Induktion von Apoptose nach Kurzzeit-Inkubation mit Hochdosis-Tyrosinkinase-

Auf Basis eigener Daten konnte ein unspezifischer zytotoxischer Effekt der Kurzzeit-Exposition mit Hochdosis TKI als Erklärung für die Apoptoseinduktion weitgehend ausgeschlossen werden (s. 4.4.1). Bei Betrachtung der erhobenen Daten zur Apopto-sekinetik nach kurzzeitiger TKI-Inkubation (s. 4.3.1, 4.3.3) erscheint die Möglichkeit einer irreversiblen Induktion von Apoptose unwahrscheinlich, da sonst zu einem frühe-ren Zeitpunkt aktivierte Caspase3 detektierbar sein müsste. Es wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass es nach dem Wash Out residuelle TKI-Aktivität gibt, die zu einer kontinuierlichen Exposition von Zellen führen und die Apoptoseinduktion erklären würde.

Ergebnisse

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Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Experimente durchgeführt, bei denen die TKI-behandelten Zellen einem konsekutiven Wash Out unterzogen wurden. Die Zellen wurden für 2 Stunden mit HD-TKI behandelt und in der Folge wurde das Zellkulturme-dium zweimal durch PBS ersetzt, bevor die Zellen zurück in TKI-freies Zellkulturmedi-um aufgenommen wurden. Diese Proben werden als „1x“ bezeichnet. Nach 2 Stunden wurden diese Zellen einem erneuten Wash Out unterzogen und im Folgenden „2x“

genannt. Dieser Schritt wurde ein drittes Mal wiederholt („3x“). Es wurde also ein Me-diumaustausch mit zeitlichem Versatz durchgeführt. Parallel wurden die Zellkultu-rüberstände (S), die bei dem jeweiligen Waschschritt gewonnen wurden auf bis zu diesem Zeitpunkt unbehandelte Zellen übertagen und entsprechend des korrespondie-renden Wash Outs als „S1“, „S2“ und „S3“ bezeichnet. Als Kontrolle dienten mit DMSO behandelte Zellen (Medium) sowie Zellen, die mit der entsprechenden TKI-Konzentration dauerbehandelt wurden (24h). Der genaue Ablauf dieser Versuche ist unter 3.3.2.3 detailliert erklärt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach Beginn der TKI-Behandlung mittels Zellzyklus-Analyse, AnnexinV-Färbung und intrazellulärer aktivier-ter Caspase3-Färbung am FACS ( s. 3.3.3.2, 3.3.3.3, 3.3.3.4)analysiert.

In Abbildung 22 ist das Ergebnis der Zellzyklus-Analyse für Ba/F3-Zellen dargestellt.

Bei Betrachtung der 1x gewaschenen Proben zeigte sich für alle TKIs, dass die Kurz-zeit-Exposition mit hohen TKI-Konzentrationen zu hohen Prozentsätzen an apoptoti-schen Zellen führt. Die Proben, die jedoch einem zweiten Wash Out unterzogen wur-den, wiesen einen deutlich geringeren Anteil an apoptotischen Zellen auf. Zellen die mit Imatinib, Dasatinib oder Midostaurin behandelt wurden zeigten nach dem zweiten Wash Out (2x) Apoptoseraten, die vergleichbar waren mit denen unbehandelter Zel-len. Dies entsprach einer Reduktion der Apoptose um mehr als 70 Prozent. Dieser Trend setzt sich bei allen TKI behandelten Zellen nach dem dritten Wash Out (3x) wei-ter fort. In den unwei-tersuchten Proben konnten kaum noch apoptotische Zellen detektiert werden. Lediglich Zellen, die mit Nilotinib oder Jak Inhibitor I behandelt wurden, zeig-ten nach dem zweizeig-ten Wash Out (2x) noch deutlich erhöhte Apoptoseraten, welche sich durch einen dritten Waschschritt verringern ließen. Jedoch blieb hier der Anteil apoptotischer Zellen auch nach dem dreimaligem Wash Out im Vergleich zu unbe-handelten Zellen deutlich erhöht.

Ergebnisse

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Abbildung 22: Repetitives Wash Out rettet Onkogen-transformierte Zellen vor der Apoptoseinduktion nach Kurzzeit-Inkubation mit HD-TKI.

Es wurden 5x10⁴ Zellen pro ml für 2 Stunden mit TKI behandelt und zum Entfernen der TKIs gewaschen.

Dabei wurde das Medium zweimal durch PBS im gleichen Volumen ersetzt. Nach dem Wash Out wurden die Zellen in TKI-freies Medium zurückgesetzt (1x). Nach 2 Stunden wurden diese Zellen erneut einer Waschprozedur unterzogen (2x). Dies wurde ein drittes Mal wiederholt (3x). Vor jedem Wash Out wurden die Zellkulturüberstände der behandelten Proben auf zuvor unbehandelte Proben übertragen und ent-sprechend benannt: S1, S2, S3. Die Proben wurden 24 Stunden nach Versuchsbeginn mittels Propidi-umiodid-Färbung im FACS ausgewertet. (A) Ergebnis von Ba/F3-BCR-ABL Zellen nach Behandlung mit entweder Imatinib, Dasatinib oder Nilotinib. (B) Ergebnis der Behandlung von Ba/F3-FLT3-ITD Zellen mit Midostaurin und von Ba/F3-JAK2V617F Zellen mit Jak Inhibitor I. Die Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz der Zellen in der subG1-Phase des Zellzykluses. Es ist der Mittelwert von mindestens drei Messungen + SEM.

Ergebnisse

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Die Betrachtung der Proben nach Übertragung von Zellkulturüberstand machte deut-lich, dass nach Inkubation mit S1 hohe Anteile an apoptotischen Zellen detektiert wer-den konnten. Dies war erwartet, da es sich bei S1 um wer-den Zellkulturüberstand handelt, der direkt mit TKI versetzt wurde. Viel bedeutender war daher die Tatsache, dass Zel-len, die mit dem Überstand der 1x gewaschenen Zellen (S2) behandelt wurden, hohe Apoptoseraten zeigen. Besonders die Proben S2 von vormals Imatinib, Nilotinib, Mi-dostaurin und Jak Inhibitor I behandelten Zellen zeigten hohe Anteile an apoptotischen Zellen. Der Übertrag von Medium vor dem dritten Wash Out auf unbehandelte Zellen, resultierte nur noch bei Nilotinib und Jak Inhibitor I behandelten Zellen in der Induktion von Apoptose. Bei den übrigen Proben wurden nur die Prozentsätze der Grund-apoptose erreicht. Die Ergebnisse des Mediumübertrags deuten darauf hin, dass resi-duelle TKI-Konzentrationen nach dem Mediumaustausch vorhanden sein müssen, da S2 in unbehandelten Zellen Apoptose auslöst, obwohl das Medium zu keinem Zeit-punkt mit TKI versetzt wurde. Die einzige Möglichkeit zur TKI-Übertragung in dieses Medium bieten die vormals TKI-behandelten Zellen. Es wäre jedoch möglich, dass der TKI in vormals behandelten Zellen retiniert wurde und in der Zeit nach dem Wash Out ins Medium abgegeben wurde. Die genaue Ursache für das Vorhandensein von rele-vanten TKI-Konzentrationen in S2 blieb nach diesen Versuchen unklar.

Zusammenfassend konnte mit diesen repetitiven Wasch Out Versuchen gezeigt wer-den, dass in Zellen nach Kurzzeit-Exposition mit HD-TKI Apoptose nicht irreversibel ausgelöst wurde, sondern vielmehr Apoptose durch konsekutives Wash Out verhindert werden konnte. Dies untermauert die vorherigen Daten (s. 4.3.3, 4.4.2), da nun deut-lich gezeigt werden konnte, dass die Zellen durch Kurzzeit-Exposition mit HD-TKI nicht irreversibel geschädigt werden.

Die Zellzyklus-Analyse zeigte insgesamt hohe Apoptoseraten an. Zellen, die sich in dieser Phase des Zellzyklus befinden, besitzen keine intakte DNA mehr. Die Fragmen-tierung von DNA kann sowohl durch Nekrose als durch Apoptose hervorgerufen wer-den. Bei gleichem Versuchsablauf wurde daher zum Analysezeitpunkt 24 Stunden eine AnnexinV-Färbung exemplarisch für Ba/F3-BCR-ABL Zellen wie unter 3.3.3.3 beschrieben durchgeführt, was die Identifizierung von Zellen in der frühen Phase der Apoptose erlaubt. Die Ergebnisse der Färbung sind in Abbildung 23 dargestellt.

Ergebnisse

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Abbildung 23: Repetitives Wash Out rettet Ba/F3-BCR-ABL Zellen vor der Apoptoseinduktion nach Kurzzeit-Inkubation mit HD-TKI.

Insgesamt wurden 1x10⁶ Zellen in einer Konzentration von 5x10⁴ Zellen pro ml mit der entsprechenden TKI-Konzentration exponiert. Die Proben wurden behandelt und benannt wie im Text beschrieben. Die Färbung der Proben erfolgte 24 Stunden nach Beginn des Experiments. Dargestellt ist die Intensität der AnnexinV-PE-Färbung in abiträren Einheiten gegen das Vorwärtsstreulicht (FSC). Zellen in Q2 und Q3 sind positiv für AnnexinV-PE. Die graphische Aufbereitung der Daten erfolgte mittels der FLOWJO-Software. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten.

Es zeigte sich, dass die Probe, welche nur einmal gewaschen wurde (1x) ebenso wie die Proben nach Mediumübertrag S1 und S2, stark AnnexinV positiv war. Dies korre-liert mit den hohen Anteilen an Zellen in der subG1-Phase des Zellzyklus. Die Proben 2x, 3x, und S3 wiesen jedoch nur eine geringe Population an AnnexinV positiven Zel-len auf. Insgesamt kann gesagt werden, dass die vorangegangenen Ergebnisse der Zellzyklus-Analysen mit denen der AnnexinV-Färbung korrelieren.

Ergebnisse

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Zusätzlich zur AnnexinV-Färbung wurde in einem weiteren Ansatz eine intrazelluläre Färbung gegen aktivierte Caspase3 exemplarisch für Ba/F3-BCR-ABL Zellen durchge-führt. Die Spaltung der Procaspase3 zur aktiven Caspase3 ist ein früher messbarer Indikator für die Induktion von Apoptose in Zellen. Der Ablauf der Färbung ist unter 3.3.3.4 erklärt. Das Ergebnis ist in Abbildung 24 dargestellt.

Abbildung 24: Repetitives Wash Out schützt Ba/F3-BCR-ABL Zellen vor der Ak-tivierung von Caspase3.

Insgesamt wurden 1x10⁶ Zellen in einer Konzentration von 5x10⁴ Zellen pro ml mit der entsprechenden TKI-Konzentration exponiert. Die Proben wurden behandelt wie im Text beschrieben. Die Färbung der Proben erfolgte 24 Stunden nach Beginn des Experiments. Dargestellt ist die Intensität der aktivierten Caspase3-Alexa488 Färbung in abiträren Einheiten gegen das Vorwärtsstreulicht (FSC). In den Quadran-ten Q2 und Q3 befinden sich die aktivierQuadran-ten Caspase3-Alexa488 positiven Zellen. Die graphische Aufbe-reitung der Daten erfolgte mittels der FLOWJO-Software. Es wurde ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Wiederholungen zur Darstellung ausgewählt.

Ergebnisse

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Eine deutlich verstärkte Spaltung von der Procaspase3 in die aktive Caspase3 im Vergleich zur Medium-Kontrolle konnte in den Proben 1x, S1 und S2 sowie in der dauerbehandelten Kontrolle detektiert werden, was vergleichbar war mit dem Vorhan-densein von Zellen in der subG1-Phase des Zellzyklus. Die Proben 2x, 3x und S3 zeigten eine deutliche Reduktion der Zellpopulation, in denen die aktive Caspase3 vorliegt. Diese Ergebnisse korrelieren sowohl mit der AnnexinV-Färbung als auch mit den Messungen des Zellzyklus.

Sowohl die AnnexinV- als die aktivierte Caspase3-Färbung konnten zeigen, dass die Zellen durch repetitives Wash Out tatsächlich vor kontrolliert ablaufender Apoptose gerettet werden können. Darüber hinaus konnten die Ergebnisse der Zellzyklus-Analyse bestätigt werden, was beweist, dass die Zellzyklus-Zellzyklus-Analyse ein valider, einfa-cher und kostengünstiger Assay zur Detektion von Apoptose ist.

Um die Relevanz der Daten des repetitiven Wash Outs für das humane System zu überprüfen, sollten in der Folge humane Zelllinien untersucht werden. Dazu wurden BCR-ABL positive K562 Zellen und FLT3-ITD positive MV4-11 Zellen mit den entspre-chenden TKIs behandelt und durchliefen die gleichen Waschschritte wie oben be-schrieben. Die Analyse der Probe erfolgte aufgrund der erhobenen Vergleichsdaten mittels Zellzyklus-Analyse. Das Ergebnis ist in Abbildung 25 zusammengestellt.

In den humanen Zelllinien ergab sich ein vergleichbares Ergebnis wie in den murinen Ba/F3-Zellen. Nach dem einmaligen Wash Out konnten hohe Level an apoptotischen Zellen gemessen werden. Die Apoptoserate wurde nach Durchführung eines zweiten Wash Outs um 80% bei Imatinib behandelten K562 Zellen reduziert, um 70% bei Dasatinib behandelten K562 Zellen sowie um 55% bei Midostaurin behandelten MV4-11 Zellen. Der Übertrag des Inkubationsmediums S1 und S2 löste in vormals unbe-handelten Zellen Apoptose aus. Die Ergebnisse des humanen Systems konnten somit mit denen des murinen Systems verglichen werden, wobei erwähnt werden sollte, dass die subG1-Raten der Proben 1x, S1, S2 und 24 Stunden im murinen Ba/F3-System höher waren.

Ergebnisse

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Abbildung 25: Repetitives Wash Out rettet humane Onkogen-mutierte Zellen vor Apoptoseinduktion nach Kurzzeit-Inkubation mit HD-TKI.

Es wurden 5x10⁴ K562/ MV4-11 Zellen pro ml für 2 Stunden mit der entsprechenden TKI-Konzentration behandelt und zum Entfernen der Inhibitoren gewaschen. Dabei wurde das Medium zweimal durch PBS im gleichen Volumen ersetzt. Nach dem Wash Out wurden die Zellen in TKI-freies Medium zurückgesetzt (1x). Nach 2 Stunden wurden diese Zellen erneut einer Waschprozedur unterzogen und erneut in TKI-freies Medium überführt (2x). Dies wurde ein drittes Mal wiederholt (3x). Vor jedem Wash Out wurden die Zellkulturüberstände der behandelten Proben auf zuvor unbehandelte Proben übertragen und entspre-chend benannt: S1, S2, S3. Die Proben wurden 24 Stunden nach Beginn mittels Propidiumiodid-Färbung im FACS analysiert. Die Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz der Zellen in der subG1-Phase. Es ist der Mittelwert von mindestens drei Messungen + SEM abgebildet.