse

[143]

exprimieren weisen diese Eigenschaft auf. Der Entzug von IL-3 (s. 3.3.2) eignet sich somit auch zur Selektion der transfizierten Zellen. Diese Art der Selektion bietet den Vorteil, dass auf den Einsatz von Antibiotika vollständig verzichtet werden kann.

Als Kontrollen für die korrekte Durchführung wurden FLT3-ITD und Ba/F3-FLT3-WT Zellen mitgeführt. Die Ba/F3-FLT3-ITD Zellen sind in der Lage in IL-3-freiem Medium zu wachsen, da sie durch die FLT3-ITD-Expression transformiert sind. Die Ba/F3-FLT3-WT sollten jedoch nicht in der Lage sein ohne IL-3 zu wachsen, da der Rezeptor nicht durch eine Mutation konstitutiv aktiv ist. Um das weitere Wachstum aller Zelllinien auf IL-3 zu dokumentieren, wurde ein Ansatz der Zellen nach der Waschprozedur in IL-3-haltiges Medium zurückgesetzt und der DNA-Gehalt wurde täglich mittels Propidiumiodid (s. 3.3.3.2) bestimmt. Das Ergebnis dieser Analyse ist als prozentualer Anteil der viablen Zellen in Abbildung 50 dargestellt.

Abbildung 50: Ba/F3-FLT3-ITD und Ba/F3–FLT3-ITD-627E Zellen zeigen nach 96 Stunden viable Zellen im IL-3-freien Zellkulturmedium.

Es wurden 5x10⁴ Zellen pro ml sowohl auf IL-3-freies (-IL-3) als auch auf 10% IL-3-haltigem Medium (+IL-3) kultiviert. Die Zellzyklus-Analyse wurde zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt. Dargestellt ist der Anteil der vitalen Zellen (100% - subG1%) als Mittelwert aus drei unabhängigen Messungen.

Es wurde deutlich, dass die neu generierte Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zelllinie ebenso wie die Onkogen-transformierte Zelllinie Ba/F3-FLT3-ITD in IL-3-freiem Medium viable Zellen zeigten. Die Zelllinie wies auch 96 Stunden nach dem Entzug von IL-3 mehr als 90% vitale Zellen auf. In Bezug auf den Anteil viabler Zellen konnten für Ba/F3-FLT3-ITD sowie Ba/F3-FLT3-Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zellen keine Unterschiede zwischen dem Wachstum in An- oder Abwesenheit von IL-3 festgestellt werden. Die Ba/F3-FLT3-EKA-Zellen,

Ergebnisse

[144]

welche keine FLT3-Kinaseaktivität mehr besitzen, waren nicht in der Lage in der Ab-wesenheit von IL-3 zu proliferieren. Bereits 48 Stunden nach dem IL-3 Entzug waren nur noch etwa 20% der Zellen vital, während die mit IL-3 gehaltenen Zellen weiterhin vital waren. Die Ba/F3-FLT3-WT Zellen waren ebenfalls nicht in der Lage, in IL-3-freiem Medium zu wachsen und zeigten nach 96 Stunden keine lebenden Zellen mehr.

Es konnte somit gezeigt werden, dass die mit FLT3-ITD-627E transfizierten Zellen in der Lage sind, IL-3-unabhängig zu proliferieren. Weiterhin wurde mit dem IL-3-Entzug eine positive Selektion auf transfizierte Zellen durchgeführt. Für die Ba/F3-FLT3-EKA Zellen konnte festgestellt werden, dass die FLT3-ITD-627E-Mutation ohne die Kinase-aktivität den transfizierten Ba/F3-Zellen nicht die Fähigkeit zu Zytokin-unabhängigem Wachstum verleiht. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Kinaseaktivität für die onkogene Transformation der Zellen entscheidend ist.

Um zu überprüfen, ob das IL-3-unabhägige Wachstum der Ba/F3-FLT3-ITD-627E-Zellen nur von der FLT3-Aktivierung abhängig ist und nicht durch ein sekundäres FLT3-ITD unabhängiges Ereignis vermittelt wird, wurde ein knock down (s. 3.3.4) von FLT3 mittels spezifischer siRNA durchgeführt. Als Positiv-Kontrolle für eine FLT3-abhängige Zelllinie wurden Ba/F3-FLT3-ITD Zellen mitgeführt. Die Ba/F3-FLT3-EKA-Zellen wurden von dieser Analyse ausgeschlossen, da sie kein Wachstum in IL-3-freiem Medium zeigten. Die Transfektionseffizienz des FLT3-siRNA knock downs wur-de mit Hilfe einer Alexa488-markierten Negativ-siRNA bestimmt und war bei jewur-dem wur-der durchgeführten Versuche größer 90%. Das Ergebnis einer repräsentativen Effizienz-Messung ist in Abbildung 51 dargestellt.

Abbildung 51: Die mit FLT3 spezifischer siRNA transfizierten Ba/F3 Zellen wei-sen eine hohe Transfektionseffizienz auf.

In rot abgebildet sind nicht transfizierte und in blau mit der Negativ-siRNA transfizierte Zellen. Dargestellt ist die Signalintensität in abiträren Einheiten gegen die Zellzahl. Angegeben ist der Prozentsatz der Alexa-488 positiven Zellen als Anteil an der Gesamtpopulation. Die Transfektionseffizienz wurde 4 Stunden nach Durchführung des siRNA-vermittelten knock downs bestimmt. Die graphische Aufbereitung der Daten erfolge mittels der FLOWJO-Software.

Ergebnisse

[145]

Im Anschluss wurde der siRNA-vermittelte knock down des FLT3-Rezeptors auf Pro-teinebene mittels Western Blot bestimmt. Dazu wurden acht Stunden nach Durchfüh-rung des knock downs Proteinlysate hergestellt. Im Western Blot erfolgte der Nach-weis von phosphoryliertem sowie unphosphorlyiertem FLT3. Als Kontrolle wurde eine Probe mitgeführt, die lediglich der Prozedur der Transfektion unterzogen wurde (- siRNA). Um den unspezifischen Effekt von eingebrachter siRNA zu überprüfen wurde zusätzlich ein Ansatz mit einer Negativ-siRNA (neg. siRNA) transfiziert, deren Se-quenz keine komplementäre SeSe-quenz in der murinen mRNA finden kann. Als weitere Kontrolle wurde gleichzeitig ein FLT3 knock down der Ba/F3-FLT3-ITD Zellen durch-geführt. Das Ergebnis der Western Blot Analyse und der densitometrischen Auswer-tung des gezeigten Blots ist in Abbildung 52 zusammengestellt.

Abbildung 52: Die Transfektion von FLT3 spezifischer siRNA führt zum Protein knock down des FLT3-Rezeptors.

(A) Die Analyse der Proteinlysate erfolgte acht Stunden nach Durchführung des FLT3 knock downs. Der Ansatz – siRNA wurde ohne Zugabe von siRNA der Prozedur unterzogen. Die Negativ-siRNA Kontrolle wurde so gewählt, dass es keine Entsprechung in der murinen mRNA gibt. GAPDH diente als Kontrolle für die gleiche Beladung der Spuren. Es wurden 25 µg Gesamtprotein aufgetragen. (B) Gezeigt ist die densitometrische Auswertung des in (A) gezeigten Blots. Die Auswertung erfolgte mittels der Graphik-Software Image J. Die Daten wurden normalisiert nach der Rechnung: ((FLT3 Signal Probe/ FLT3 Signal – siRNA) / (GAPDH Signal Probe/ GAPDH Signal – siRNA).

In der Western Blot Analyse zeigte sich, dass der knock down von FLT3 sowohl in den Kontroll-Zellen, als auch in den Ba/F3-FLT3-ITD-627E Zellen erfolgreich war. Für bei-de Zelllinien konnte nach bei-der Transfektion mit FLT3-spezifischer siRNA kein Signal für FLT3 mehr nachgewiesen werden. Die Reduktion des FLT3-Proteinlevels betrug nach densitometrischer Auswertung bereits acht Stunden nach Durchführung des knock downs 90% in beiden Zelllinien. In den Kontrollansätzen waren sowohl Signale für phosphoryliertes als auch für unphosphoryliertes FLT3 vorhanden, so dass eine un-spezifische Regulation des FLT3-Rezeptors ausgeschlossen werden konnte.

Ergebnisse

[146]

Um nun festzustellen, ob die Ba/F3-FLT3-ITD627E Zellen nach dem knock down von FLT3 ihre Fähigkeit zum IL-3-unabhängigem Wachstum verlieren, wurde eine Zellzyk-lus-Analyse mittels Propidiumiodid durchgeführt. Das Ergebnis dieser Messungen ist in Abbildung 53 aufgeführt.

Es zeigte sich, dass 48 Stunden nach dem siRNA-vermittelten knock down von FLT3 beide Zelllinien in IL-3-freiem Medium signifikant erhöhte Level an apoptotischen Zel-len aufwiesen. FLT3-ITD-627E ZelZel-len zeigten 77% apoptotische ZelZel-len, Ba/F3-FLT3-ITD Zellen 80%. Die Kontrollansätze, bei denen kein FLT3 knock down vorlag, zeigten hingegen nur eine geringe Apoptoserate, von deutlich weniger als 20%

apoptotischen Zellen. Die Fähigkeit zu IL-3-unabhängigem Wachstum steht somit in direkter Verbindung mit der Expression des FLT3-ITD bzw. des FLT3-ITD-627E Kon-strukts.

Abbildung 53: Durch den siRNA-vermittelten knock down von FLT3 verlieren Ba/F3-FLT3-ITD positive Zellen die Fähigkeit zu IL-3-freiem Wachstum.

Es wurden 1x10⁶ Zellen mit 2 µM der jeweiligen siRNA transfiziert und anschließend in einer Konzentrati-on vKonzentrati-on 1x10⁵ Zellen pro ml in IL-3-freiem Zellkulturmedium kultiviert. Nach 48 Stunden wurde der Pro-zentsatz an Zellen in der subG1-Phase des Zellzyklus mittels Propidiumiodid bestimmt. Der Ansatz – siRNA wurde ohne Zugabe von siRNA der Prozedur unterzogen. Die Negativ-siRNA Kontrolle wurde so gewählt, dass es keine Entsprechung in der murinen mRNA geben sollte.